Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Vigtige endepunkter og proliferative markører til at vurdere små tarmskader og tilpasning ved hjælp af en muse model af kemoterapi-induceret mucositis

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at etablere vigtige endepunkter og proliferativ markører for små tarmskader og kompenserende hyperproliferation ved hjælp af en model af kemoterapi-induceret mucositis. Vi demonstrerer påvisning af prolifererende celler ved hjælp af en celle cyklus specifik markør og ved hjælp af lille tarm vægt, krypt dybde, og villus højde som endepunkter.

Abstract

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme, der opstår, når tarmen er tabt på grund af traumer. De adaptive reaktioner, såsom Crypt celle proliferation og øget næringsstof absorption, er afgørende i opsving, men dårligt forstået. Forståelse af den molekylære mekanisme bag de adaptive reaktioner er afgørende for at lette identifikationen af næringsstoffer eller lægemidler til at forbedre tilpasningen. Forskellige tilgange og modeller er blevet beskrevet i hele litteraturen, men en detaljeret beskrivende måde at hovedsagelig udføre procedurerne er nødvendig for at opnå reproducerbare data. Her beskriver vi en metode til at anslå vigtige endepunkter og proliferativ markører for små tarmskader og kompenserende hyperproliferation ved hjælp af en model af kemoterapi-induceret mucositis i mus. Vi demonstrerer påvisning af prolifererende celler ved hjælp af en celle cyklus specifik markør, samt ved hjælp af lille tarm vægt, krypt dybde, og villus højde som endepunkter. Nogle af de kritiske trin inden for den beskrevne metode er fjernelse og vejning af tyndtarmen og det temmelig komplekse software system, der foreslås til måling af denne teknik. Disse metoder har de fordele, at de ikke er tidskrævende, og at de er omkostningseffektive og lette at gennemføre og måle.

Introduction

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme, der opstår, når tarmen er tabt på grund af sygdom eller kirurgi1,2. Efter traume gennemgår tarmen en morphometrisk og funktionel adaptiv respons, karakteriseret ved krypt celle spredning og øget næringsstof absorption3. Dette trin er kritisk i Recovery, men dårligt forstået. Eksperimentelle undersøgelser af intestinal adaptiv respons har fokuseret på de ændringer, der opstår efter lille tarm resektion i mus, rotter og grise, men forstå den molekylære mekanisme bag den adaptive respons i andre former for skader (f. eks. kemisk eller bakteriel) er afgørende for at lette identifikationen af næringsstoffer eller stoffer for at forbedre tilpasningen. Eksperimentelt, forskellige tilgange er blevet brugt til at beskrive det komplekse molekylære og cellulære indeks af små tarm patologi, herunder histopatologiske scoring og måling af resultatet af skaden. På trods af dette, hvad der er fraværende fra litteraturen er en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører de procedurer, der er nødvendige for at opnå reproducerbare data. Når man identificerer faktorer involveret i tilpasning, såsom Gut hormoner, en nem, lav pris, og reproducerbare dyremodel er berettiget, og her foreslår vi at bruge en model af kemoterapi-induceret intestinal mucositis (CIM).

En af de enkleste og meget informative endepunkter for både skade og tilpasning er at måle massen af tyndtarmen (SI). Vi ved, at et kendetegn for mucositis er apoptose af enterocytter, tidsafhængig villus atrofi og reduceret mitose. Derfor er undersøgelse af intestinal morfologi yderst relevant i prækliniske modeller4,5. Hos mennesker, et fald i plasma citrullin, en markør for fungerende enterocytter, korrelerer med toksicitet scores og inflammatoriske markører6 ud over absorptionsevne7, tyder denne aminosyre er en fremragende biomarkør af Mucositis. Citrullin kan måles i både mus og rotter, og har vist fremragende korrelationer med villus længde8, Crypt overlevelse9, og stråling-induceret mucositis10.

En stor fordel ved at måle plasma citrullin er evnen til at indsamle gentagne målinger fra et dyr. Flere blodprøver i mus er dog begrænset til et samlet blodvolumen på 6 μL/g/uge og kræver generel anæstesi. Dette begrænser desværre også brugen af citrullin målinger i mus. Desuden kræver målingen af citrullin højtydende væskekromatografi11,12, hvilket er dyrt og tidskrævende. For nylig viste vi, at citrullin niveauer i mus korrelerer betydeligt med si vægt (p < 0,001) (ikke-offentliggjorte data), hvilket gør citrullin en direkte måling afspejler i masse. En begrænsning til måling af SI-vægt er nødvendigheden af, at musene ofres, og derfor er det ikke muligt at gentage målinger inden for samme mus. Stadig metoden giver mulighed for at udføre en række andre vævs analyser rettet mod forskningen spørgsmål, og disse kendsgerninger kan tænkes at gøre op for den ekstra brug af dyr. Vi foreslår derfor at bruge SI vægt som en nem, billig og hurtig biomarkør af skade og tilpasning i mus. For at sikre reproducerbarhed og acceptabel analytisk variation bør tarmene fjernes forsigtigt fra dyret, skylles med saltvand, tømmes og tørres inden vejning. I denne artikel viser vi nøjagtigt, hvordan denne procedure udføres.

Et andet kendetegn for mucositis er tabet af de prolifererende celler i krypterne og en kompenserende hyperproliferation i den regenerativ periode3. Den cellulære markør Ki67 er ofte blevet brugt til at bestemme hurtige proliferativ celler ved hjælp af immun histokemi13. Selvom Ki67 er en simpel markør for spredning, har den en tendens til upræcision, da Ki67 er til stede i alle aktive faser af cellecyklussen (G1, S, G2 og M)14. Specifik mærkning er afgørende for at detektere repliklerende celler, og derfor foreslår vi in situ inkorporering af 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), en syntetisk analog af thymidin, da den i vid udstrækning er begrænset til replicerende celler i S-fase15. BrdU injiceres i dyrene 150 minutter før ofring og celler kan efterfølgende påvises med immun histokemi ved hjælp af BrdU specifikke antistoffer. I denne metode artikel, viser vi præcis, hvordan man måler området af BrdU immunopositive celler i en krypt ved hjælp af en gratis billedsoftware.

Morfologiske og funktionelle ændringer er ofte undersøgt i 5-FU induceret mucositis modeller, hvor intestinal tilpasning er vurderet af villus højde og krypt dybde. I løbet af denne undersøgelse, vi fandt, at under den akutte fase af mucositis, som er lig med skades fasen, spredning målt ved BrdU inkorporering er ikke korreleret med Crypt dybde. I modsætning til dette, Crypt dybde er signifikant korreleret med spredning ses i reparations fasen af mucositis, 3 til 5 dage efter induktion. Dette tyder på, at den akutte fase af mucositis ikke er målbar ved krypt dybde alene. Vi foreslår, at når du bruger proliferation som endepunkt i den akutte fase af mucositis-mus, bør brdu inkorporering fortrinsvis anvendes, men når du kvantiterer hyperproliferation i det senere stadie i den regenerativ fase, er Crypt-dybden en fornuftig alternativ til BrdU inkorporering. Målet med denne undersøgelse var at beskrive denne model på en måde, at den kan bruges af alle forskere, både inden for onkologi, men især forskere, der ikke er bekendt med tarm skade modeller.

Den beskrevne model kan bruges til fænotype transgene modeller i henhold til den adaptive respons ved hjælp af kropsvægt, si vægt og krypt dybde som endepunkter. Som et eksempel viser vi her, hvordan vi brugte modellen af 5-fluorouracil (5-FU) induceret mucositis i en cellulær knock out model med utilstrækkelig L-celle sekretion16. Glucagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og Glucagon-lignende peptid-2 (GLP-2) er intestinale hormoner, der udskilles fra de enteroendokrine L-celler som reaktion på fødeindtagelse17,18. GLP-2 er anerkendt som en vigtig faktor for tarm heling, reguleringen af slimhinde apoptose og forbedring af barrierefunktionen af si19,20,21,22. Baseret på litteraturen, vi hypotese, at endogene hormoner er afgørende for kompenserende hyperproliferation forekommer i adaptive respons efter skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne metoder blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987). Undersøgelserne blev udført med tilladelse fra det danske dyreforsøg inspektorat (2013-15-2934-00833) og det lokale etiske udvalg.

Bemærk: kvindelige C57BL/6J mus (~ 20 − 25 g) blev opnået og husede otte pr. bur i standard 12 h lys, 12 h mørk cyklus med fri adgang til vand og standard Chow. Dyr blev overladt til akklimatiserer i en uge før eksperimenter begyndte.

1. induktion af mucositis ved hjælp af 5-fluorouracil

  1. Få 5-fluorouracil (5-FU) i en 50 mg/mL opløsning.
  2. Veje og registrere musene kropsvægt. Fra legemsvægten beregnes mængden af 5-FU til injektion (f. eks. 400 mg/kg).
  3. Forbered en 1 mL sprøjte tilsluttet en 27 G x 30 mm nål og fyld sprøjten med den beregnede mængde 5-FU til injektion.
  4. Hold musen tilbage med Scruff-metoden. For at gøre dette, grab bunden af halen med den ene hånd og placere den på en tå-gribende overflade, såsom en wire bar låg. Mens du placerer halen med den ene hånd, hold skruff af halsen med den anden hånd.
  5. Fast placere kroppen af musen over den ene hånd ved at udvide pegefinger og tommelfinger tilbage så langt som muligt. Placer halen mellem fingrene på denne samme hånd for at sikre musen.
  6. Mens holde musen i en fast, men blid greb, udsætte den ventrale side af musen og indsætte nålen i intraperitoneal hulrum på nederste højre eller venstre kvadrant af maven. Aspirér for at sikre korrekt placering og Injicer 400 mg/kg 5-FU.

2. vævs indsamling

  1. Bedøvelse musen med en intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (100/10 mg/kg) fortyndet i saltvandsopløsning (0,9% NaCl). Overvåge dybden af anæstesi ved at observere knivspids abstinens refleks.
    Bemærk: anæstesi er en ikke-helbredelse anæstesi.
  2. Optag vægten af den bedøvede mus.
  3. Placer musen i en liggende position og udføre en laparotomi at udsætte bughulen, efterfulgt af et snit af brysthulen for at introducere pneumothorax.
  4. Ved hjælp af en saks, ofrer dyret ved at skære åbne membranen.
  5. Fjern tyndtarmen. Skær overlegen i pylorus, træk forsigtigt tyndtarmen væk fra slagtekroppen, indtil cecum er nået, og lav et snitlige før cecum.
  6. Ved hjælp af pincet klemmer du forsigtigt det proksimale lumen lukket. Ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 25 G nål påsat, skyl tyndtarmen med saltvand for at fjerne fæser.
  7. Fjern forsigtigt saltvand fra tarm lumen med kirurgiske instrumenter.
  8. Placer tyndtarmen på ren blotting papir til forsigtigt at fjerne overskydende saltvand.
  9. Optag vægten af det rødmede væv.
  10. Beregn den rødmede lille tarm vægt som en procentdel af legemsvægten.

3. histologi i tyndtarmen

  1. Vævs præparat
    1. I en røg hætte, bruge en saks til at skære 3 cm sektioner af det skyllet tarm væv fra hver mus fra duodenum, jejunum og ileum og fikset sektioner i 10% formalin for 24 h ved stuetemperatur.
      Bemærk: fikativ volumen skal være 5 − 10 gange af vævs volumenet.
    2. Overfør det faste væv til et skærebræt.
    3. Ved hjælp af en skalpel, trim vævet til ca. 1 cm og Overfør til en indlejrings kassette.
      Bemærk: kassetten skal mærkes med prøve identifikationen (ID) i blyant.
    4. Kassetten nedsænkes i 70% ethanol og opbevares ved 4 °C indtil videre forarbejdning.
  2. Vævs indlejring i paraffin
    1. Dehydrere vævet ved at anbringe i stigende alkohol opløsninger. Anbring kassetten i 70% ethanol i 1 time, efterfulgt af 80% ethanol i 1 time, 95% ethanol for 1 time og 100% ethanol til 1,5 h. Overfør kassetten fra 100% ethanol til xylen til 1,5 h.
    2. Sænk kassetten med paraffinvoks opvarmet mellem 58 − 60 °C. Brug pincet til at placere vævet i en tværgående retning og lad blokkene køle af mere end 24 timer, indtil de er faste.
  3. Skære vævet ved hjælp af en mikrotom
    1. Placer blok, væv med forsiden nedad på isen i 5 min. Brug en mikrotom til at trimme paraffin blokkene med en tykkelse på 10 − 30 μm for at udsætte vævsoverfladen.
    2. Skær tværsnit af vævs blokken mellem 3 − 5 μm, hvilket gør tværgående sektioner fra duodenum, jejunum og ileum.
    3. Placer paraffin båndet i et vandbad, der er sat mellem 40 − 45 °C. Brug pincet til at adskille sektionerne.
    4. Brug mikroskop slides til at afhente sektioner fra vandet.
    5. Lufttørre slides i 30 min før farvning.
      Bemærk: Opbevar slides i et køleskab for at opbevare dem over en længere periode.
  4. Hematoxylin-eosin farvning af væv
    1. Placer mikroskop diasene i en histologisk vugge. Deparaffinize diasene i et varme kabinet sat til 60 °C i 60 min.
      Bemærk: slides direkte fra køleskabet bør overlades til stuetemperatur, før de anbringes i et varme kabinet.
    2. I røghætten, rehydrere vævet i 3 ændringer af en clearing agent (tabel over materialer), lav 20 dips i den første clearing agent jar og derefter lade dem stå for 7 − 8 min i hver af de to yderligere clearing agent krukker. Overfør slides til faldende alkohol løsninger, start med 3 ændringer af 99% ethanol, efterfulgt af 2 ændringer af 96% ethanol og 70% ethanol. Lav mindst 20 dips i hver krukke. Overfør til rindende vand og lad slidene stå i 5 min.
    3. Nedsænk slidene i filtreret Meyer's hematoxylinlegemer i 1 min.
    4. Prøverne vaskes i rindende ledningsvand i 5 minutter.
    5. Nedsænk sektioner i eosin-pletten i 1 − 2 min, og skyl derefter i ledningsvand.
    6. Dehydrere vævet ved at anbringe i stigende alkohol opløsninger. Start med 70% ethanol, efterfulgt af 96% ethanol, 96% ethanol, og 4 gange 99% ethanol. Lav mindst 20 dips i hver krukke, og lad holderen stå i 99% ethanol, indtil de er monteret.
    7. Monter dæksedler ved at anvende en lille mængde af monterings mediet på overfladen af diasene. Sæt dæksedlen oven på monterings mediet uden at oprette bobler under dæksedlen. Lad den tørre i 24 timer.
    8. Undersøg vævet ved hjælp af et let mikroskop forbundet til et kamera for at få histologiske fotos. Brug en 10x-målsætning til at tage snapshots, indtil en fuld dækning af vævs diaset er nået.

4. måling af krypten dybde og/eller villus højde

  1. Download og Installer Analysis software (dvs., Zen Lite, tabel over materialer).
  2. Åbn billedet i softwaren, og Opret forbindelse til kameraet. Tag Snapshots i kameratilstand med 20x mål.
  3. Åbn snapshottet i behandlingstilstand.
  4. For at måle krypten dybde: i 2D-visningenskal du vælge linje værktøjet fra fanen grafik. Vælg en velorienteret Crypt og startlinjen i bunden af en villus og Afslut i bunden af krypten. Gentag denne aktion for 20 velorienterede Krypter (supplerende figur 1).
  5. Sådan måles villus-højden: Vælg linje værktøjet i 2D-visningenunder fanen grafik. Vælg en velorienteret villus og startlinjen i slutningen af luminale projektion og Afslut ved starten af krypten. Gentag denne aktion for 20 velorienterede villi (supplerende figur 1).
  6. Skift fra 2D-visning til måle visningen for at få vist målingerne.
  7. Eksporter målingerne og Beregn gennemsnittet af krypten dybde og villus højde.

5. kvantificering af BrdU (proliferation) ved immun histokemi

  1. Injektion af BrdU-opløsningen
    1. Veje og registrere musene kropsvægt.
    2. I en røg hætte, forberede en repræsentativ mængde af 0,5% w/v bromodeoxyuridine (BrdU) opløsning i fosfat bufferet saltvand (PBS).
    3. I røgudemhætten indsprøjtes 50 mg/kg BrdU ved intraperitoneal injektion.
      Bemærk: for at sikre, at hver mus er aflives på præcis 150 min post brdu injektion, injicere hver enkelt mus i træk med 10 − 20 minutters interval i mellem for at korrekt udføre vævs samlingen.
    4. Optag Indsprøjtnings tidspunktet.
    5. Vent 150 min, og bedøvelses derefter musene, og saml vævet som beskrevet i trin 2.1 − 2.7. Udføre BrdU Immunhistokemi som beskrevet i afsnit 5,2.
  2. Brdu Immunhistokemi
    1. Forbered vævet som beskrevet i trin 3.1.1 − 3.3.4.
    2. For antigen-hentning skal du anbringe en slide holder med sektionerne i en glas histologi krukke og fylde den med EDTA-bufferen (pH 9) i en mikrobølgeovn i 1 min ved 750 W efterfulgt af 9 min ved 350 W. REPEAT-cyklus.
      Bemærk: Sørg for, at vævet ikke tørrer ud, hvilket kan kræve, at der tilføjes mere buffer til krukker mellem opvarmning.
    3. Vask sektioner 2 − 3 gange i Tris-bufferet saltvand og Polysorbat 20 (TBS-T) buffer i 3 min hver.
    4. Påfør 5 dråber peroxid blok (tabel over materialer) til 10 − 15 minutter ved stuetemperatur for at blokere endogene peroxidase aktivitet. Vask sektioner 2 − 3 gange i TBS-T buffer i 3 min. hver.
    5. Påfør 5 dråber gnaver blok buffer (tabel over materialer) i 30 minutter ved stuetemperatur, for at blokere ikke-specifik binding. Vask sektioner 2 − 3 gange i TBS-T buffer i 3 min. hver.
    6. Inkuber sektionerne med et monoklonalt anti-BrdU antistof, der fortyndes 1:500 i 1 time ved stuetemperatur. Vask sektioner 2 − 3 gange i TBS-T buffer i 3 min. hver.
    7. Visualisere immunopositivitet ved hjælp af 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) ved at anvende 5 dråber peberrod peroxidase til hver slide og inkuberes i 15 min ved stuetemperatur. Overfør sektionerne til en Røghætte, tilsæt 150 μL DAB og Inkuber i 5 min.
      Bemærk: bær altid handsker, når du håndterer DAB, og bortskaf affaldet korrekt.
    8. Skyl sektioner i deioniseret vand.
    9. Dehydrat vævet og Monter en dækseddel som beskrevet i trin 3.4.6 og 3.4.7.
  3. Visualisering af immunoreaktionerne
    1. Visualiser vævsprøven med et let mikroskop forbundet til et kamera.
    2. Brug analysesoftwaren til at få mikroskop billeder ved hjælp af en 20x mål for alle sektioner og gemme filer i. JPG-format.
    3. Tag et øjebliksbillede af en fase mikrometer ved hjælp af en 20x mål, som vil blive brugt som et kalibreringsværktøj i ImageJ software.
  4. Måling af arealet af BrdU immunoreaktive celler
    1. Installer ImageJ software (tabel over materialer).
    2. Tildeling af skalering til et billede i ImageJ: Åbn billedet Stage mikrometer ved hjælp af ImageJ- filen | Åbn menukommando. Vælg værktøjet til lige linjemarkering.
    3. Vælg det lige værktøj og tegn en lige linje på mikrometer billedet for at definere en kendt afstand.
    4. Vælg Indstil skalering i menuen Analysér .
    5. Angiv en værdi i feltet kendt afstand , og Definer længde enheden i boksen længdeenhed . Vælg Global , så denne kalibrering gælder for alle billeder, der åbnes i denne ImageJ-session.
    6. Åbne et billede af interesse ved hjælp af filen ImageJ | Åbn menukommando for at måle arealet af BrdU immunoreaktive celler per Crypt.
    7. Indstil farve grafikken til 8-bit undermenuen billede/type .
    8. Forøg kontrasten i billedet under proces/Forøg kontrast og Indstil de mættede pixels til 0,4%.
    9. Anvend en tærskel på billedet for at segmentere immunopositivitet. Vælg billede/Juster undermenu, derefter tærskel og Vælg farven rød (mørkt område vist med rødt). Vælg en tærskel på omkring 10 − 20% ved at flytte tærskel bjælken.
      Bemærk: Vælg en tærskel, der omfatter alle BrdU positive celler med så lidt baggrund som muligt. Den valgte procentsats bør gælde for alle sektioner.
    10. Vælg en velorienteret Crypt, dvs en komplet krypt fra intakt væv, og vælg det frie hånd markeringsværktøj til at markere området omkring det.
    11. Hvis du vil måle tærskel området, skal du vælge fanen Analysér efterfulgt af Analysér partikler. I vinduet Analysér partikel skal du indstille størrelse til 20-uendelighed, klikke på boksen pixelenheder, indstille cirkularitet til 0,00 − 1,00og indstille Vis til konturer. Klik på bokse Vis resultater, Sammenfatog Medtag huller.
      Bemærk: værdierne for BrdU positive celler genereres automatisk i et resultat vindue, der viser de individuelle målinger for hver BrdU-positiv celle. Desuden genereres der automatisk et oversigtsvindue, der viser antallet af optællinger, det samlede areal, den gennemsnitlige størrelse og procentdelen af arealet med BrdU-positive celler.
    12. Gentag trin 5.4.10 og 5.4.11 for at måle en ny Crypt. Resultaterne af alle målte Krypter vises i vinduet Resume .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det første eksperiment inducerede vi mucositis hos mus på dag 0 og ofrede en gruppe mus hver dag i 5 på hinanden følgende dage. Ved måling af si vægt, vi fandt, at denne parameter faldt fra dag 2 indtil dag 4 tyder på et tab i i masse. Vi konstaterede også, at på dag 5 var SI-vægten ikke signifikant forskellig fra dag 0 (ubehandlede mus) (figur 1). Spredningen målt ved inkorporering af BrdU blev næsten afskaffet på dag 1 og dag 2, men på dag 4 og dag 5 var der henholdsvis ca. fire gange og fem gange større spredning af spredningen (figur 2). Denne hyperproliferation blev også illustreret ved måling af krypten dybde (figur 3). Hvad er ikke illustreret ved at måle Crypt dybde er tabet i prolifererende celler på dag 1 og dag 2, hvor krypten dybde blev reduceret med ca 13%, men var ikke signifikant forskellig fra de raske mus. Vi kunne vise, at i den regenerativ fase af mucositis var der en stærk sammenhæng mellem brdu inkorporering og krypt dybde, men dette ikke tælle for den akutte fase indikerer, at krypt dybde som et endepunkt ikke kan være egnet i den akutte fase af mucositis (figur 4).

I den anden undersøgelse undersøgte vi mucostis i vores transgene musemodel med utilstrækkelig L-celle sekretion. Mus med mangelfuld GLP-1 og GLP-2 udviste et alvorligt tab af legemsvægt (BW) og et fald i SI-vægten i restitutionsfasen, hvilket var meget signifikant sammenlignet med 5-FU-mus (p < 0,01) (figur 5a, B). Desuden har de Transgene mus undladt at vise kompenserende hyperproliferation; krypterne var betydeligt kortere end i både WT-mus og sunde kontroller. I modsætning til dette viste WT-musene en stigning i krypten-dybden som et tegn på hyperproliferation (figur 5c).

Figure 1
Figur 1: lille tarm vægt. Mus blev ofret 1 til 5 dage efter 5-FU injektion på dag 0 og tarm vægten blev målt som beskrevet. Resultaterne vises som middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM). n = 13. Dette tal er blevet modificeret fra Hytting-Andreasen et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: BrdU immunopositive celler per Crypt for duodenum, jejunum, og ileum af si. Mus blev ofret 1 til 5 dage efter 5-FU injektion på dag 0 og BrdU inkorporering blev kvantificeret ved immun histokemi som beskrevet. Resultaterne vises som middelværdien ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (analyse af variansen [ANOVA] efterfulgt af Dunnett multiple sammenligningstest). p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (ANOVA efterfulgt af Dunnett multiple sammenligningstest). Dette tal er blevet modificeret fra Hytting-Andreasen et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: måling af krypten dybde. Mus blev ofret 1 til 5 dage efter 5-FU injektion på dag 0 og krypten dybde blev målt som beskrevet. Resultaterne vises som middelværdien ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (ANOVA efterfulgt af Dunnett multiple sammenligningstest). Dette tal er blevet modificeret fra Hytting-Andreasen et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: korrelation af krypten dybde og BrdU. Crypt dybde (i duodenum, jejunum, og ileum) er korreleret til BrdU inkorporering på hver dag af offer ved hjælp af to-sidet Pearson korrelations test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: mus, som ikke er i GLP-1-og GLP-2-mangel, regenererer efter akut mucositis. (A) ændring i BW (%), (B) si vægt (g), og (C) krypt dybde i ileum (μm). Resultaterne vises som Mean ± SEM. TG = Transgene mus; WT = vildtype mus; 5-FU = 5-fluorouracil. n = 4 − 8. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 sammenlignet med sund kontrol (WT Saline), a = p < 0,05, AA = p < 0,01, AAA = p < 0,001 sammenlignet med WT 5-FU (to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligningstest [BW] eller ANOVA efterfulgt af Dunnett multiple comparis på test). Dette tal er blevet modificeret fra Hytting-Andreasen et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: lille tarm væv før induktion af mucositis, i den akutte fase og genopretningsfasen af mucositis. A) haemotoxylin og eosin (H & E) farvning og (D) brdu farvning i ubehandlede mus. Den sorte stiplede linje i panel A eksemplificerer en velorienteret krypt, mens den stiplede grønne linje demonstrerer en velorienteret villus. B) H & e farvning og (E) brdu farvning i den akutte fase af mucositis. C) H & E farvning ogf) brdu farvning under genopretningsfasen efter induktion af mucositis. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en bredt tilgængelig metode til at studere SI skade og regenerering i en musemodel. En bred vifte af prækliniske dyremodeller af tarm skade findes, men det er afgørende, at vi forstår, at hver model er unik, og at endepunkterne skal være passende at besvare forskningen spørgsmål. Denne model er fremragende til at studere adaptive respons på skade, men endepunkterne bør ændres, når du bruger modellen som en præklinisk model af mucositis. Men, oversættelse fra dyremodeller til patienter er udfordrende23. Vores foreslåede endepunkter af SI vægt og proliferation bør begrænses til studiet af adaptiv respons alene. Studiet af endogene faktorer kræver ofte brug af Transgene mus, og selv om lille tarm resektion er mulig i mus1, kan denne model være et alternativ til at undgå postoperativ dødelighed. Når du anvender denne model til Transgene mus, er det vigtigt at se musene omhyggeligt og overvåge deres vægt hver dag. Under denne undersøgelse oplevede nogle af musene et vægttab på op til 30%, hvilket er ret betydeligt. For at undgå høj dødelighed i følsomme fænotyper foreslår vi at udføre pilotundersøgelser i Transgene mus, da det kan være nødvendigt at justere dosis.

Et kritisk skridt inden for den beskrevne metode er fjernelse og vejning af SI. Det er vigtigt, at fjernelse og håndtering udføres på samme måde og af den samme forsker hver gang for at undgå store Inter-assay variationer.

Konsistensen af Crypt og villus udvælgelse er vigtigt for at undgå varians og bias, når du måler krypten dybde og villus højde. Ved indlejring af vævet i paraffin placeres tarmene i opretstående stilling for at lave tværgående snit, hvilket øger muligheden for intakt villi og Krypter. Efter opskæring af vævet, en velorienteret Crypt og/eller villus er valgt. Udvælgelsen er baseret på den fulde visualisering af hele krypten og villus i samme plan og tilstedeværelsen af klare grænser af celler i krypten og villus. En begrænsning til denne metode er den noget subjektive tilgang, når du vælger en velorienteret Crypt, da udvælgelsen af en velorienteret Crypt og/eller villi er lavet efter opskæring af vævet. En tidligere undersøgelse24 har præsenteret en alternativ metode til at overvinde denne begrænsning, hvor de bruger microdissection. I denne metode, villi og Krypter er valgt, mens observere under et mikroskop, før vævet skæres, hvilket gør det muligt at sikre, at en intakt krypt og villi bliver dissekeret fra vævet.

I modsætning til tidligere metoder, der anvendes til mængde brdu positive celler25,26, denne protokol beskriver området af brdu positive celler per Crypt, som giver en hurtig måde at kvantificere proliferativ celler inden for hver Krypter. Denne teknik, dog, kan være noget restriktiv, da det kræver en mere dybtgående viden om den software, der foreslås til måling af denne teknik. En fremtidig anvendelse af denne protokol kunne være at skabe en mere automatisk genereret metode til at kvantificere og måle BrdU positive celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et ubegrænset tilskud fra Novo Nordisk Center for grundlæggende metabolisk forskning og Lundbeck fonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Tags

Kræftforskning lille tarm skade proliferativ markører brdu krypt dybde villus højde kompenserende hyperproliferation
Vigtige endepunkter og proliferative markører til at vurdere små tarmskader og tilpasning ved hjælp af en muse model af kemoterapi-induceret mucositis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter