Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Festlegung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker für kleine Darmverletzungen und kompensatorische Hyperproliferation unter Verwendung eines Modells der chemotherapieinduzierten Schleimhautitis vor. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker und mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkte.
Abstract
Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm durch ein Trauma verloren geht. Die adaptiven Reaktionen, wie die Proliferation von Kryptazellen und die erhöhte Nährstoffaufnahme, sind entscheidend für die Erholung, aber schlecht verstanden. Das Verständnis des molekularen Mechanismus hinter den adaptiven Reaktionen ist von entscheidender Bedeutung, um die Identifizierung von Nährstoffen oder Medikamenten zu erleichtern, um die Anpassung zu verbessern. Verschiedene Ansätze und Modelle wurden in der gesamten Literatur beschrieben, aber eine detaillierte beschreibende Möglichkeit, die Verfahren im Wesentlichen durchzuführen, ist erforderlich, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Hier beschreiben wir eine Methode zur Schätzung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker kleiner Darmverletzungen und kompensatorischer Hyperproliferation mit einem Modell der Chemotherapie-induzierten Schleimhautise bei Mäusen. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker sowie mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkt. Einige der kritischen Schritte innerhalb der beschriebenen Methode sind die Entfernung und Das Wiegen des Dünndarms und das recht komplexe Softwaresystem, das für die Messung dieser Technik vorgeschlagen wird. Diese Methoden haben die Vorteile, dass sie nicht zeitaufwändig sind, und dass sie kostengünstig und einfach durchzuführen und zu messen sind.
Introduction
Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm aufgrund von Krankheit oder Operation verloren geht1,2. Nach einem Trauma erfährt der Darm eine morphometrische und funktionelle adaptive Reaktion, die durch Dieproliferation von Kryptazellen und erhöhte Nährstoffaufnahme gekennzeichnet ist3. Dieser Schritt ist entscheidend für die Wiederherstellung, aber schlecht verstanden. Experimentelle Studien der darmadaptiven Reaktion konzentrierten sich auf die Veränderungen, die nach der kleinen Darmresektion bei Mäusen, Ratten und Schweinen auftreten, aber das Verständnis des molekularen Mechanismus hinter der adaptiven Reaktion bei anderen Arten von Verletzungen (z. B. chemische oder bakterielle) ist entscheidend, um die Identifizierung von Nährstoffen oder Medikamenten zu erleichtern, um die Anpassung zu verbessern. Experimentell wurden verschiedene Ansätze verwendet, um den komplexen molekularen und zellulären Index der kleinen Darmpathologie zu beschreiben, einschließlich histopathologischer Bewertung und Messung des Verletzungsergebnisses. Dennoch fehlt in der Literatur eine detaillierte Beschreibung der Verfahren, die erforderlich sind, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Bei der Identifizierung von Anpassungsfaktoren wie Darmhormonen ist ein einfaches, kostengünstiges und reproduzierbares Tiermodell gerechtfertigt und hier schlagen wir vor, ein Modell der chemotherapieinduzierten Darmschleimhaut (CIM) zu verwenden.
Einer der einfachsten und sehr informativen Endpunkte sowohl der Verletzung als auch der Anpassung ist die Messung der Masse des Dünndarms (SI). Wir wissen, dass ein Kennzeichen der Schleimisis apoptose von Enterozyten, zeitabhängiger Villusatrophie und reduzierter Mitose ist. Daher ist die Untersuchung der Darmmorphologie in den präklinischen Modellen4,5von hoher Relevanz. Beim Menschen korreliert ein Rückgang des Plasmacitrullins, einem Marker funktionierender Enterozyten, mit Toxizitätswerten und Entzündungsmarkern6 zusätzlich zur Absorptionsfähigkeit7, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäure ein ausgezeichneter Biomarker Mukositis. Citrullin kann sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten gemessen werden und hat ausgezeichnete Korrelationen mit Villuslänge8, Krypta Überleben9und strahlungsinduzierte Schleimhaut10 gezeigt.
Ein großer Vorteil der Messung von Plasmacitrullin ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen von einem Tier zu sammeln. Mehrere Blutentnahmen bei Mäusen sind jedoch auf ein Gesamtblutvolumen von 6 l/g/Woche beschränkt und erfordern eine Vollnarkose. Dies schränkt leider auch den Einsatz von Citrullinmessungen bei Mäusen ein. Darüber hinaus erfordert die Messung von Citrullin eine hochleistungsstarke Flüssigkeitschromatographie11,12, was teuer und zeitaufwändig ist. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Citrullinspiegel bei Mäusen signifikant mit dem SI-Gewicht korrelieren (p < 0,001) (unveröffentlichte Daten), was Citrullin zu einer direkten Messung macht, die die Enterozytenmasse widerspiegelt. Eine Einschränkung der Messung des SI-Gewichts ist die Notwendigkeit, dass die Mäuse geopfert werden müssen und somit keine wiederholten Messungen innerhalb derselben Maus möglich sind. Dennoch bietet die Methode die Möglichkeit, eine Vielzahl anderer Gewebeanalysen durchzuführen, die auf die Forschungsfrage gerichtet sind, und diese Fakten können den zusätzlichen Einsatz von Tieren möglicherweise wettmachen. Wir empfehlen daher, das SI-Gewicht als einfachen, kostengünstigen und schnellen Biomarker für Verletzungen und Anpassung bei Mäusen zu verwenden. Um Reproduzierbarkeit und akzeptable analytische Variation zu gewährleisten, sollte der Darm sorgfältig vom Tier entfernt, mit Herzsäure gespült, geleert und getrocknet werden, bevor es wiegen kann. In diesem Artikel zeigen wir genau, wie dieses Verfahren ausgeführt wird.
Ein weiteres Kennzeichen der Schleimisitis ist der Verlust der sich ausbreitenden Zellen in den Krypten und eine kompensatorische Hyperproliferation während der regenerativen Periode3. Der Zellmarker Ki67 wurde häufig verwendet, um schnelle proliferative Zellen mittels Immunhistochemie zu bestimmen13. Obwohl Ki67 ein einfacher Marker der Proliferation ist, hat es eine Tendenz zur Ungenauigkeit, da Ki67 in allen aktiven Phasen des Zellzyklus vorhanden ist (G1, S, G2 und M)14. Eine spezifische Kennzeichnung ist für den Nachweis replizierender Zellen unerlässlich, weshalb wir in situ die Aufnahme von 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU), einem synthetischen Analogon von Thymidin, vorschlagen, da es sich weitgehend auf die Replikation von Zellen in der S-Phase15beschränkt. BrdU wird den Tieren 150 Minuten vor dem Opfern injiziert und Zellen können anschließend mit Immunhistochemie mit BrdU-spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. In diesem Methodenartikel zeigen wir, wie sie die Fläche von BrdU-Immunpositiven Zellen innerhalb einer Krypta mit einer kostenlosen Bildsoftware genau messen können.
Morphologische und funktionelle Veränderungen werden oft in 5-FU-induzierten Schleimhautmodellen untersucht, bei denen die Darmanpassung anhand der Villushöhe und der Kryptatiefe beurteilt wird. Während dieser Studie fanden wir heraus, dass während der akuten Phase der Schleimhautitis, die der Verletzungsphase entspricht, die durch BrdU-Inkorporation gemessene Proliferation nicht mit der Kryptatiefe korreliert. Im Gegensatz dazu ist die Kryptatiefe signifikant mit der Proliferation korreliert, die in der Reparaturphase der Schleimhaut, 3 bis 5 Tage nach der Induktion, beobachtet wird. Dies deutet darauf hin, dass die akute Phase der Schleimhautnichtbezis nicht allein durch die Kryptatiefe messbar ist. Wir schlagen vor, dass bei der Verwendung der Proliferation als Endpunkt in der akuten Phase der Schleimhautmäuse, BrdU-Inkorporation sollte vorzugsweise verwendet werden, aber bei der Quantifizierung Hyperproliferation in der späteren Phase während der regenerativen Phase, Krypta Tiefe ist eine vernünftige Alternative zur BrdU-Eingemeindung. Das Ziel dieser Studie war es, dieses Modell so zu beschreiben, dass es von allen Forschern sowohl auf dem Gebiet der Onkologie, aber vor allem Forschern, die nicht mit Darmverletzungsmodellen vertraut sind, verwendet werden kann.
Das beschriebene Modell kann verwendet werden, um transgene Modelle entsprechend der adaptiven Reaktion unter Verwendung von Körpergewicht, SI-Gewicht und Kryptivtiefe als Endpunkte zu phänotypieren. Als Beispiel zeigen wir hier, wie wir das Modell der 5-Fluorouracil (5-FU) induzierten Schleimhautinitis in einem zellulären Knock-out-Modell mit unzureichender L-Zell-Sekretion16verwendet haben. Glucagon-ähnliche Peptid-1 (GLP-1) und Glucagon-ähnliche Peptid-2 (GLP-2) sind Darmhormone, die von den enteroendokrinel L-Zellen als Reaktion auf die Nahrungsaufnahme17,18mitsezernt werden. GLP-2 ist anerkannt als ein wichtiger Faktor für die Darmheilung, die Regulierung der Schleimhautapoptose und die Verbesserung der Barrierefunktion des SI19,20,21,22. Basierend auf der Literatur vermuteten wir, dass endogene Hormone für die kompensatorische Hyperproliferation, die in der adaptiven Reaktion nach Verletzungen auftritt, unerlässlich sind.
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Protocol
Alle beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der dänischen Rechtsvorschriften über Tierversuche (1987) durchgeführt. Die Studien wurden mit Genehmigung der dänischen Tierversuchsinspektion (2013-15-2934-00833) und der lokalen Ethikkommission durchgeführt.
HINWEIS: Weibliche C57BL/6J-Mäuse (ca. 20 bis 25 g) wurden erhalten und untergebracht acht pro Käfig in Standard 12 h Licht, 12 h dunklen Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Standard-Chow. Die Tiere mussten sich eine Woche lang akklimatisieren, bevor die Experimente begannen.
1. Induktion von Mukositis mit 5-Fluorouracil
- Erhalten Sie 5-Fluorouracil (5-FU) in einer 50 mg/ml-Lösung.
- Wiegen und erfassen Sie das Körpergewicht der Mäuse. Berechnen Sie aus dem Körpergewicht die Menge von 5-FU für die Injektion (z. B. 400 mg/kg).
- Bereiten Sie eine 1 ml Spritze vor, die mit einer 27 G x 30 mm Nadel verbunden ist, und füllen Sie die Spritze mit der berechneten Menge von 5-FU für die Injektion.
- Beschränken Sie die Maus mit der Scruff-Methode. Um dies zu tun, greifen Sie die Basis des Schwanzes mit einer Hand und legen Sie es auf eine Zehen-Greiffläche, wie ein Drahtstangendeckel. Halten Sie beim Positionieren des Schwanzes mit einer Hand den Halssruff mit der anderen Hand.
- Positionieren Sie den Körper der Maus fest über eine Hand, indem Sie den Zeigefinger und daumenzurück so weit wie möglich ausstrecken. Legen Sie den Schwanz zwischen die Finger derselben Hand, um die Maus zu sichern.
- Während Sie die Maus in einem festen, aber sanften Griff halten, legen Sie die ventrale Seite der Maus aus und setzen Sie die Nadel in die intraperitoneale Höhle auf dem unteren rechten oder linken Quadranten des Bauches ein. Aspirieren Sie, um eine ordnungsgemäße Platzierung zu gewährleisten und injizieren Sie die 400 mg/kg 5-FU.
2. Gewebesammlung
- Anästhetisieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (100/10 mg/kg) in Salinelösung (0,9% NaCl) verdünnt. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pinch-Entzugsreflex beobachten.
HINWEIS: Die Anästhesie ist eine Nicht-Erholungsanästhesie. - Zeichnen Sie das Gewicht der anästhesierten Maus auf.
- Legen Sie die Maus in eine Supine-Position und führen Sie eine Laparotomie aus, um die Bauchhöhle freizulegen, gefolgt von einem Schnitt der Brusthöhle, um Pneumothorax einzuführen.
- Mit einer Schere opfern Sie das Tier, indem Sie das Zwerchfell aufschneiden.
- Entfernen Sie den Dünndarm. Schneiden Sie besser als der Pylorus, ziehen Sie vorsichtig den Dünndarm weg vom Kadaver, bis das Cecum erreicht ist und machen Sie einen Schnitt kurz vor dem Cecum.
- Mit Zangen das proximale Lumen vorsichtig einklemmen. Mit einer 1 ml Spritze mit einer 25 G Nadel befestigt, spülen Sie den Dünndarm mit Saline, um den Kot zu entfernen.
- Entfernen Sie die Saline vorsichtig mit chirurgischen Instrumenten aus dem Darmlumen.
- Legen Sie den Dünndarm auf sauberes Blotting-Papier, um überschüssige Kochsaline vorsichtig zu entfernen.
- Zeichnen Sie das Gewicht des gespülten Gewebes auf.
- Berechnen Sie das geleerte kleine Darmgewicht als Prozentsatz des Körpergewichts.
3. Dünndarm-Histologie
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Gewebevorbereitung
- In einer Dunstabzugshaube verwenden Sie eine Schere, um 3 cm Abschnitte des gespülten Darmgewebes von jeder Maus aus dem Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum zu schneiden und Abschnitte in 10% Formalin für 24 h bei Raumtemperatur zu fixieren.
HINWEIS: Das Fixiervolumen sollte 5-10-mal des Gewebevolumens betragen. - Übertragen Sie das fixierte Gewebe auf ein Schneidebrett.
- Mit einem Skalpell das Gewebe auf ca. 1 cm schneiden und in eine Einbettkassette übertragen.
HINWEIS: Die Kassette sollte mit der Probenkennung (ID) mit Bleistift gekennzeichnet werden. - Die Kassette in 70% Ethanol untertauchen und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C lagern.
- In einer Dunstabzugshaube verwenden Sie eine Schere, um 3 cm Abschnitte des gespülten Darmgewebes von jeder Maus aus dem Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum zu schneiden und Abschnitte in 10% Formalin für 24 h bei Raumtemperatur zu fixieren.
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Gewebeeinbettung in Paraffin
- Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie in aufsteigenden Alkohollösungen. Legen Sie die Kassette in 70% Ethanol für 1 h, gefolgt von 80% Ethanol für 1 h, 95% Ethanol für 1 h und 100% Ethanol für 1,5 h. Übertragen Sie die Kassette von 100% Ethanol auf Xylol für 1,5 h.
- Tauchen Sie die Kassette mit Paraffinwachs ein, das zwischen 58 °C erhitzt wird. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe in einer queren Ausrichtung zu positionieren und lassen Sie die Blöcke mehr als 24 h abkühlen, bis sie fest sind.
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Schneiden von Gewebe mit einem Mikrotom
- Platzblock, Gewebe nach unten auf Eis für 5 min. Mit einem Mikrotom, trimmen Sie die Paraffinblöcke mit einer Dicke von 10 bis 30 m, um die Gewebeoberfläche freizulegen.
- Schneiden Sie Die Querschnitte des Gewebeblocks zwischen 3 und 5 m, so dass Querabschnitte aus dem Zwölffingerdarm, dem Jejunum und dem Ileum entstehen.
- Paraffinband in ein Wasserbad zwischen 40 und 45 °C legen. Verwenden Sie Zangen, um die Abschnitte zu trennen.
- Verwenden Sie Mikroskopschlitten, um die Abschnitte aus dem Wasser zu holen.
- Die Dias 30 min vor der Färbung an der Luft trocknen.
HINWEIS: Für die Lagerung über einen längeren Zeitraum, lagern Sie Dias in einem Kühlschrank.
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Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Gewebe
- Legen Sie die Mikroskopdias in eine histologische Wiege. Entparaffinisieren Sie die Dias in einem Heizschrank, der 60 min bei 60 °C eingestellt ist.
HINWEIS: Rutschen direkt aus dem Kühlschrank sollten gelassen werden, um Raumtemperatur zu erreichen, bevor Sie sie in einem Heizschrank platzieren. - In der Dunstabzugshaube rehydrieren Sie das Gewebe in 3 Veränderungen eines Clearingmittels (Materialtabelle), machen 20 Dips im ersten Clearing-Agent-Glas und lassen Sie sie dann für 7-8 min in jedem der beiden zusätzlichen Clearing-Agent-Gläser stehen. Übertragen Sie die Rutschen auf absteigende Alkohollösungen, beginnen Sie mit 3 Änderungen von 99% Ethanol, gefolgt von 2 Änderungen von 96% Ethanol und 70% Ethanol. Machen Sie mindestens 20 Dips in jedem Glas. Transfer auf fließendes Wasser und lassen Sie die Rutschen für 5 min stehen.
- Tauchen Sie die Dias für 1 min in gefiltertes Meyer-Hämatoxylin ein.
- Waschen Sie die Proben in fließendem Leitungswasser für 5 min.
- Tauchen Sie Abschnitte in den Eosinfleck für 1 x 2 min ein, dann in Leitungswasser abspülen.
- Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie in aufsteigenden Alkohollösungen. Beginnen Sie mit 70% Ethanol, gefolgt von 96% Ethanol, 96% Ethanol und 4 mal 99% Ethanol. Machen Sie mindestens 20 Dips in jedem Glas, und lassen Sie die Wiege in 99% Ethanol stehen, bis sie montiert sind.
- Montieren Sie Abdeckungen, indem Sie eine kleine Menge des Montagemediums auf die Oberfläche der Dias auftragen. Setzen Sie den Coverslip auf das Montagemedium, ohne Blasen unter dem Deckschein zu erzeugen. Lassen Sie es für 24 h trocknen.
- Untersuchen Sie das Gewebe mit einem Lichtmikroskop, das mit einer Kamera verbunden ist, um histologische Fotos zu erhalten. Verwenden Sie ein 10-faches Ziel, um Schnappschüsse zu machen, bis eine vollständige Abdeckung des Gewebeschlittens erreicht ist.
- Legen Sie die Mikroskopdias in eine histologische Wiege. Entparaffinisieren Sie die Dias in einem Heizschrank, der 60 min bei 60 °C eingestellt ist.
4. Messung der Kryptatiefe und/oder Villushöhe
- Laden Sie die Analysesoftware herunter und installieren Sie sie (z. B. Zen Lite, Tabelle der Materialien).
- Öffnen Sie das Bild in der Software, und stellen Sie eine Verbindung zur Kamera her. Nehmen Sie Schnappschüsse im Kameramodus mit 20x Objektiv auf.
- Öffnen Sie im Verarbeitungsmodus den Snapshot.
- Um die Tiefe der Krypta zu messen: Wählen Sie in der 2D-Ansichtdas Linienwerkzeug aus der Grafik-Registerkarte. Wählen Sie eine gut orientierte Krypta aus und starten Sie die Zeile am unteren Rand eines Villus und beenden Sie am unteren Rand der Krypta. Wiederholen Sie diese Aktion für 20 gut orientierte Krypten (Ergänzende Abbildung 1).
- Um die Villushöhe zu messen: Wählen Sie in der 2D-Ansichtdas Linienwerkzeug aus der Grafik-Registerkarte aus. Wählen Sie einen gut orientierten Villus aus und starten Sie die Linie am Ende der Luminalprojektion und beenden Sie am Anfang der Krypta. Wiederholen Sie diese Aktion für 20 gut orientierte Zotten (Ergänzende Abbildung 1).
- Wechseln Sie von der 2D-Ansicht zur Measure-Ansicht, um die Messungen anzuzeigen.
- Exportieren Sie die Messungen und berechnen Sie den Durchschnitt der Kryptatiefe und Villushöhe.
5. BrdU-Quantifizierung (Proliferation) durch Immunhistochemie
- Injektion der BrdU-Lösung
- Wiegen und erfassen Sie das Körpergewicht der Mäuse.
- In einer Dunstabzugshaube eine repräsentative Menge von 0,5% w/v Bromodeoxyuridin (BrdU) Lösung in Phosphat gepufferter Salzsäure (PBS) zubereiten.
- In die Rauchhaube, injizieren 50 mg/kg BrdU durch intraperitoneale Injektion.
ANMERKUNG: Um sicherzustellen, dass jede Maus bei genau 150 min nach brdU-Injektion eingeschläfert wird, injizieren Sie jede einzelne Maus nacheinander mit einem Intervall von 10 bis 20 min dazwischen, um die Gewebeentnahme ordnungsgemäß durchzuführen. - Zeichnen Sie die Zeit der Injektion auf.
- Warten Sie 150 min, dann beasthetisieren Mäuse und sammeln Sie das Gewebe, wie in den Schritten 2.1-2.7 beschrieben. BrdU-Immunhistochemie wie in Abschnitt 5.2 beschrieben durchführen.
- BrdU-Immunhistochemie
- Bereiten Sie das Gewebe wie in den Schritten 3.1.1-3.3.4 beschrieben vor.
- Für die Antigenabrufung eine Dia-Wiege mit den Abschnitten in ein Glas-Histologieglas legen und mit dem EDTA-Puffer (pH 9) in einem Mikrowellenherd für 1 min bei 750 W füllen, gefolgt von 9 min bei 350 W. Wiederholungszyklus.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe nicht austrocknet, was erforderlich sein könnte, um den Gläsern zwischen dem Erhitzen mehr Puffer hinzuzufügen. - Waschen Sie Abschnitte 2-3 mal in Tris-gepufferter Salin und Polysorbat 20 (TBS-T) Puffer für jeweils 3 min.
- Tragen Sie 5 Tropfen Peroxidblock (Materialtabelle) für 10-15 min bei Raumtemperatur auf, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren. Waschen Sie Abschnitte 2-3 mal im TBS-T-Puffer für jeweils 3 min.
- Tragen Sie 5 Tropfen Nagetierblockpuffer (Tabelle der Materialien) für 30 min bei Raumtemperatur auf, um unspezifische Bindung zu blockieren. Waschen Sie Abschnitte 2-3 mal im TBS-T-Puffer für jeweils 3 min.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit einem monoklonalen Maus-Anti-BrdU-Antikörper, der 1:500 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird. Waschen Sie Abschnitte 2-3 mal im TBS-T-Puffer für jeweils 3 min.
- Visualisieren Sie die Immunpositivität mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) durch Anwendung von 5 Tropfen Meerrettichperoxidase auf jeden Schlitten und inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Abschnitte auf eine Dunstabzugshaube, fügen Sie 150 L DAB hinzu und brüten Sie für 5 min.
HINWEIS: Tragen Sie bei der Handhabung von DAB immer Handschuhe und entsorgen Sie Abfälle entsprechend. - Spülen Sie Abschnitte in entionisiertem Wasser.
- Dehydrieren Sie das Gewebe und montieren Sie einen Deckelschlupf, wie in den Schritten 3.4.6 und 3.4.7 beschrieben.
- Visualisierung der Immunreaktionen
- Visualisieren Sie die Gewebeprobe mit einem Lichtmikroskop, das mit einer Kamera verbunden ist.
- Verwenden Sie die Analysesoftware, um Mikroskopbilder mit einem 20-fachen Objektiv aller Abschnitte zu erhalten und Dateien im zu speichern. JPG-Format.
- Erstellen Sie eine Momentaufnahme eines Bühnenmikrometers mit einem 20-fachen Objektiv, das als Kalibrierwerkzeug in der ImageJ-Software verwendet wird.
- Messung der Fläche von BrdU-Immunreaktiven Zellen
- Installieren Sie ImageJ-Software (Tabelle der Materialien).
- Zuweisen einer Skalierung zu einem Bild in ImageJ: Öffnen Sie das Bühnenmikrometerbild mit der ImageJ-Datei | Öffnen Sie den Menübefehl. Wählen Sie das gerade Auswahlwerkzeug aus.
- Wählen Sie das gerade Werkzeug aus, und zeichnen Sie eine gerade Linie auf dem Mikrometerbild, um eine bekannte Entfernung zu definieren.
- Wählen Sie Skalierung im Menü Analysieren aus.
- Geben Sie einen Wert in das Feld Bekannte Entfernung ein, und definieren Sie die Längeneinheit im Feld Längeneinheit. Wählen Sie Global aus, damit diese Kalibrierung für alle Bilder gilt, die in dieser ImageJ-Sitzung geöffnet werden.
- Öffnen Sie ein von Interesse sinddes Bild mit der ImageJ-Datei | Öffnen Sie den Menübefehl, um den Bereich der immunreaktiven BrdU-Zellen pro Krypta zu messen.
- Legen Sie die Farbgrafiken unter dem Menü Bild/Typ auf 8 Bit fest.
- Erhöhen Sie den Kontrast des Bildes unter Prozess/Verbessern des Kontrasts, und legen Sie die gesättigten Pixel auf 0,4 % fest.
- Wenden Sie einen Schwellenwert auf das Bild an, um die Immunpositivität zu segmentieren. Wählen Sie Bild/Anpassen unter Menü, dann Schwellenwert und wählen Sie die Farbe Rot (dunkler Bereich in rot angezeigt). Wählen Sie einen Schwellenwert von etwa 10 bis 20 %, indem Sie den Schwellenwertbalken verschieben.
HINWEIS: Wählen Sie einen Schwellenwert aus, der alle BrdU-positiven Zellen mit so wenig Hintergrund wie möglich enthält. Der gewählte Prozentsatz sollte für alle Abschnitte gelten. - Wählen Sie eine gut orientierte Krypta, d.h. eine komplette Krypta aus intaktem Gewebe, und wählen Sie das freie Handauswahlwerkzeug, um den Bereich um sie herum zu markieren.
- Um den Schwellenwertbereich zu messen, wählen Sie die Registerkarte Analysieren, gefolgt von Analysepartikel. Legen Sie im Partikelfenster Analysieren Größe auf 20-unendlichfest, klicken Sie auf die Feldpixeleinheiten, legen Sie die Zirkularität auf 0,00 x 1,00fest, und legen Sie Auf Gliederung anzeigenfest. Klicken Sie auf Felder Ergebnisse anzeigen, Zusammenfassenund Bohrungen einschließen.
HINWEIS: Die Werte für BrdU-positive Zellen werden automatisch in einem Ergebnisfenster generiert, in dem die einzelnen Messungen für jede BrdU-Positivezelle angezeigt werden. Darüber hinaus wird automatisch ein Zusammenfassungsfenster generiert, das die Anzahl der Zählungen, die Gesamtfläche, die durchschnittliche Größe und den Prozentsatz der Fläche mit BrdU-positiven Zellen anzeigt. - Wiederholen Sie die Schritte 5.4.10 und 5.4.11, um eine neue Krypta zu messen. Die Ergebnisse aller gemessenen Krypten werden im Zusammenfassungsfenster angezeigt.
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Representative Results
Im ersten Experiment induzierten wir an Tag 0 eine Schleimhautise bei Mäusen und opferten jeden Tag fünf aufeinanderfolgende Tage lang eine Gruppe von Mäusen. Bei der Messung des SI-Gewichts stellten wir fest, dass dieser Parameter von Tag 2 bis Tag 4 abnahm, was auf einen Verlust der Enterozytenmasse hindeutet. Wir stellten außerdem fest, dass sich das SI-Gewicht an Tag 5 nicht wesentlich von Tag 0 (unbehandelte Mäuse) unterscheidet (Abbildung 1). Die durch die Aufnahme von BrdU gemessene Proliferation wurde am ersten tag und am zweiten Tag fast abgeschafft, aber an Tag 4 und Tag 5 gab es etwa das Vierfache bzw. Das Fünffache der Proliferation (Abbildung2). Diese Hyperproliferation wurde auch bei der Messung der Kryptatiefe veranschaulicht (Abbildung 3). Was nicht durch die Messung der Kryptatiefe veranschaulicht wird, ist der Verlust in sich ausbreitenden Zellen an Tag 1 und Tag 2, wo die Kryptatiefe um etwa 13% reduziert wurde, sich aber nicht signifikant von den gesunden Mäusen unterscheidet. Wir konnten zeigen, dass in der regenerativen Phase der Schleimhautitis eine starke Korrelation zwischen BrdU-Einarbeitung und Kryptatiefe bestand, aber dies zählte nicht für die akute Phase, die darauf hindeutet, dass die Kryptatiefe als Endpunkt in der akuten Phase der Schleimhaut (Abbildung 4).
In der zweiten Studie untersuchten wir Mucostis in unserem transgenen Mausmodell mit unzureichender L-Zellsekretion. Mäuse mit einem mangelhaften GLP-1 und GLP-2 zeigten einen starken Verlust des Körpergewichts (BW) und eine Abnahme des SI-Gewichts in der Erholungsphase, die im Vergleich zum Wildtyp (WT) 5-FU-Mäuse (p < 0,01) (Abbildung5A,B) sehr signifikant war. Außerdem zeigten die transgenen Mäuse keine kompensatorische Hyperproliferation; Krypten waren deutlich kürzer als bei WT-Mäusen und gesunden Kontrollen. Im Gegensatz dazu zeigten die WT-Mäuse eine Erhöhung der Kryptatiefe als Zeichen der Hyperproliferation (Abbildung 5C).
Abbildung 1: Kleines Darmgewicht. Mäuse wurden 1 bis 5 Tage nach 5-FU-Injektion an Tag 0 geopfert und das Darmgewicht wurde wie beschrieben gemessen. Die Ergebnisse werden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angezeigt. n = 13. Diese Zahl wurde von Hytting-Andreasen et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: BrdU-Immunpositivzellen pro Krypta für Das Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum des SI. Mäuse wurden 1 bis 5 Tage nach der 5-FU-Injektion an Tag 0 geopfert und die BrdU-Inkorporation wurde durch die beschriebene Immunhistochemie quantifiziert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert angezeigt. n = 13. *p < 0.05, ***p < 0.001 im Vergleich zu Tag 0 (Varianzanalyse [ANOVA] gefolgt von Dunnett Multiple Comparison Test). p < 0.001 im Vergleich zu Tag 0 (ANOVA gefolgt von Dunnett Mehrfachvergleichstest). Diese Zahl wurde von Hytting-Andreasen et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung der Kryptotiefe. Mäuse wurden 1 bis 5 Tage nach 5-FU-Injektion an Tag 0 geopfert und die Kryptatiefe wurde wie beschrieben gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert angezeigt. n = 13. *p < 0.05, ***p < 0.001 im Vergleich zu Tag 0 (ANOVA gefolgt von Dunnett Mehrfachvergleichstest). Diese Zahl wurde von Hytting-Andreasen et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Korrelation von Kryptotiefe und BrdU. Die Kryptatiefe (in Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum) korreliert mit der BrdU-Einarbeitung an jedem Tag des Opfers mit einem zweischwänzigen Pearson-Korrelationstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: GLP-1 und GLP-2-Mäuse regenerieren sich nach akuter Mukositis nicht. (A) Veränderung in BW (%), (B) SI-Gewicht (g) und (C) Kryptatiefe in Ileum (m). Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt. Tg = transgene Mäuse; WT = Wildtyp Mäuse; 5-FU = 5-Fluorouracil. n = 4 x 8. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 im Vergleich zu gesunder Kontrolle (WT-Saline), a = p < 0,05, aa = p < 0,01, aaa = p < 0,001 im Vergleich zu WT 5-FU (zweiwegaNOVA gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstest [BW] oder ANOVAnett auf dem Prüfstand). Diese Zahl wurde von Hytting-Andreasen et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Kleines Darmgewebe vor der Induktion der Schleimhaut, während der akuten Phase und der Erholungsphase der Schleimhaut. (A) Haemotoxylin und Eosin (H&E) Färbung und (D) BrdU Färbung bei unbehandelten Mäusen. Die schwarz gepunktete Linie im Panel A ist ein Beispiel für eine gut orientierte Krypta, während die gepunktete grüne Linie einen gut orientierten Villus zeigt. (B) H&E-Färbung und (E) BrdU-Färbung während der akuten Phase der Schleimhautbefleckung. (C) H&E-Färbung und (F) BrdU-Färbung während der Erholungsphase nach der Induktion von Schleimhaut. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methode zur Untersuchung von SI-Verletzungen und Regeneration in einem Mausmodell. Es gibt eine Vielzahl präklinischer Tiermodelle für Darmverletzungen, aber es ist wichtig, dass wir verstehen, dass jedes Modell einzigartig ist und dass die Endpunkte geeignet sein müssen, um die Forschungsfrage zu beantworten. Dieses Modell eignet sich hervorragend, um das adaptive Ansprechen auf Verletzungen zu untersuchen, aber die Endpunkte sollten geändert werden, wenn das Modell als präklinisches Modell der Schleimhautitis verwendet wird. Die Übersetzung von Tiermodellen auf Patienten ist jedoch eine Herausforderung23. Unsere vorgeschlagenen Endpunkte von SI-Gewicht und Proliferation sollten sich auf die Untersuchung des adaptiven Ansprechens beschränken. Die Untersuchung endogener Faktoren erfordert oft die Verwendung von transgenen Mäusen, und selbst wenn eine kleine Darmresektion bei Mäusen1möglich ist, könnte dieses Modell eine Alternative sein, um die postoperative Sterblichkeit zu vermeiden. Bei der Anwendung dieses Modells auf transgene Mäuse ist es wichtig, die Mäuse sorgfältig zu beobachten und ihr Gewicht jeden Tag zu überwachen. Während dieser Studie, einige der Mäuse erlebt einen Gewichtsverlust von bis zu 30%, was ziemlich erheblich ist. Um eine hohe Sterblichkeit bei empfindlichen Phänotypen zu vermeiden, empfehlen wir, Pilotstudien an transgenen Mäusen durchzuführen, da eine Dosisanpassung erforderlich sein könnte.
Ein kritischer Schritt innerhalb der beschriebenen Methode ist das Entfernen und Wiegen des SI. Es ist wichtig, dass die Entfernung und Handhabung in der gleichen Weise und durch den gleichen Forscher jedes Mal durchgeführt werden, um große Inter-Assay-Variationen zu vermeiden.
Die Konsistenz der Krypta- und Villusauswahl ist wichtig, um Abweichungen und Verzerrungen bei der Messung der Kryptatiefe und Der Villushöhe zu vermeiden. Beim Einbetten des Gewebes in Paraffin werden die Eingeweide in einer aufrechten Position positioniert, um Querschnitte zu machen, wodurch die Möglichkeit für intakte Zotten und Krypten erhöht wird. Nach dem Schneiden des Gewebes wird eine gut orientierte Krypta und/oder ein Villus ausgewählt. Die Auswahl basiert auf der vollständigen Visualisierung der gesamten Krypta und des Villus in der gleichen Ebene und dem Vorhandensein klarer Grenzen von Zellen innerhalb der Krypta und des Villus. Eine Einschränkung dieser Methode ist der etwas subjektive Ansatz bei der Auswahl einer gut orientierten Krypta, da die Auswahl einer gut orientierten Krypta und/oder Zotten nach dem Schneiden des Gewebes erfolgt. Eine frühere Studie24 hat eine alternative Methode vorgestellt, um diese Einschränkung zu überwinden, wo sie Mikrodissektion verwenden. Bei dieser Methode werden Zotten und Krypten unter dem Mikroskop ausgewählt, bevor das Gewebe geschnitten wird, wodurch sichergestellt werden kann, dass eine intakte Krypta und Zotten aus dem Gewebe seziert werden.
Im Gegensatz zu früheren Methoden, die zur Quantität von BrdU-positiven Zellen25,26verwendet werden, beschreibt dieses Protokoll den Bereich der BrdU-positiven Zellen pro Krypta, der eine schnelle Möglichkeit bietet, proliferative Zellen innerhalb jeder Krypta zu quantitieren. Diese Technik kann jedoch etwas restriktiv sein, da sie eine tiefergehende Kenntnis der Software erfordert, die für die Messung dieser Technik vorgeschlagen wird. Eine zukünftige Anwendung dieses Protokolls könnte darin bestehen, eine automatisch generierte Methode zur Quantifizierung und Messung der BrdU-positiven Zellen zu erstellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein uneingeschränktes Stipendium des Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research und der Lundbeck Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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