Summary
在这里,我们提出了一个协议,建立重要的终点和小肠损伤和补偿性增殖,使用化疗引起的粘炎模型。我们演示了使用细胞周期特定标记和使用小肠道重量、墓穴深度和绒痛高度作为端点来检测增殖细胞。
Abstract
肠道适应是当肠道因创伤而丧失时发生的自然补偿机制。适应性反应,如密码细胞增殖和增加营养吸收,在恢复中至关重要,但了解甚少。了解适应性反应背后的分子机制对于促进营养素或药物的识别以增强适应性至关重要。在整个文献中,都描述了不同的方法和模型,但需要一种详细的描述性方法来基本执行这些程序,以获得可重现的数据。在这里,我们描述了一种使用小鼠化疗引起的粘炎模型来估计小肠损伤和补偿性增殖的重要终点和增殖标记的方法。我们演示了使用细胞周期特定标记以及使用小肠道重量、墓穴深度和绒痛高度作为端点来检测增殖细胞。所述方法中的一些关键步骤是小肠的切除和称重,以及为测量该技术而建议的相当复杂的软件系统。这些方法的优点是它们不费时,而且具有成本效益高,易于执行和测量。
Introduction
肠道适应是自然补偿机制,当肠道因疾病或手术1,2而丧失时发生。创伤后,肠道经历形态和功能适应性反应,其特征是隐细胞增殖和增加营养吸收3。这一步骤在复苏中至关重要,但了解不足。肠道适应性反应的实验研究侧重于小鼠、大鼠和猪小肠切除后发生的变化,但了解其他损伤(如化学)自适应反应背后的分子机制或细菌)对于促进营养素或药物的识别以增强适应性至关重要。在实验中,用不同的方法来描述小肠病理学的复杂分子和细胞指数,包括组织病理学评分和损伤结果的测量。尽管如此,文献中缺少的是如何执行获取可重现数据所需的过程的详细描述。当确定适应所涉及的因素(如肠道激素)时,需要一种简单、低成本和可重复的动物模型,在这里我们建议使用化疗引起的肠道粘炎 (CIM) 模型。
损伤和适应的最简单和非常丰富的终点之一是测量小肠(SI)的质量。我们知道,粘炎的一个标志是肠细胞凋亡,时间依赖性阴萎缩和减少的丝质炎。因此,在临床前模型4、5中,检查肠道形态具有高度相关性。在人类中,血浆胆碱的下降,一个功能的肠细胞的标记,与毒性分数和炎症标记6相关,除了吸收能力7,这表明这种氨基酸是一个优秀的生物标志物粘炎。胆碱可以在小鼠和大鼠身上进行测量,并且与绒带长度8、密码生存9和辐射引起的粘炎10表现出优异的相关性。
测量等离子胆碱的一个主要优点是能够收集一种动物的重复测量。然而,小鼠的多次血液取样仅限于每周总血量为6μL/g,需要一般麻醉。不幸的是,这也限制了在小鼠中使用胆碱测量。此外,测量胆碱需要高性能液相色谱11,12,这是昂贵和费时。最近,我们发现小鼠的胆碱水平与SI重量(p<0.001)(未公布的数据)显著相关,使胆碱成为反映肠细胞质量的直接测量。测量SI重量的一个限制是必须牺牲小鼠,因此在同一小鼠内不可能重复测量。尽管如此,该方法提供了对研究问题进行各种其他组织分析的可能性,这些事实可以想象弥补对动物的额外使用。因此,我们建议使用SI体重作为小鼠损伤和适应的一种简单、低成本和快速的生物标志物。为了确保可重复性和可接受的分析变异,应小心地从动物中取出肠道,用盐水冲洗,在称重前排空和干燥。在本文中,我们将准确介绍如何执行此过程。
粘炎的另一个特征是墓穴中增殖细胞的丧失,以及再生期3期间补偿性超增增。细胞标记Ki67经常被用来通过免疫组织化学13来确定快速增殖细胞。尽管Ki67是扩散的简单标志,但它有不精确的倾向,因为Ki67在细胞周期的所有活跃阶段(G1、S、G2和M)14中都存在。特定标签对于检测复制细胞至关重要,这就是为什么我们建议原位加入5-bromo-2'-脱氧尿氨酸(BrdU),一种合成的胸腺素模拟物,因为它在很大程度上仅限于在S-阶段15中复制细胞。BrdU在牺牲前150分钟注射到动物体内,随后可以使用BrdU特异性抗体通过免疫组织化学检测细胞。在该方法文章中,我们展示了如何使用自由图像软件测量墓穴中BrdU免疫阳性细胞的面积。
形态和功能变化通常在5-FU诱导粘炎模型中进行研究,其中肠道适应是通过绒痛高度和墓穴深度进行评估的。在这项研究中,我们发现,在粘炎的急性阶段(等于损伤阶段)中,BrdU合并所测量的增殖与墓穴深度无关。与此相反,在诱导后3至5天,墓穴深度与粘炎修复阶段出现增殖显著相关。这表明粘炎的急性阶段不能单靠墓穴深度来测量。我们建议,当在粘炎小鼠的急性阶段使用增殖作为终点时,最好使用BrdU合并,但是当在再生阶段的后期定量增殖时,密码深度是合理的替代BrdU公司。本研究的目的是描述这个模型的方式,它可以被所有研究人员使用,无论是在肿瘤学领域,特别是研究人员不熟悉肠道损伤模型。
所述模型可用于根据自适应响应,使用体重、SI重量和墓穴深度作为终点进行表型转基因模型。例如,我们在这里展示我们如何在L细胞分泌不足的细胞敲除模型中使用5-氟尿酸(5-FU)诱导粘炎的模型。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是肠道激素,从肠内分泌L细胞中共同分泌,以回应食物摄入量17,18。GLP-2被认为是肠道愈合、粘膜凋亡调节和改善SI 19、20、21、22阻隔功能的重要因素。根据文献资料,我们假设内源性激素对于损伤后适应性反应中发生的补偿性超增至关重要。
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Protocol
所描述的所有方法都是根据丹麦关于动物实验的立法准则(1987年)进行的。研究是在丹麦动物实验监察局(2013-15-2934-00833)和当地伦理委员会的许可下进行的。
注:获得雌性C57BL/6J小鼠(+20~25克),在标准12小时光、12小时暗循环中每笼8只,可免费取水和标准。在实验开始前,动物们不得不适应一个星期。
1. 使用5-氟尿酸诱导粘炎
- 在50mg/mL溶液中获得5-氟酸(5-FU)。
- 称量并记录小鼠的体重。从体重中,计算注射的5-FU量(例如,400毫克/千克)。
- 准备一个1 mL注射器连接到27 G x 30毫米针,并填充注射器与5-FU注射的计算量。
- 用刮毛方法约束鼠标。为此,用一只手抓住尾巴的底座,并将其放在脚趾夹持的表面上,如钢丝杆盖。用一只手定位尾巴时,用另一只手握住颈部的擦伤。
- 通过尽可能将食指和拇指伸回,将鼠标主体牢固地放在一只手上。将尾巴放在同一只手的手指之间,以固定鼠标。
- 在保持小鼠牢固而温和的抓地力的同时,露出鼠标的腹腔侧,并将针头插入腹部右下或左象限的腹腔内。吸气以确保正确放置,并注射400毫克/千克5-FU。
2. 组织收集
- 用盐水溶液(0.9% NaCl)稀释的氯胺酮/西拉辛(100/10mg/kg)注射腹内注射,麻醉小鼠。通过观察捏合反射来监测麻醉深度。
注:麻醉是一种非恢复性麻醉。 - 记录麻醉小鼠的重量。
- 将鼠标置于软体位置,进行腹腔切除术以暴露腹腔,然后切开胸腔以引入肺气肿。
- 用剪刀,通过切开隔膜来牺牲动物。
- 取出小肠。切优于皮洛人,小心地将小肠从尸体上缩回,直到到达cecum,并在cecum之前进行切口。
- 使用钳子,轻轻夹紧近端流明。使用连接25G针头的1 mL注射器,用盐水冲洗小肠以去除粪便。
- 用手术器械从肠道流明中轻轻去除盐水。
- 将小肠放在干净的印迹纸上,小心去除多余的盐水。
- 记录冲洗组织的重量。
- 计算冲洗的小肠道重量作为体重的百分比。
3. 小肠本体学
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组织制备
- 在烟机罩中,使用剪刀从十二指肠、十二指肠和回肠中切出每只小鼠的3厘米状的肠道组织,并在室温下将部分固定在10%的正体内,24小时。
注:固定体积应为组织体积的5-10倍。 - 将固定组织转移到切割板上。
- 使用手术刀,将组织修剪到大约 1 厘米,并转移到嵌入盒中。
注:盒式磁带应标有铅笔中的样品标识 (ID)。 - 将盒装机浸入 70% 乙醇中,并在 4°C 下储存,直到进一步加工。
- 在烟机罩中,使用剪刀从十二指肠、十二指肠和回肠中切出每只小鼠的3厘米状的肠道组织,并在室温下将部分固定在10%的正体内,24小时。
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在石蜡中嵌入的组织
- 通过放入上升酒精溶液来使组织脱水。将盒装在 70% 乙醇中放置 1 小时,然后将 80% 乙醇 1 小时、95% 乙醇 1 小时和 1.5 小时乙醇 1.5%,将盒式从 100% 乙醇转移到二甲苯 1.5 小时。
- 将盒装与石蜡加热在 58~60 °C 之间。使用钳子将组织定位为横向,使块冷却超过 24 小时,直到变硬。
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使用微缩菌切除组织
- 放置方块,组织面朝下在冰上5分钟。使用微孔,修剪石蜡块厚度为10~30μm,露出组织表面。
- 在3~5μm之间切割组织块的横截面,使十二指肠、十二指肠、十二指肠和回肠的横截面。
- 将石蜡色带放置在 40~45 °C 之间的水浴中。使用钳子分隔各节。
- 使用显微镜玻片从水中拾取部分。
- 在染色前,将滑片晾干 30 分钟。
注:要存放更长时间,将幻灯片存放在冰箱中。
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组织血氧林-欧辛染色
- 将显微镜幻灯片放在一个活动摇篮中。在 60°C 的加热柜中对滑片进行 60 分钟的除蜡处理。
注:在将滑至加热柜之前,应直接从冰箱中滑下以达到室温。 - 在烟气罩中,在清除剂(材料表)的3次变化中重新水化组织,在第一个清除剂罐中滴20次,然后让它们在两个额外的清除剂罐中各站立7-8分钟。将幻灯片转移到降酒精溶液,从 3 次 99% 乙醇的变化开始,然后是 2 次 96% 乙醇和 70% 乙醇的变化。在每个罐子中至少浸20次。转移到自来水,让滑梯站立5分钟。
- 将幻灯片浸入过滤过的 Meyer 的血氧林中 1 分钟。
- 在自来水中清洗样品 5 分钟。
- 将部分浸入 eosin 染色中 1⁄2 分钟,然后用自来水冲洗。
- 通过放入上升酒精溶液来使组织脱水。以 70% 乙醇开始,然后是 96% 乙醇、96% 乙醇和 4 倍 99% 乙醇。在每个罐子中至少浸20次,让底座在99%乙醇中站立,直到安装。
- 通过将少量安装介质施加到滑轨表面,安装盖玻片。将盖玻片放在安装介质的顶部,而不会在盖玻片下产生气泡。晾干24小时。
- 使用连接到相机的光学显微镜检查组织,以获得组织学照片。使用 10 倍目标拍摄快照,直到达到组织幻灯片的完全覆盖。
- 将显微镜幻灯片放在一个活动摇篮中。在 60°C 的加热柜中对滑片进行 60 分钟的除蜡处理。
4. 测量墓穴深度和/或绒带高度
- 下载并安装分析软件(即禅学、材料表)。
- 打开软件中的图像并连接到相机。以 20 倍目标在相机模式下拍摄快照。
- 在处理模式下,打开快照。
- 要测量墓穴深度:在2D视图中,从图形选项卡中选择线工具。选择一个方向良好的墓穴,然后从网底开始线,在墓穴底部完成。对 20 个方向良好的墓穴重复此操作(补充图 1)。
- 要测量线高:在2D视图中,从图形选项卡中选择线工具。选择一个方向良好的线,在发光投影的末尾开始线,并在墓穴的开头完成。对 20 个方向良好的 villi 重复此操作(补充图 1)。
- 从2D 视图切换到"测量"视图以显示测量值。
- 导出测量值并计算墓穴深度和绒梁高度的平均值。
5. 免疫组织化学的BrdU定量(增殖)
- BrdU 溶液的注入
- 称量并记录小鼠的体重。
- 在烟气罩中,在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中制备具有代表性的 0.5% w/v 溴氧尿素 (BrdU) 溶液。
- 在烟气罩中,通过腹内注射注射50毫克/千克的BrdU。
注:为确保每只小鼠在BrdU注射后150分钟被安乐死,请连续注射每只小鼠,间隔间隔为10~20分钟,以便正确进行组织采集。 - 记录注射时间。
- 等待150分钟,然后麻醉小鼠并收集步骤2.1_2.7中所述的组织。执行第 5.2 节所述的 BrdU 免疫组化学。
- BrdU免疫性大化学
- 按照步骤 3.1.1_3.3.4 中所述准备组织。
- 对于抗原检索,将带有各部分的滑摇篮放入玻璃组织学罐中,并在微波炉中填充 EDTA 缓冲液 (pH 9) 1 分钟,在 750 W 时,再以 350 W 重复循环 9 分钟。
注:确保组织不干涸,这可能需要在加热之间为罐子添加更多缓冲液。 - 在三缓冲盐水和多糖20(TBS-T)缓冲液中清洗部分2⁄3次,每次3分钟。
- 在室温下涂抹5滴过氧化物块(材料表)10~15分钟,以阻止内源性过氧化物酶活性。在 TBS-T 缓冲液中清洗部分 2⁄3 次,每次 3 分钟。
- 在室温下涂抹5滴啮齿动物块缓冲液(材料表)30分钟,以阻止非特异性结合。在 TBS-T 缓冲液中清洗部分 2⁄3 次,每次 3 分钟。
- 在室温下用单克隆小鼠抗BrdU抗体稀释1:5001小时孵育各部分。在 TBS-T 缓冲液中清洗部分 2⁄3 次,每次 3 分钟。
- 使用 3,3' -二氨基苯甲酸酯 (DAB) 可视化免疫性,将 5 滴马萝卜过氧化物酶涂至每张幻灯片,并在室温下孵育 15 分钟。将部分转移到烟气罩,加入150 μL的DAB,孵育5分钟。
注意:处理 DAB 时务必戴上手套,并妥善处理废物。 - 用去离子水冲洗部分。
- 如步骤 3.4.6 和 3.4.7 所述,使组织脱水并安装盖玻片。
- 免疫反应的可视化
- 使用连接到相机的光学显微镜可视化组织样本。
- 使用分析软件使用所有部分的 20 倍目标获取显微镜图像,并将文件保存在 中。JPG 格式。
- 使用 20x 目标拍摄舞台千分尺的快照,该目标将用作 ImageJ 软件中的校准工具。
- 测量BrdU免疫反应细胞的面积
- 安装 ImageJ 软件 (材料表)
- 在 ImageJ 中为图像分配比例:使用 ImageJ 文件打开舞台微米图像|打开菜单命令。选择直线选择工具。
- 选择直线工具,并在微米图像上绘制一条直线,以定义已知距离。
- 在"分析"菜单下选择"设置比例"。
- 在"已知距离"框中输入一个值,并在"长度单位"框中定义长度单位。选择"全局",以便此校准应用于在此 ImageJ 会话中打开的所有图像。
- 使用 ImageJ 文件打开感兴趣的图像|打开菜单命令,用于测量每个墓穴的 BrdU 免疫反应细胞的面积。
- 在"图像/类型"菜单下将彩色图形设置为 8 位。
- 在"处理/增强对比度"下增加图像对比度,并将饱和像素设置为 0.4%。
- 对图像应用阈值以分割免疫原位。在菜单下选择"图像/调整",然后设置阈值并选择红色(以红色显示的暗区)。通过移动阈值柱选择大约 10±20% 的阈值。
注: 选择包含所有 BrdU 阳性单元格的阈值,其背景尽可能少。所选百分比应适用于所有部分。 - 从完好的组织中选择一个方向良好的墓穴,即完整的墓穴,然后选择自由手选择工具来标记其周围的区域。
- 要测量阈值区域,请选择"分析"选项卡,后跟"分析粒子"。在"分析粒子"窗口中,将"大小"设置为20 无穷大,单击框像素单位,将"循环度"设置为0.00±1.00,并将"显示"设置为"轮廓"。单击"显示结果","总结"和"包括孔"的框。
注: BrdU 阳性细胞的值在结果窗口中自动生成,显示每个 BrdU 阳性细胞的单个测量值。此外,还会自动生成摘要窗口,显示具有 BrdU 阳性单元格的计数数、总面积、平均大小和面积百分比。 - 重复步骤 5.4.10 和 5.4.11 测量新墓穴。所有测量的墓穴的结果将显示在"摘要"窗口中。
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Representative Results
在第一个实验中,我们在第0天诱导小鼠粘炎,并连续5天每天牺牲一组小鼠。在测量SI重量时,我们发现这个参数从第2天到第4天下降,这表明肠细胞质量下降。我们还发现,在第5天,SI体重与第0天(未经治疗的小鼠)没有显著差异(图1)。在合并BrdU所测量的增殖几乎在第1天和第2天被废除,但在第4天和第5天,扩散量分别增加了大约4倍和5倍(图2)。在测量墓穴深度时,也说明了这种超增增(图3)。测量墓穴深度没有说明的是,第1天和第2天增殖细胞的流失,其中墓穴深度减少了约13%,但与健康的小鼠没有显著差异。我们可以表明,在粘炎的再生阶段,BrdU合并和密码深度之间存在很强的相关性,但这还不包括急性期,表明作为终点的墓穴深度可能不适合粘炎 (图 4.
在第二项研究中,我们检查了转基因小鼠模型中的Mucostis,L细胞分泌不足。GLP-1和GLP-2缺乏的小鼠在恢复阶段表现出体重严重减轻和SI重量下降,与野生型(WT)5-FU小鼠(p < 0.01)相比,这一点非常重要(图5A,B)。此外,转基因小鼠没有表现出补偿性超增;墓穴比WT小鼠和健康对照组要短得多。与此相反,WT小鼠表现出墓穴深度的增加,作为超增增的迹象(图5C)。
图1:肠道小重量。小鼠在第0天注射5-FU后1至5天被牺牲,肠道重量按描述测量。结果显示为均值 (SEM) 的均值 = 标准误差。n = 13。这个数字已由海廷-安德烈森等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:SI十二指肠、麻黄细胞和回肠每个活室的BrdU免疫阳性细胞。小鼠在第0天注射5-FU后1至5天被牺牲,BrdU合并被免疫性化学量化,如所述。结果显示为平均值 = SEM. n = 13。*p < 0.05, [p < 0.001 与第 0 天相比(方差分析 [方差] 后跟 Dunnett 多重比较测试)。p < 0.001 与第 0 天相比(ANOVA 后跟 Dunnett 多重比较测试)。这个数字已由海廷-安德烈森等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:墓穴深度的测量。小鼠在第0天注射5-FU后1至5天被牺牲,并按照描述测量了墓穴深度。结果显示为平均值 = SEM. n = 13。*p < 0.05, #p < 0.001 与第 0 天相比(ANOVA 后跟 Dunnett 多重比较测试)。这个数字已由海廷-安德烈森等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:墓穴深度与BrdU的相关性。使用双尾皮尔逊相关测试,在十二指肠、十二指肠、十二指肠和回肠中,隐士深度与BrdU在每天的牺牲中结合。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:GLP-1和GLP-2缺鼠在急性粘炎后无法再生。(A) BW ( %) (B) SI 重量 (g) 和 (C) 在回肠 (μm) 的墓穴深度的变化。结果显示为均值 = SEM. Tg = 转基因小鼠;WT = 野生型小鼠;5-FU = 5-氟拉西尔。n = 4×8。\p < 0.05, \p < 0.01, _p < 0.001 相比健康控制 (WT 盐), a = p < 0.05, aa = p < 0.001 相比 WT 5-FU (双向方差分析后跟邦费罗尼多重比较测试 [BW] 或 ANOVA 跟随 Dunnett 多comparis测试)。这个数字已由海廷-安德烈森等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:小肠组织在粘炎诱导前,在急性期和粘炎的恢复阶段。(A) 未经处理的小鼠的血氧林和欧辛 (H&E) 染色和 (D) BrdU 染色.面板 A 中的黑色虚线体现了一个方向良好的墓穴,而虚绿线则显示了一个方向良好的线。(B) 在粘炎的急性阶段,H&E 染色和 (E) BrdU 染色。(C) H&E 染色和 (F) 在粘炎诱导后的恢复阶段进行 BrdU 染色。刻度条 = 100 μm。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里,我们演示了一种在小鼠模型中研究SI损伤和再生的可广泛访问方法。存在多种肠道损伤的临床前动物模型,但我们必须了解,每种模型都是独一无二的,并且端点必须适合回答研究问题。该模型非常适合研究对损伤的自适应反应,但在将该模型用作粘炎临床前模型时,应修改端点。然而,从动物模型到病人的翻译是具有挑战性的23。我们建议的SI重量和扩散的终点应仅限于自适应响应的研究。内源性因素的研究往往需要使用转基因小鼠,即使小鼠1可以小肠切除,这个模型也可以是避免术后死亡的替代物。当这个模型应用于转基因小鼠时,重要的是仔细观察老鼠,每天监测它们的体重。在这项研究中,一些小鼠的体重减轻了30%,这是相当可观的。为了避免敏感表型的高死亡率,我们建议在转基因小鼠中进行试验性研究,因为可能需要调整剂量。
所述方法中的一个关键步骤是去除和称重 SI。每次以相同方式和由同一研究人员执行拆卸和处理非常重要,以避免大的分时变化。
在测量墓穴深度和斜体高度时,密码和斜体选择的一致性对于避免差异和偏差非常重要。当将组织嵌入石蜡中时,肠道被定位在直立位置进行横向切割,从而增加了完整绒布和墓穴的可能性。切割组织后,选择一个方向良好的墓穴和/或绒带。选择基于整个墓穴和同一平面上的绒面完全可视化,以及墓穴和绒面内细胞的清晰边界存在。这种方法的一个限制是,在选择一个方向良好的墓穴时,有些主观的方法,因为选择一个方向良好的墓穴和/或绒带在切割组织后。先前的研究24提出了一种替代方法来克服这种限制,他们使用微解剖。在这种方法中,在显微镜下观察时,在组织被切割之前,选择绒文和墓穴,从而能够确保从组织中解剖完整的墓穴和地窖。
与以前用于定量BrdU阳性细胞25、26的方法不同,该协议描述了每个墓穴中BrdU阳性细胞的面积,它提供了一种快速的方法,可以定量每个墓穴中的增殖细胞。但是,这种技术可能有些限制性,因为它需要对用于测量此技术所建议的软件有更深刻的了解。该协议的未来应用可能是创建一种更自动生成的方法,以量化和测量BrdU阳性细胞。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了诺和诺德基础代谢研究中心和伦德贝克基金会的无限制资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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