Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para estabelecer pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha e usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite.

Abstract

A adaptação intestinal é o mecanismo compensatório natural que ocorre quando o intestino é perdido devido ao trauma. As respostas adaptativas, como a proliferação de células criptas e o aumento da absorção de nutrientes, são críticas na recuperação, porém pouco compreendidas. Compreender o mecanismo molecular por trás das respostas adaptativas é crucial para facilitar a identificação de nutrientes ou drogas para melhorar a adaptação. Diferentes abordagens e modelos têm sido descritos em toda a literatura, mas uma forma descritiva detalhada de executar os procedimentos é necessária para obter dados reprodutíveis. Aqui, nós descrevemos um método para estimar pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida nos ratos. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha, assim como usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite. Algumas das etapas críticas dentro do método descrito são a remoção e pesagem do intestino delgado e o sistema de software bastante complexo sugerido para a mensuração desta técnica. Estes métodos têm as vantagens que não são demorados, e que eles são rentáveis e fáceis de realizar e medir.

Introduction

A adaptação intestinal é o mecanismo compensatório natural que ocorre quando o intestino é perdido devido à doença ou cirurgia1,2. Após o trauma, o intestino sofre uma resposta adaptativa morfométrica e funcional, caracterizada por proliferação de células cripta e aumento da absorção de nutrientes3. Esta etapa é crítica na recuperação, contudo mal compreendida. Os estudos experimentais da resposta adaptativa intestinal centraram-se nas mudanças que ocorrem após o resection pequeno das entranhas nos ratos, nos ratos, e nos porcos, mas em compreender o mecanismo molecular atrás da resposta adaptativa em outros tipos das lesões (por exemplo, química ou bacteriana) é crucial para facilitar a identificação de nutrientes ou drogas para melhorar a adaptação. Experimentalmente, diferentes abordagens têm sido utilizadas para descrever o complexo índice molecular e celular da patologia intestinal pequena, incluindo a pontuação histopatológica e medindo o desfecho da lesão. Apesar disso, o que está ausente da literatura é uma descrição detalhada de como realizar os procedimentos necessários para obter dados reprodutíveis. Ao identificar fatores envolvidos na adaptação, tais como hormônios intestinais, um modelo animal fácil, de baixo custo e reprodutível é justificado e aqui sugerimos o uso de um modelo de mucosite intestinal induzida por quimioterapia (CIM).

Um dos pontos finais mais simples e muito informativos de ambos os ferimentos e adaptação é medir a massa do intestino delgado (SI). Nós sabemos que uma indicação do mucosite é apoptose dos enterocytes, da atrofia tempo-dependente do vilosidades e da mitose reduzida. Portanto, o exame da morfologia intestinal é altamente relevante em modelos pré-clínicos4,5. Nos seres humanos, um declínio na citrulina plasmática, um marcador de enterócitos funcionais, correlaciona-se com os escores de toxicidade e marcadores inflamatórios6 além da capacidade absortiva7, sugerindo que este aminoácido é um excelente biomarcador de Mucosite. A citrulina pode ser medida em camundongos e ratos, e tem demonstrado excelentes correlações com o comprimento da viela8, a sobrevivência da cripta9e a mucosite induzida por radiação10.

Uma grande vantagem de medir a citrulina plasmática é a capacidade de coletar medidas repetidas de um animal. Entretanto, a amostragem múltipla do sangue nos ratos é restrita a um volume de sangue total de 6 μL/g/Week e exige o anaesthesia geral. Isso, infelizmente, também limita o uso de medições de citrulina em camundongos. Além disso, a medida da citrulina requer cromatografia líquida de alta eficiência11,12, que é dispendiosa e demorada. Recentemente, mostramos que os níveis de citrulina em camundongos correlacionam significativamente com o peso do SI (p < 0, 1) (dados não publicados), tornando a citrulina uma medida direta refletindo a massa enterócito. Uma limitação à medida do peso do SI é a necessidade para que os ratos sejam sacrificados e assim nenhumas medidas repetidas dentro do mesmo rato são possíveis. Ainda assim, o método oferece a possibilidade de realizar uma variedade de outras análises teciduais direcionadas à questão da pesquisa, e esses fatos podem, concebìvelmente, compensar o uso adicional de animais. Nós, conseqüentemente, sugerimos usar o peso do si como um biomarcador fácil, de baixo custo, e rápido do ferimento e da adaptação nos ratos. Para garantir a reprodutibilidade e a variação analítica aceitável, o intestino deve ser cuidadosamente retirado do animal, lavado com soro fisiológico, esvaziado e seco antes da pesagem. Neste artigo, mostramos exatamente como esse procedimento é executado.

Outra característica da mucosite é a perda das células proliferantes nas criptas e uma hiperproliferação compensatória durante o período regenerativo3. O marcador celular 67 tem sido freqüentemente usado para determinar células proliferativas rápidas por meio de imunohistoquímica13. Embora o 67 seja um simples marcador de proliferação, tem tendência para a imprecisão, pois o 67 está presente durante todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2 e M)14. A rotulagem específica é essencial para detectar células replicantes, razão pela qual sugerimos a incorporação in situ de 5-bromo-2 '-desoxiuridina (BrdU), um análogo sintético da timidina, pois é largamente restrito à replicação de células na S-fase15. BrdU é injetado nos animais 150 minutos antes de sacrificar e as pilhas podem subseqüentemente ser detectadas com immunohistochemistry usando anticorpos específicos de BrdU. Neste artigo do método, nós mostramos exatamente como medir a área de pilhas immunopositive de BrdU dentro de um Crypt usando um software livre da imagem.

As alterações morfológicas e funcionais são muitas vezes estudadas em modelos de mucosite induzida por 5-FU, onde a adaptação intestinal é avaliada pela altura da viela e profundidade da cripta. Durante este estudo, verificou-se que, durante a fase aguda da mucosite, que é igual à fase de lesão, a proliferação medida pela incorporação de BrdU não está correlacionada com a profundidade da cripta. Em contraste com isso, a profundidade da cripta está significativamente correlacionada com a proliferação observada na fase de reparo da mucosite, 3 a 5 dias após a indução. Isso sugere que a fase aguda da mucosite não é mensurável apenas pela profundidade da cripta. Sugerimos que, ao usar a proliferação como um EndPoint na fase aguda de camundongos mucosite, a incorporação de BrdU deve ser preferencialmente utilizada, mas ao quantificar a hiperproliferação no estágio posterior durante a fase regenerativa, a profundidade da cripta é um razoável alternativa à incorporação do BrdU. O objetivo deste estudo foi descrever esse modelo de forma que possa ser utilizado por todos os pesquisadores, tanto no campo da oncologia, mas especialmente dos pesquisadores não familiarizados com os modelos de lesão intestinal.

O modelo descrito pode ser usado para fenótipo de modelos transgênicos de acordo com a resposta adaptativa usando o peso corporal, o peso do SI e a profundidade da cripta como endpoints. Como exemplo, mostramos aqui como utilizamos o modelo de mucosite induzida por 5-fluorouracil (5-FU) em um modelo de knock out celular com secreção insuficiente de células L16. Glucagon-como o peptide-1 (GLP-1) e glucagon-como o peptide-2 (GLP-2) são os hormônios intestinais cosecretados das L-pilhas enteroendócrinas em resposta à entrada de alimento17,18. O GLP-2 é reconhecido como um fator importante para a cicatrização intestinal, a regulação da apoptose da mucosa e a melhora da função barreira do si19,20,21,22. Baseado na literatura, nós supor que os hormônios endógenos são essenciais para a hiperproliferação compensatória que ocorre na resposta adaptativa após ferimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os métodos descritos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da legislação dinamarquesa que regem a experimentação animal (1987). Os estudos foram realizados com a permissão da Inspetoria de experimentos com animais dinamarqueses (2013-15-2934-00833) e do Comitê de ética local.

Nota: camundongos fêmeas C57BL/6J (~ 20 − 25 g) foram obtidos e alojados oito por gaiola na luz padrão 12 h, ciclo escuro de 12 h com acesso livre à água e ração padrão. Os animais foram deixados para aclimatizar durante uma semana antes do início das experiências.

1. indução de mucosite usando 5-fluorouracil

  1. Obter 5-fluorouracil (5-FU) numa solução de 50 mg/mL.
  2. Pesar e gravar o peso corporal dos ratos. A partir do peso corporal, calcule a quantidade de 5-FU para injeção (por exemplo, 400 mg/kg).
  3. Prepare uma seringa de 1 mL conectada a uma agulha de 27 G x 30 milímetros e encha a seringa com a quantidade calculada de 5-FU para a injeção.
  4. Contenha o rato pelo método do scruff. Para fazer isso, pegue a base da cauda com uma mão e coloque-a em uma superfície de preensão do dedo do pé, como uma tampa da barra de arame. Ao posicionar a cauda com uma mão, segure o Scruff do pescoço com a outra mão.
  5. Posicione firmemente o corpo do rato através de uma mão estendendo o indicador e o polegar para trás tão distante quanto possível. Coloque a cauda entre os dedos desta mesma mão para fixar o mouse.
  6. Mantendo o rato em um aperto firme mas delicado, exponha o lado ventral do rato e insira a agulha na cavidade intraperitoneal no quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen. Aspirar para garantir a colocação adequada e injetar o 400 mg/kg 5-FU.

2. coleção do tecido

  1. Anestesie o rato com uma injecção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100/10 mg/kg) diluída em solução salina (0,9% NaCl). Monitore a profundidade do anestesia observando o reflexo da retirada da pitada.
    Nota: a anestesia é uma anestesia sem recuperação.
  2. Registre o peso do mouse anestesiado.
  3. Coloc o rato em uma posição supina e realize uma laparotomia para expor a cavidade abdominal, seguida por uma incisão da cavidade de caixa para introduzir o pneumothorax.
  4. Usando tesouras, sacrifique o animal cortando o diafragma.
  5. Retire o intestino delgado. Corte superior ao piloro, retraia cuidadosamente o intestino delgado para longe da carcaça até que o cálio seja atingido e faça um corte pouco antes do cálio.
  6. Usando fórceps, aperte suavemente o lúmen proximal fechado. Usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G unida, lave o intestino delgado com soro fisiológico para remover as fezes.
  7. Retire suavemente a solução salina do lúmen intestinal com instrumentos cirúrgicos.
  8. Coloque o intestino delgado em papel blotting limpo para remover cuidadosamente o excesso de soro fisiológico.
  9. Registre o peso do tecido liberado.
  10. Calcule o peso intestinal pequeno liberado como uma porcentagem do peso corporal.

3. histologia do intestino delgado

  1. Preparação do tecido
    1. Em uma capa das emanações, use a tesoura para cortar 3 seções do cm do tecido intestinal liberado de cada rato do duodeno, do jejuno e do íleo e fixar seções no formalina de 10% para 24 h na temperatura ambiente.
      Nota: o volume do fixador deve ser de 5 − 10 vezes o volume do tecido.
    2. Transfira o tecido fixo para uma tábua de corte.
    3. Usando um bisturi, aparar o tecido para aproximadamente 1 cm e transferir para uma gaveta de incorporação.
      Nota: o cartucho deve ser rotulado com a identificação da amostra (ID) no lápis.
    4. Mergulhe a gaveta em 70% de etanol e armazene a 4 ° c até o processamento posterior.
  2. Incorporação de tecido em parafina
    1. Desidrata o tecido colocando em soluções de álcool ascendentes. Coloque a gaveta em 70% etanol por 1 h, seguido por 80% etanol para 1 h, 95% etanol para 1 h e 100% etanol para 1,5 h. Transfira o cartucho de 100% de etanol para xileno por 1,5 h.
    2. Mergulhe a gaveta com cera de parafina aquecida entre 58 − 60 ° c. Use fórceps para posicionar o tecido em uma orientação transversal e deixar os blocos para esfriar mais de 24 h até sólido.
  3. Cortando o tecido usando um micrótomo
    1. Coloque o bloco, a face do tecido para baixo no gelo por 5 minutos usando um micrótomo, apare os blocos da parafina em uma espessura de 10 − 30 μm para expor a superfície do tecido.
    2. Corte secções transversais do bloco tecidual entre 3 − 5 μm, fazendo secções transversais do duodeno, do jejuno e do íleo.
    3. Coloc a fita da parafina em um banho de água ajustado entre 40 − 45 ° c. Use fórceps para separar as seções.
    4. Use lâminas de microscópio para pegar as seções da água.
    5. Seque as lâminas durante 30 minutos antes de manchar.
      Nota: para o armazenamento durante um período de tempo mais longo, armazene os slides em uma geladeira.
  4. Coloração da hematoxilina-eosina do tecido
    1. Coloc as corrediças do microscópio em um berço da histologia. Desparaffinize as corrediças em um armário de aquecimento ajustado em 60 ° c por 60 minutos.
      Nota: as corrediças diretamente do refrigerador devem ser deixadas para alcangar a temperatura ambiente antes de coloc as em um armário de aquecimento.
    2. Na capa das emanações, rehidrate o tecido em 3 mudanças de um agente de clearing (tabela dos materiais), faça 20 mergulhos no primeiro frasco do agente do clearing e deixe-os então estar para 7 − 8 minutos em cada um dos dois frascos adicionais do agente do clearing. Transfira as lâminas para soluções de álcool descendente, comece com 3 alterações de 99% de etanol, seguidas de 2 alterações de 96% de etanol e 70% de etanol. Faça um mínimo de 20 mergulhos em cada frasco. Transfira para água corrente e deixe as lâminas se repousar por 5 min.
    3. Mergulhe as lâminas na hematoxilina de Meyer filtrada por 1 min.
    4. Lave as amostras em água corrente da torneira durante 5 min.
    5. Mergulhe as secções na mancha de eosina durante 1 − 2 min e, em seguida, enxague em água da torneira.
    6. Desidrata o tecido colocando em soluções de álcool ascendentes. Comece com 70% de etanol, seguido de 96% de etanol, 96% de etanol e 4 vezes 99% de etanol. Faça um mínimo de 20 mergulhos em cada frasco, e deixe o berço ficar em 99% etanol até que eles são montados.
    7. Monte as coberturas aplicando uma pequena quantidade do meio de montagem à superfície das lâminas. Coloque a lamínula em cima do meio de montagem sem criar bolhas a lamínula. Deixe secar por 24 h.
    8. Examine o tecido usando um microscópio de luz conectado a uma câmera para obter fotos histológicas. Use um objetivo de 10x para tirar instantâneos até que uma cobertura completa do slide de tecido seja atingida.

4. medida da profundidade da cripta e/ou altura do vilosidades

  1. Baixe e instale o software de análise (ou seja, Zen Lite, tabela de materiais).
  2. Abra a imagem no software e conecte-se à câmera. Tire instantâneos no modo de câmera com objetivo 20x.
  3. No modo de processamento, abra o snapshot.
  4. Para medir a profundidade da cripta: na vista 2D, selecione a ferramenta de linha na guia gráficos. escolha uma cripta bem orientada e comece a linha na parte inferior de uma viela e termine na parte inferior da cripta. Repita esta ação para 20 criptas bem orientadas (Figura complementar 1).
  5. Para medir a altura do vilosidades: na vista 2D, selecione a ferramenta de linha na guia gráficos. escolha uma viela bem orientada e comece a linha no final da projeção Luminal e termine no início da cripta. Repita esta ação para 20 Villi bem orientados (Figura complementar 1).
  6. Alterne da vista 2D para a vista de medida para exibir as medições.
  7. Exporte as medições e calcule a média da profundidade da cripta e da altura da vilã.

5. quantificação de BrdU (proliferação) por imunoistoquímica

  1. Injeção da solução BrdU
    1. Pesar e gravar o peso corporal dos ratos.
    2. Em uma capa de fumaça, prepare uma quantidade representativa de 0,5% w/v bromodeoxyuridine (BrdU) solução em tampão fosfato salina (PBS).
    3. Na capa de fumos, injete 50 mg/kg de BrdU por injecção intraperitoneal.
      Nota: para garantir que cada rato é eutanasiado em exatamente 150 min post injeção de BrdU, injete cada rato individual em sucessão com intervalo de 10 − 20 minutos no meio, a fim de executar corretamente a coleção de tecido.
    4. Registre o tempo de injeção.
    5. Aguarde 150 min, em seguida, anestesiar os camundongos e recolher o tecido, conforme descrito nas etapas 2.1 − 2.7. Execute o BrdU immunohistochemistry como descrito na seção 5,2.
  2. BrdU immunohistochemistry
    1. Prepare o tecido como descrito nas etapas 3.1.1 − 3.3.4.
    2. Para a recuperação do antígeno, coloc um berço da corrediça com as seções em um frasco de vidro da histologia e encha-o com o amortecedor do EDTA (pH 9) em um forno de microonda por 1 minuto em 750 W seguido por 9 minutos em 350 W. Repita o ciclo.
      Nota: Assegure-se de que o tecido não seque para fora, que pôde exigir a adição de mais tampão aos frascos entre o aquecimento.
    3. Secções de lavagem 2 − 3 vezes em solução tampão salina com tampão Tris e polissorbato 20 (TBS-T) durante 3 min cada.
    4. Aplique 5 gotas de bloco de peróxido (tabela de materiais) por 10 − 15 min à temperatura ambiente para bloquear a atividade endógena da peroxidase. Lave as secções 2 − 3 vezes no tampão TBS-T durante 3 min cada.
    5. Aplique 5 gotas de tampão do bloco do roedor (tabela dos materiais) por 30 minutos na temperatura ambiente, para obstruir a ligação não específica. Lave as secções 2 − 3 vezes no tampão TBS-T durante 3 min cada.
    6. Incubar as secções com um anticorpo monoclonal de rato anti-BrdU diluído 1:500 por 1 h à temperatura ambiente. Lave as secções 2 − 3 vezes no tampão TBS-T durante 3 min cada.
    7. Visualize a imunopositividade usando 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB) aplicando 5 gotas de peroxidase de rábano a cada slide e incubar por 15 min à temperatura ambiente. Transfira as secções para uma capa de fumos, adicione 150 μL de DAB e incubar durante 5 min.
      Nota: Utilize sempre luvas quando manusear DAB e elimine os resíduos de forma adequada.
    8. Enxaguar secções em água desionizada.
    9. Deshidratar o tecido e montar uma lamínula como descrito nas etapas 3.4.6 e 3.4.7.
  3. Visualização das imunorações
    1. Visualize a amostra de tecido com um microscópio de luz conectado a uma câmera.
    2. Use o software de análise para obter imagens de microscópio usando um objetivo 20x de todas as seções e salvar arquivos no. Formato JPG.
    3. Tire um instantâneo de um micrômetro de estágio usando um objetivo 20x, que será usado como uma ferramenta de calibração no software ImageJ.
  4. Medindo a área de células imunorreativas BrdU
    1. Instale o software ImageJ (tabela de materiais).
    2. Atribuindo escala a uma imagem no ImageJ: Abra a imagem do micrômetro de palco usando o arquivo ImageJ | Abra o comando de menu. Selecione a ferramenta de seleção de linha reta.
    3. Selecione a ferramenta reta e desenhe uma linha reta na imagem do micrômetro para definir uma distância conhecida.
    4. Selecione definir escala no menu analisar .
    5. Insira um valor na caixa distância conhecida e defina a unidade de comprimento na unidade de comprimento caixa. Selecione global para que essa calibração se aplique a todas as imagens que são abertas nesta sessão do ImageJ.
    6. Abrir uma imagem de interesse usando o arquivo ImageJ | Abra o comando de menu para medir a área das células imunoreativas BrdU por cripta.
    7. Defina os gráficos de cores como 8 bits no menu imagem/tipo .
    8. Aumente o contraste da imagem em processo/realce o contraste e ajuste os pixéis saturados a 0,4%.
    9. Aplique um limiar à imagem para segmentar a imunopositividade. Selecione imagem/ajustar em menu, em seguida, limiar e selecione a cor vermelha (área escura mostrada em vermelho). Escolha um limiar de cerca de 10 − 20% movendo a barra de limiar.
      Nota: escolha um limite que inclua todas as células positivas BrdU com o mínimo de fundo possível. A percentagem escolhida deve aplicar-se a todas as secções.
    10. Escolha uma cripta bem orientada, ou seja, uma cripta completa do tecido intacto, e selecione a ferramenta de seleção de mão livre para marcar a área em torno dele.
    11. Para medir a área de limiar, selecione a guia analisar , seguida de análise de partículas. Na janela analisar partícula , defina tamanho como 20-Infinity, clique nas unidades de pixelda caixa, defina circularidade como 0.00 − 1.00e defina Mostrar como contornos. Clique em caixas exibir resultados, resumire incluir furos.
      Observação: os valores para células positivas BrdU são gerados automaticamente em uma janela de resultado, mostrando as medições individuais para cada célula positiva BrdU. Além disso, uma janela sumária é gerada automaticamente, mostrando o número de contagens, a área total, o tamanho médio e a porcentagem da área com pilhas positivas de BrdU.
    12. Repita as etapas 5.4.10 e 5.4.11 para medir uma nova cripta. Os resultados de todas as criptas medidas serão exibidos na janela de Resumo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

No primeiro experimento, induzimos a mucosite em camundongos no dia 0 e sacrificamos um grupo de camundongos por dia durante 5 dias consecutivos. Ao medir o peso do SI, verificou-se que este parâmetro diminuiu do dia 2 até o 4º dia sugerindo uma perda na massa enterócito. Verificou-se, ainda, que no 5º dia, o peso do SI não foi significativamente diferente do dia 0 (camundongos não tratados) (Figura 1). A proliferação medida pela incorporação do BrdU foi quase abolida no dia 1 e dia 2, mas no dia 4 e dia 5 houve aumento de aproximadamente quatro vezes e cinco vezes na proliferação, respectivamente (Figura 2). Esta hiperproliferação também foi ilustrada quando se mede a profundidade da cripta (Figura 3). O que não é ilustrado pela medição da profundidade da cripta é a perda de células proliferantes no dia 1 e dia 2, onde a profundidade da cripta foi reduzida em aproximadamente 13%, mas não foi significativamente diferente dos ratos saudáveis. Pudemos demonstrar que, na fase regenerativa da mucosite, houve forte correlação entre a incorporação de BrdU e a profundidade da cripta, mas isso não contou para a fase aguda, indicando que a profundidade da cripta como um desfecho pode não ser adequada na fase aguda da mucosite (Figura 4).

No segundo estudo, nós examinamos mucostis em nosso modelo transgênicas do rato com insuficiente secretion da pilha de L. Camundongos com deficiência de GLP-1 e GLP-2 mostraram grave perda de peso corporal (PN) e diminuição do peso do SI na fase de recuperação, o que foi altamente significante em relação ao tipo selvagem (WT) camundongos 5-FU (p < 0, 1) (Figura 5a, B). Além disso, os camundongos transgênicos não mostraram hiperproliferação compensatória; as criptas eram significativamente mais curtas do que em ratos do WT e em controles saudáveis. Contrariamente a isso, os camundongos WT mostraram aumento da profundidade da cripta como sinal de hiperproliferação (Figura 5C).

Figure 1
Figura 1: peso intestinal pequeno. Os camundongos foram sacrificados 1 a 5 dias após a injeção de 5-FU no dia 0 e o peso intestinal foi medido como descrito. Os resultados são mostrados como média ± erro padrão da média (MEV). n = 13. Este número foi modificado de Hytting-Andreasen et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: células imunopositivas de BrdU por cripta para o duodeno, jejuno e íleo do si. Os camundongos foram sacrificados 1 a 5 dias após a injeção de 5-FU no dia 0 e a incorporação de BrdU foi quantificada por imuno-histoquímica conforme descrito. Os resultados são mostrados como média ± SEM. n = 13. * p < 0, 5, * * * p < 0, 1 comparado ao dia 0 (análise de variância [ANOVA] seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett). p < 0, 1 em comparação com o dia 0 (ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett). Este número foi modificado de Hytting-Andreasen et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: medição da profundidade da cripta. Os camundongos foram sacrificados 1 a 5 dias após a injeção de 5-FU no dia 0 e a profundidade da cripta foi medida conforme descrito. Os resultados são mostrados como média ± SEM. n = 13. * p < 0, 5, * * * p < 0, 1 comparado ao dia 0 (ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett). Este número foi modificado de Hytting-Andreasen et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: correlação da profundidade da cripta e do BrdU. A profundidade da cripta (no duodeno, jejuno e íleo) está correlacionada com a incorporação de BrdU em cada dia de sacrifício usando o teste de correlação de Pearson de duas caudas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: camundongos deficientes GLP-1 e GLP-2 não conseguem se regenerar após a mucosite aguda. (A) alteração em BW (%), (B) si peso (g) e (C) profundidade da cripta no íleo (μm). Os resultados são mostrados como média ± SEM. TG = camundongos transgênicos; WT = camundongos tipo selvagem; 5-FU = 5-fluorouracil. n = 4 − 8. * p < 0, 5, * * p < 0, 1, * * * p < 0, 1 em comparação com o controle saudável (WT Saline), a = p < 0, 5, AA = p < 0, 1, AAA = p < 0, 1 em relação ao WT 5-FU (ANOVA bidirecional seguida de teste de comparação múltipla de Bonferroni [BW] ou ANOVA seguida de comparações múltiplas de Dunnett no teste). Este número foi modificado de Hytting-Andreasen et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1: tecido intestinal pequeno antes da indução da mucosite, durante a fase aguda e a fase de recuperação da mucosite. (A) coloração de hemotoxilina e eosina (H & e) e (D) coloração de BrdU em camundongos não tratados. A linha pontilhada preta no painel A exemplifica uma cripta bem orientada, enquanto a linha verde pontilhada demonstra uma vilã bem orientada. (B) coloração de H & e E (e) coloração de BrdU durante a fase aguda da mucosite. (C) coloração H & e e (F) coloração BrdU durante a fase de recuperação após a indução da mucosite. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui, demonstramos um método amplamente acessível para estudar a lesão de SI e a regeneração em um modelo de mouse. Existe uma grande variedade de modelos animais pré-clínicos de lesão intestinal, mas é vital que entendemos que cada modelo é único e que os endpoints devem ser adequados para responder à pergunta de pesquisa. Este modelo é excelente para estudar a resposta adaptativa à lesão, mas os desfechos devem ser modificados quando se utiliza o modelo como modelo pré-clínico de mucosite. No entanto, a tradução de modelos animais para pacientes é desafiadora23. Nossos pontos finais sugeridos do peso e da proliferação do SI devem ser limitados ao estudo da resposta adaptável somente. O estudo de fatores endógenos geralmente requer o uso de camundongos transgênicos, e mesmo que a ressecção do intestino delgado seja possível em camundongos1, esse modelo pode ser uma alternativa para evitar a mortalidade pós-operatória. Ao aplicar este modelo para camundongos transgênicos, é importante observar os ratos com cuidado e monitorar seu peso todos os dias. Durante este estudo, alguns dos camundongos experimentaram uma perda de peso de até 30%, o que é bastante substancial. Para evitar a alta mortalidade em fenótipos sensíveis, sugerimos a realização de estudos-piloto em camundongos transgênicos, uma vez que o ajuste da dose pode ser necessário.

Um passo crítico dentro do método descrito é a remoção e pesagem do SI. É importante que a remoção e manuseio sejam realizados da mesma maneira e pelo mesmo pesquisador de cada vez para evitar grandes variações entre os ensaios.

A consistência da seleção da cripta e do vilosidades é importante evitar a variância e o viés ao medir a profundidade da cripta e a altura do vilosidades. Ao incorporar o tecido em parafina, os intestinos são posicionados em posição vertical para fazer cortes transversais, aumentando assim a possibilidade de vilosidades e criptas intactas. Após o corte do tecido, uma cripta bem orientada e/ou vilosidades é selecionada. A seleção é baseada na visualização completa de toda a cripta e vilosidades no mesmo plano e a presença de fronteiras claras de células dentro da cripta e vilosidades. Uma limitação a este método é a aproximação um tanto subjetiva ao selecionar uma cripta bem orientada desde que a seleção de uma cripta bem orientada e/ou os Villi são feitos após o corte do tecido. Um estudo anterior24 apresentou um método alternativo para superar essa limitação, onde utilizam microdissecção. Neste método, os Villi e as criptas são selecionados ao observar um microscópio, antes do tecido que está sendo cortado, assim fazendo o possível assegurar-se de que uma cripta e uns Villi intactos estejam sendo dissecados do tecido.

Em contraste com os métodos anteriores usados para a quantidade de células positivas de BrdU25,26, este protocolo descreve a área de células positivas de BrdU por cripta, que fornece uma maneira rápida de quantificar células proliferativas dentro de cada cripta. Essa técnica, entretanto, pode ser um tanto restritiva, uma vez que requer um conhecimento mais profundo do software sugerido para a mensuração dessa técnica. Uma aplicação futura deste protocolo poderia ser criar um método gerado mais automático para quantificar e medir as pilhas positivas de BrdU.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma concessão irrestrita do centro Novo Nordisk para a pesquisa metabólica básica e da Fundação de Lundbeck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Tags

Pesquisa do cancro edição 147 ferimento intestinal pequeno marcadores proliferative BrdU profundidade da cripta altura do vilosidades hiperproliferação compensatória
Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter