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Behavior

कैनोहैबडाइटिस एलिगेंस में डोपामाइन सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए तैराकी प्रेरित पक्षाघात

Published: April 3, 2019 doi: 10.3791/59243
Automatic Translation
1, 2, 1,3,4
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Summary

तैराकी प्रेरित पक्षाघात (swip) एक अच्छी तरह से स्थापित व्यवहार परख को caenorहैबडाइटिस एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में डोपामाइन संकेतन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन किया जाता है । हालांकि, परख करने के लिए एक विस्तृत विधि की कमी है । यहां, हम SWIP के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तैराकी परख एक वैध उपकरण है जो डोपाइन्जिक्यूटिव synapses को विनियमित करने वाले प्रोटीन की पहचान करता है । स्तनधारियों के समान, डोपामाइन (डीए) लर्निंग और मोटर गतिविधि सहित सी. एलिगेंस में कई कार्यों को नियंत्रित करता है । शर्तों कि दा रिलीज को उत्तेजित (जैसे, एंफ़ैमाइन (AMPH) उपचार) या कि डीए की मंजूरी को रोकने (जैसे, पशु दा ट्रांसपोर्टर (dat-1) जो ंयूरॉंस में डीए reaccumulating के असमर्थ है कमी) extracellular दा की एक अतिरिक्त उत्पंन अन्ततोगत्वा चलन में बाधा उत्पन्न होती है । पशुओं के पानी में तैरने पर यह व्यवहार विशेष रूप से स्पष्ट होता है । वास्तव में, जबकि जंगली प्रकार के जानवरों के लिए एक विस्तारित अवधि के लिए तैरना जारी, dat-1 नल ंयूटेंट और जंगली प्रकार amph या दा ट्रांसपोर्टर के inhibitors के साथ इलाज के नीचे अच्छी तरह से और कदम नहीं है । इस व्यवहार को "तैराकी प्रेरित पक्षाघात" (SWIP) कहा जाता है । हालांकि SWIP परख अच्छी तरह से स्थापित है, विधि का एक विस्तृत वर्णन की कमी है । यहाँ, हम SWIP प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड का वर्णन. परख करने के लिए, देर लार्वा स्टेज-4 जानवरों के साथ या बिना amph के नियंत्रण सुक्रोज समाधान युक्त एक गिलास हाजिर थाली में रखा जाता है । जानवरों को अपने स्विमिंग व्यवहार के लिए या तो मैन्युअल रूप से एक त्रिविमदर्शी के तहत या स्वचालित रूप से एक कैमरा के साथ रिकॉर्डिंग द्वारा त्रिविमदर्शी पर घुड़सवार द्वारा बनाए गए हैं । वीडियो तो एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर है, जो गर्मी नक्शे के रूप में आवृत्ति और पक्षाघात की पिटाई की एक दृश्य प्रतिनिधित्व पैदावार का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । मैनुअल और स्वचालित प्रणाली दोनों ही पशुओं के तैरने की क्षमता का आसानी से आकलन करने की गारंटी देते हैं और इस प्रकार डोपनेनरजिक प्रणाली के भीतर या सहायक जीन के लिए पशुओं के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करते हैं । इसके अलावा, SWIP का उपयोग AMPH जैसे दुर्व्यवहार की दवाओं की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

पशु सहज और जटिल व्यवहार है कि विभिंन जटिल संकेतन प्रक्रियाओं द्वारा समंवित न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा मध्यस्थता कर रहे है की एक किस्म प्रदर्शन करते हैं । न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन (डीए) सीखने, मोटर समारोह और इनाम प्रसंस्करण सहित प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित व्यवहार मध्यस्थता करता.

मिट्टी सूत्रकृमि C. एलिगेंस, एक अपेक्षाकृत सरल और अच्छी तरह से मैप तंत्रिका प्रणाली के साथ केवल ३०२ ंयूरॉंस से मिलकर, स्पष्ट रूप से जटिल व्यवहार से पता चलता है, सहित कई कि डीए द्वारा विनियमित जैसे सहवास, सीखने, foraging, चलन और अंडा बिछाने के रूप में 1. अन्य सुविधाओं के अलावा, लघु जीवन चक्र, हैंडलिंग और सिग्नलिंग अणुओं के संरक्षण में आसानी, संरक्षित व्यवहार के तंत्रिका आधार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लाभों पर प्रकाश डाला.

हर्मेफ्रोडाइट सी. एलिगेंस में आठ डोपाइन्नरजिक न्यूरॉन्स होते हैं; इन के अलावा, पुरुष संभोग प्रयोजनों के लिए छह अतिरिक्त जोड़े शामिल हैं । स्तनधारियों में के रूप में, इन ंयूरॉंस दा synthesize और दा ट्रांसपोर्टर (DAT-1), एक झिल्ली प्रोटीन dopaminergic ंयूरॉंस, जो synaptic फांक में जारी किया दा परिवहन में विशेष रूप से पाया का इजहार dopaminergic ंयूरॉंस । इसके अलावा, संश्लेषण, पैकेजिंग और डीए की रिहाई के प्रत्येक चरण में शामिल प्रोटीन के अधिकांश कीड़े और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं और, जैसे स्तनधारियों में, दा modulates खिला व्यवहार और चलन C. एलिगेंस2में.

C. एलिगेंस ठोस सतहों और पानी में एक विशेषता थ्रेशिंग व्यवहार के साथ तैरती पर क्रॉल । दिलचस्प है, ंयूटेंट की अभिव्यक्ति की कमी DAT-1 (dat-1) आम तौर पर ठोस सतह पर क्रॉल लेकिन तैराकी बनाए रखने में विफल जब पानी में डूबे । यह व्यवहार तैराकी प्रेरित पक्षाघात, या SWIP कहा जाता था । पिछले प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि SWIP, भाग में, synaptic फांक कि अंततः D2 की तरह postsynaptic रिसेप्टर्स (DOP-3) को उत्तेजित करता में मंहगाई की अधिकता के कारण होता है । हालांकि मूलतः dat में पहचान -1 नॉकआउट पशु3, swip भी जंगली प्रकार दवाओं है कि dat की गतिविधि ब्लॉक (जैसे, imipramine4) और/या डीए रिलीज (जैसे, एंफ़ैटेमिन5) के साथ इलाज पशुओं में मनाया जाता है । दूसरी ओर, औषधीय या आनुवंशिक जोड़तोड़ को संश्लेषण और डीए की रिहाई और डॉ़-3 रिसेप्टर समारोह अवरुद्ध6swip रोकने । एक साथ लिया, इन पहले से ही प्रकाशित डेटा एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में swip की स्थापना की है के लिए व्यवहार प्रभाव का अध्ययन करने के भीतर उत्परिवर्तित प्रोटीन की वजह से डोपाइन्नरजिक synapses3,4,7 और के लिए नियोजित किया जा करने के लिए उपंयास विनियामक मार्ग की पहचान के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन दा संकेतन में शामिल7,8,9,10,11,12। इसके अतिरिक्त, जीवित पशुओं में नशीली दवाओं से प्रेरित व्यवहार के एक आसानी से quantifiable readout प्रदान करके, SWIP dopaminergic synapses5में एंफ़ैटामाइन (amph) और azaperone जैसे ड्रग्स की कार्रवाई के तंत्र के स्पष्टीकरण सक्षम बनाता है, 6 , 13 , 14 , 15.

SWIP assays प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल16से पहले वर्णित किया गया है । यहां, हम विस्तार से पद्धति और स्थापना के लिए सी एलिगेंस समुदाय के लिए एक दृश्य गाइड प्रदान करने के लक्ष्य के साथ परख प्रदर्शन करने के लिए प्रभावी रूप से swip प्रदर्शन का वर्णन ।

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Protocol

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

  1. ख2पीओ4 ३.० जी (२२.०५ मिमी), ना2hpo4 ६.० जी (४२.२ मिमी), और nacl ५.० जी (८५.५ मिमी) को भंग करके M9 बफर तैयार autoclaved विआयनीकृत पानी के 1 एल में । Autoclaved के बाद 1 एम MgSO4 के १.० मिलीलीटर (१०० मिलीलीटर autoclaved विआयनीकृत पानी की एक अंतिम मात्रा में 12 ग्राम) जोड़ें । एक 1x समाधान बनाने के लिए autoclaved विआयनीकृत पानी की ९०० मिलीलीटर के साथ जिसके परिणामस्वरूप 10x M9 के १०० मिलीलीटर मिक्स ।
  2. अंडा बफर बनाने के लिए, nacl के ६.८९६ g भंग (११८ mm), ३.५७८ g of kcl (४८ mm), ०.२९४ g of cacl2-2h2o (2 mm), ०.४०६ g of mgcl2-6h2o (2 mm) और ५.९५८ g (25 मिमी) hepes के 1 L में autoclaved विआयनीकृत पानी । के लिए ७.३ का उपयोग कर NaOH पीएच समायोजित करें ।
  3. 1 मिलीलीटर 5-6% सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) और 10 एन-एल के १८० μL से ३.८ मिलीलीटर तक के विआयनीकृत जल को जोड़कर ताजा सोडियम हाइपोक्लोराइट/नैह समाधान तैयार करें ।
  4. वजन ६० g सुक्रोज और autoclaved विआयनीकृत पानी में १०० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में भंग करने के लिए ६०% सुक्रोज समाधान बनाने के लिए ।
  5. २०० मिमी सुक्रोज बनाने के लिए autoclaved विआयनीकृत पानी की 10 मिलीलीटर में सुक्रोज के ०.६८४ g भंग । जांच करें और osmometer का उपयोग कर एक ही एक परासारिता को समायोजित करें । १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 मिलीलीटर aliquots बनाओ और-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।
  6. Amph के ०.१८४ g वजन (आणविक वजन १८४.७५ g/mol) और एक १०० मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए विआयनीकृत पानी की 10 मिलीलीटर में भंग । ०.५ मिमी काम कर समाधान बनाने के लिए ४०० μL पानी में स्टॉक समाधान के 2 μL मिक्स ।
  7. पोषक तत्व वृद्धि मीडिया (NGM) प्लेटें तैयार
    1. मिक्स 3 ग्राम nacl (५२.६५ mM), पेप्टोन के 20 ग्राम, बेटो के 25 ग्राम-आगर और ९७५ मिलीलीटर एक 2 एल erlenmeyer फ्लास्क में विआयनीकृत पानी की । तरल चक्र का उपयोग कर 1 घंटे के लिए एक चुंबकीय हलचल बार और आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस, 15 साई) शामिल हैं ।
    2. ठंडा करने के लिए और के बारे में ५० डिग्री सेल्सियस पर एक हीटर पर कुप्पी रखने के द्वारा तापमान को बनाए रखने के हिलाते हुए । कोलेस्ट्रॉल की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (5 मिलीग्राम/इथेनॉल में एमएल), 1 मीटर की 1 मिलीलीटर MgSO4, 1 मीटर cacl2 और 1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 25 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर, पीएच ७.४ (१०८.३ ग्राम के ख2पीओ4, ३५.६ जी के2hpo4 , 1 एल के लिए पानी विआयनीकृत) ।
    3. पिपेट 25 मिलीलीटर प्रत्येक में १०० मिमी x 15 मिमी पेट्री प्लेटें और मीडिया जमना करने के लिए अनुमति देते हैं । 4 हफ्तों तक एक बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा प्लेट्स को स्टोर करें ।
  8. लाइसोजेनी शोरवा (LB) शोरबाट की तैयारी
    1. एक एरलेंमेयेर फ्लास्क में विआयनीकृत पानी की २०० मिलीलीटर में पौंड पाउडर मिक्स के 5 ग्राम को भंग कर दें । 30 तरल नसबंदी चक्र का उपयोग मिनट के लिए आटोक्लेव. शोरबाट शांत करने के लिए अनुमति दें । 1-2 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  9. NA22 बैक्टीरियल प्लेट्स की तैयारी
    1. एक बाँझ पिपेट टिप या एक बाँझ जीवाणु पाश का उपयोग करने के लिए ग्लिसरोल स्टॉक से NA22 E. कोलाई बैक्टीरिया की एक छोटी मात्रा के साथ एक पौंड प्लेट लकीर और थाली एक ३७ ° c इनसेबेटर में उल्टा अलग कालोनियों बढ़ने रातोंरात इनसेबेट । उठाओ और पौंड शोरबा के २०० मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी परिचय चरण १.८ में तैयार है और चलो एक मिलाते हुए मंच पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने ।
    2. प्लेटों को बीज करने के लिए, १.७ चरण में पहले से तैयार किए गए एनजीएम प्लेटों पर २०० μL बैक्टीरियल कल्चर का वितरण करें और ग्लास हॉकी स्टिक के साथ फैलाएं । प्लेट्स को एक हुड के नीचे रात भर सूखने दें और एक वाटरप्रूफ बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा स्टोर करें ।
  10. कीड़े लेने के लिए बरौनी/प्लेटिनम उपकरण बनाने के लिए, गोंद एक मोटी बरौनी या एक गिलास पाश्चर पिपेट में सुपर गोंद का उपयोग कर एक प्लेटिनम फिलामेंट । एक उरेया ब्लेड का उपयोग कर एक कोण पर बरौनी की नोक काट । वैकल्पिक रूप से, एक Bunsen बर्नर के लिए प्लेटिनम फिलामेंट के आसपास कांच पिपेट की नोक पिघल इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. सी. एलिगेंस पशुपालन

नोट: संस्कृति वाइल्ड-प्रकार N2C. एलिगेंस दबाव पर एस्चेरीच्या कोलाइ NA22 प्लेट्स. विस्तृत संस्कृति के तरीके नीचे बताए गए हैं ।

  1. कृमि संस्कृति की तैयारी
    1. कीड़े की एक स्टार्टर संस्कृति बनाने के लिए, एक अच्छी तरह से खिलाया जानवरों से युक्त थाली से आगर के एक छोटे से टुकड़े में कटौती और यह एक NA22 E. कोलाई बैक्टीरिया प्लेट पर स्थानांतरण एक बाँझ spatula का उपयोग १.९ कदम में तैयार. 3-4 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेटे प्लेट्स । एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, नेत्रहीन अंडपूर्ण वयस्कों की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
  2. कीड़े की सिंक्रनाइज़ जनसंख्या की तैयारी
    1. एक धार की बोतल का उपयोग कर प्लेट के चारों ओर autoclaved विआयनीकृत पानी वितरण द्वारा कम से 2 प्लेटों से अंडपूर्ण वयस्कों लीजिए । धीरे से कीड़े को हटाना और एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर polystyrene शंकु ट्यूब में कीड़े इकट्ठा करने के लिए थाली भंवर ।
    2. 2 मिनट के लिए १४० एक्स जी में एक सेंट्रीफ्यूज में ट्यूब नीचे स्पिन कीड़े के लिए, तो एक वैक्यूम पंप या प्रयोगशाला निर्वात में बनाया के साथ supernatant बंद महाप्राण ।
    3. Resuspend और 2 मिनट के लिए १४० x g पर autoclaved विआयनीकृत पानी और मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज के साथ ट्यूब भरने से कीड़े धोने । supernatant महाप्राण और दोहराएं इस अंतिम चरण दो और बार या जब तक कीड़े बैक्टीरिया से स्पष्ट कर रहे है (पानी स्पष्ट प्रकट होता है जब मिश्रित कीड़े के साथ) ।
    4. एक भंवर का उपयोग कर कृमि गोली और तेजी से मिश्रण करने के लिए नए सिरे से बनाया सोडियम हाइपोक्लोराइट/NaOH समाधान (चरण १.३) के 5 मिलीलीटर जोड़ें । के बारे में 4-8 मिनट के लिए एक घुमाव पर ट्यूब इनसेबेट । सोडियम हाइपोक्लोराइट/नैह विलयन के साथ ऊष्मायन का समय स्टॉक सोडियम हाइपोक्लोराइट विलयन (ब्लीच) की गुणवत्ता के आधार पर 4-8 मिनट के बीच घटता है ।
    5. एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कीड़े युक्त समाधान की एक बूंद (2-50 μL) रखो और कृमि lysis के लिए माइक्रोस्कोप के तहत हर 2 मिनट की जांच करें । जब कीड़े के बारे में ७०% लीजड ड और अंडे जारी कर रहे हैं, अंडे बफर के साथ ट्यूब को भरने के कदम १.२ में तैयार है और तुरंत 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज १४० एक्स जी में भ्रूण और कृमि शवों को गोली ।
    6. Supernatant महाप्राण और गोली 3 अंडे बफर के साथ हर बार ट्यूब भरने से अधिक बार धो लें । 1 मिनट के लिए १४० x जी पर नीचे स्पिन और supernatant हर बार हटा दें । गोली बहाकर के अंत में सफेद हो जाती है ।
    7. अंतिम धोने के बाद, 30% सुक्रोज समाधान में मृत शवों से भ्रूण अलग । गोली, resuspend और ६०% सुक्रोज के चरण १.४ में तैयार की 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए autoclaved विआयनीकृत पानी की 5 मिलीलीटर जोड़ें । 6 मिनट के लिए १६० x g पर अच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं ।
    8. एक गिलास pasteur पिपेट का उपयोग करने के लिए एक ताजा 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ऊपरी नवचंद्रक में तैर भ्रूण हस्तांतरण । 3-4 मिलीलीटर से अधिक न लें । किसी भी शेष sucrose हटाने के लिए, भ्रूण को 3 मिनट के लिए १४० x g में केंद्रापसारक द्वारा autoclaved पानी के साथ तीन बार धोने, supernatant हटाने और गोली resuspending (और ट्यूब भरने) हर बार ।
    9. दोहराएं 1x M9 बफर के साथ washes । फाइनल वॉश के बाद M9 के 10 एमएल में पेलेट को रेसपेंड करें । एक शेखर पर ट्यूबों छोड़ रातोंरात (कोई 14 से अधिक ज) को अंडे के लिए L1 लार्वा में हैच । कृमि भोजन की कमी के कारण L1 लार्वा अवस्था में रहेंगे ।
    10. L1 लार्वा को 2 मिनट के लिए १४० x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा लार्वा द्वारा जारी किए गए किसी भी फेरोमोन को हटाने के लिए autoclaved पानी के साथ 3 बार धोएं । 1 मिलीलीटर पानी में लार्वा को पुन: भिजवाएं । एक गिलास स्लाइड पर एक 10 μL ड्रॉप पिपेट, पानी में कीड़े का एक 1:10 कमजोर बनाना, पर एक coverslip डाल दिया है और एक त्रिविमदर्शी के तहत कीड़े की संख्या गिनती । यह दो बार दोहराएं और परिणाम औसत ।
    11. पिपेट कीड़े की मात्रा है कि एक NA22 थाली पर के बारे में १,००० कीड़े से मेल खाती है (जो पहले कमरे के तापमान के लिए लाया गया था) थाली पर छोटी बूंदें रखकर । प्लेट आधा खुला छोड़ जब तक बूंद dries बाहर । तो थाली को कवर और उल्टा 20 ° c इनसेबटर में लगभग 44-48 एच के लिए या जब तक कीड़े देर L4 चरण तक पहुंच, के रूप में नेत्रहीन एक stereomicroscope के तहत पुष्टि की । अब कीड़े SWIP के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं ।

3. SWIP

नोट: हम जंगली प्रकार के कीड़े AMPH के साथ इलाज में SWIP का आकलन करने के मैनुअल विधि का वर्णन । हम भी संक्षेप में कीड़े की ट्रैकिंग और एक स्वचालित वर्म ट्रैकर और एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर है जो पहले Hardaway एट अल.10द्वारा वर्णित थे का उपयोग कर कृमि कैनेटीक्स के आगे विश्लेषण पर चर्चा की ।

  1. SWIP के लिए परीक्षण करने के लिए मैनुअल विधि
    1. २०० mosm/L सुक्रोज समाधान के साथ या तो के साथ या बिना एक गिलास स्पॉट प्लेट में ०.५ मिमी amph के ४० μl । त्रिविमदर्शी के तहत, एक बरौनी या प्लेटिनम लेने के साथ 8-10 देर से L4 स्टेज कीड़े उठाओ और समाधान युक्त थाली में उठाओ डूब जब तक कीड़े उठाओ और समाधान में तैरना । नोट कीड़े की संख्या में अच्छी तरह से उठाया, टाइमर शुरू, निरीक्षण और कीड़े की संख्या रिकॉर्ड प्रत्येक मिनट के निशान पर SWIP प्रदर्शन ।
    2. एक स्प्रेडशीट में कच्चे डेटा की प्रतिलिपि बनाएं और कीड़े के प्रतिशत की गणना कीड़े की संख्या परख भर में परीक्षण कीड़े की कुल संख्या द्वारा झोले और १०० से गुणा द्वारा झोले । किसी भी रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में प्रतिशत मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और XY ग्राफ़ स्वरूप का उपयोग कर X अक्ष पर Y अक्ष और समय पर प्रतिशत मानों के साथ डेटा प्लॉट करें ।
    3. नियंत्रण, AMPH समूहों और उपचार के समय के बीच सांख्यिकीय महत्व के लिए परीक्षण करने के लिए पोस्ट-हॉक विश्लेषण (जैसे, Bonferroni बाद परीक्षण) के बाद दो तरह ANOVA प्रदर्शन ।
  2. SWIP का स्वचालित विश्लेषण
    1. एक समय में एक ही कृमि पर स्वचालित विश्लेषण करें । कैमरा स्थापित करने के लिए प्रोटोकॉल, कीड़ा ट्रैकर सॉफ्टवेयर और स्क्रिप्ट ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर विश्लेषण चलाने के लिए Hardaway एट अल.16में विस्तार से वर्णित हैं ।
    2. संक्षेप में, एक गिलास हाजिर एक बरौनी उठाओ, के रूप में मैनुअल विधि में खंड 3.1.2 में वर्णित थाली में एक ही देर L4 स्टेज उभयलिंगी जगह है । समय पर एक कीड़ा के रिकॉर्ड तैराकी वीडियो और शरीर की आवृत्ति की गणना करने के लिए कीड़ा ट्रैकर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
    3. के लिए ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रदान की स्क्रिप्ट का पालन करें कृमि थ्रेशिंग आवृत्ति प्राप्त करने के लिए और कीड़ा से गर्मी नक्शे उत्पंन करने के लिए डेटा थ्रेशिंग ।

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Representative Results

हम SWIP AMPH उपचार द्वारा प्रेरित परख का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं । चित्रा 1 परख सेटअप के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के रूप में ऊपर वर्णित से पता चलता है । मैनुअल परख के लिए, के बारे में 8-10 आयु सिंक्रनाइज़ देर L4 स्टेज कीड़े एक बरौनी या प्लेटिनम लेने के साथ एकत्र कर रहे है और एक गिलास हाजिर २०० mosm के ४० μl के साथ भरा थाली में रखा/एल सुक्रोज (नियंत्रण समाधान) या सुक्रोज के साथ ०.५ मिमी amph और swip के लिए परीक्षण किया ।

जब पशु तैराकी बंद (यानी, प्रदर्शन SWIP), वे जल्दी से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए सिंक और कदम नहीं है । इसलिए, पशुओं के बीच भेदभाव है कि अभी भी पानी की सतह पर जो लोग है कि अच्छी तरह से नीचे स्थिर है पर तैरना बहुत सीधा है । नियंत्रण समाधान में परीक्षण किए गए अधिकांश कीड़े लगातार कम से 10 मिनट तक तैरने जाते हैं, जबकि एमपीएच उपचार के तहत, तेजी से प्रदर्शित होने वाले पशुओं की संख्या उत्तरोत्तर बढ़ जाती है । Swip का प्रदर्शन करने वाले पशुओं की अधिकतम प्रतिशतता1,5,13का उपयोग करने वाले amph की सांद्रता के समानुपाती है । जब dat-1 पीटा (dat-1) कीड़े नियंत्रण समाधान में परीक्षण कर रहे हैं, 40-70% कीड़े 10 मिनट4,13के भीतर swip प्रदर्शन । इस परिणाम झोले के मारे हुए जानवरों के प्रतिशत के लिए तुलनीय है जंगली प्रकार जानवरों में मापा ०.५ मिमी AMPH (चित्रा 2) के साथ इलाज किया.

कीड़े या तो सुक्रोज या amph युक्त सुक्रोज को उजागर अवलोकन के पहले मिनट में swip नहीं दिखा (चित्रा 2) । हालांकि, जबकि कीड़े सुक्रोज के साथ इलाज के लिए 10 मिनट के लिए तैरने जारी, amph के साथ इलाज कीड़े उपचार के 2 मिनट के बाद swip प्रदर्शन शुरू करने के लिए और 10 मिनट के बाद, ६६ ± 3% जानवरों swip शो (चित्रा 2) ।

स्वचालित विश्लेषण के लिए, नियंत्रण या AMPH उपचार के तहत कीड़े के वीडियो एक वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक समय में एक कीड़ा दर्ज कर रहे हैं । एक कंप्यूटर ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर कीड़ा को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है और परिणामस्वरूप डेटा में आयात और सॉफ्टवेयर सूट के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । हरे रंग में लाल और झोले के कीड़े में सक्रिय रूप से चलती पशुओं को प्रदर्शित करने, नियंत्रण या AMPH उजागर करने के लिए पशुओं की गर्मी नक्शे के नमूने, चित्रा 3में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 : परख SWIP के लिए स्थापित किया । Gravid वयस्क जंगली प्रकार (N2) कीड़े सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ लीजड ड थे/ भ्रूण को हैच की अनुमति दी गई और एक शेखर पर 14 ज के लिए M9 बफर में सिंक्रनाइज़ L1 लार्वा में विकसित और फिर NA22 बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त एक NGM प्लेट पर चढ़ाया । के बाद 42-48 एच देर L4 स्टेज लार्वा नेत्रहीन त्रिविमदर्शी के तहत पहचान की गई थी और के साथ या नियंत्रण सुक्रोज समाधान में एम्फ़ैमाइन के बिना एक स्पॉट प्लेट में एक बरौनी उठाओ के साथ उठाया और swip के लिए या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित विश्लेषण के माध्यम से रन बनाए. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : एम्फ़ैटामिन प्रेरित SWIP मैनुअल परख का उपयोग. सुक्रोज या सुक्रोज में कीड़े ०.५ मिमी एम्फ़ैटामिन (amph) के साथ नेत्रहीन swip व्यवहार के लिए बनाए गए हर मिनट एक त्रिविमदर्शी का उपयोग. Swip प्रदर्शन जानवरों का प्रतिशत प्रत्येक बार बिंदु के लिए बीएसए कीड़े की कुल संख्या से झोले के कीड़े की संख्या में विभाजित करके गणना की गई थी, और फिर १०० से परिणाम गुणा । कीड़े का प्रतिशत AMPH को उजागर (नीले चौकों) SWIP दिखा ओवरटाइम बढ़ जाती है, जबकि अनुपचारित कीड़े (लाल घेरे) के लिए 10 मिनट की खिड़की के दौरान तैरने जारी है । द प्रत्येक समूह में परीक्षण किए गए पशुओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । त्रुटि पट्टियां अर्थ (SEM) के मानक त्रुटि इंगित करता है । दो तरह के ANOVA के साथ Bonferroni एकाधिक तुलना परीक्षण (पी < ०.०००१) के प्रदर्शन से सांख्यिकीय महत्व का आकलन किया गया था. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : स्वचालित विश्लेषण के माध्यम से एम्फ़ैटामाइन प्रेरित SWIP. ०.५ मिमी amph के साथ सुक्रोज या सुक्रोज में कीड़े के वीडियो एक छवि एक त्रिविमदर्शी पर घुड़सवार का उपयोग कर दर्ज किया गया । व्यक्तिगत कीड़े के तैराकी वीडियो एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ नज़र रखी और सॉफ्टवेयर सूट ट्रैकिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । गर्मी नक्शे डेटा जहां लाल क्षेत्रों कीड़े कि सक्रिय रूप से बढ़ रहे है दिखाने से उत्पंन किया गया, और हरे क्षेत्रों झोले कीड़े संकेत मिलता है । प्रत्येक प्रायोगिक समूह में 6 पशुओं का प्रतिनिधि होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम सी एलिगेंसमें एक व्यवहार परख, swip, प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल सरल और कोई प्रमुख तकनीकी इस परख बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने बाधाओं के साथ सीधा है । फिर भी, वहां कुछ महत्वपूर्ण पहलू है कि करने के लिए प्रभावी ढंग से परख प्रदर्शन करने के लिए विचार करने की आवश्यकता है ।

देखभाल सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि कीड़े परख के लिए इस्तेमाल किया अच्छी तरह से तंग आ चुके हैं, के बाद से आहार प्रतिबंध17swip प्रभावित करता है । कीड़े की कोमल हैंडलिंग जबकि उठा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय पर सोडियम हाइपोक्लोराइट/NaOH उपचार lysis के दौरान महत्वपूर्ण कदम हैं, उठा के दौरान आघात के रूप में (अधिक आम जब एक प्लेटिनम लेने का उपयोग कर) या सोडियम हाइपोक्लोराइट करने के लिए भ्रूण के विस्तारित प्रदर्शन/ कीड़े18 के लिए स्थाई क्षति के कारण और इस तरह उनके तैरने की क्षमता समझौता ।

संदूषण से बचने के लिए तकनीकों का पालन किया जाना चाहिए । आगर के संदूषण पशुओं के स्वास्थ्य के लिए समझौता किया और इस तरह उनके तैरने की क्षमता बदल । SWIP प्रदर्शित जानवरों के प्रतिशत में मामूली अंतर ई. कोलाई बैक्टीरिया (NA22, OP50, आदि) के विभिन्न उपभेदों के साथ वरीयता प्राप्त आगर प्लेटों का उपयोग कर मनाया जा सकता है । हमारे प्रोटोकॉल में, हम NA22 का उपयोग करने के लिए कीड़े की एक बड़ी संख्या में उपज ।

कांच की जगह प्लेटें, SWIP परख के दौरान इस्तेमाल किया, प्लास्टिक प्लेटों को पसंद कर रहे है क्योंकि वे अच्छी तरह से धोया जा सकता है, autoclaved और फिर से इस्तेमाल किया जब दवाओं के विभिंन प्रकार के परीक्षण कर रहे हैं ।

एक और महत्वपूर्ण कारक एक swip परख में माना जा करने के लिए तरल मीडिया है जिसमें जानवरों के19परीक्षण कर रहे है की परासारिता है । हमारे प्रोटोकॉल में, हम सुक्रोज का उपयोग करने के लिए पानी की परासारिता लाने के लिए २०० mosm/L जो पहले जानवरों के लिए एक इष्टतम शर्त (blakely आरडी. personal संचार) दिखाया गया था । एक नियंत्रित परासारिता के साथ पानी पसंद किया जाता है क्योंकि यह विभिंन दिनों, हफ्तों या महीनों में प्रदर्शन कई assays पर पानी की गुणवत्ता में संभव मतभेदों को समाप्त । विशेष रूप से, dat-1 और जंगली प्रकार amph के साथ इलाज पशुओं swip प्रदर्शन नहीं अगर नमकीन समाधान (जैसे, M9 समाधान) नियंत्रण मीडिया के रूप में उपयोग किया जाता है ।

SWIP को प्रदर्शित करने के लिए अधिकांश जानवरों के लिए आवश्यक समय अलग कृमि चरणों (L1-L4) के बीच थोड़ा बदल सकते हैं । उदाहरण के लिए, Masoudi एट अल. (२०१४) ने बताया कि 5 मिनट के बाद ८०% dat-1 L1 जानवरों को अभी भी तैरना, इस प्रकार केवल जानवरों का 20% swip प्रदर्शन । दूसरी ओर, L4 dat के केवल ५०% -1 जानवरों अभी भी 5 मिनट20के बाद तैरना । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि swip के लिए परीक्षण पशुओं को एक ही उंर में बीएसए हैं । हम अपने परख अनुकूलित किया है हमेशा देर L4 का उपयोग जानवरों का मंचन । देर L4 लार्वा अन्य लार्वा चरणों के बीच आसानी से पहचानने का लाभ है क्योंकि, इस स्तर पर, जानवरों उनके वयस्क आकार तक पहुँच गए हैं और उनके शरीर के केंद्र में सफेद स्थान विभाजित एक विशेषता पतली लाइन प्रदर्शन है कि बाद में होगा एक परिपक्व योनी में अंतर । परख के समय-अवधि भी महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, के बाद 15 मिनट L4 dat के ९०% -1 म्यूटेंट प्रदर्शन swip लेकिन बाद में समय (30 मिनट), उनमें से केवल ६०% प्रदर्शन20swip ।

स्वचालित SWIP परख मानवीय त्रुटियों को समाप्त करने और मैनुअल assays के संबंध में उच्च थ्रपुट स्क्रीनिंग में सुधार । हालांकि, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम समय लगता है क्योंकि वे केवल एक समय में एक कीड़ा ट्रैक कर सकते हैं ।

अंय C. एलिगेंस दा पर निर्भर व्यवहार के संबंध में, swip परख के एक कम समय लेने वाले प्रकार है । उदाहरण के लिए, बेसल को धीमा प्रतिक्रिया2 परख के एक तत्काल प्रकार नहीं है । वास्तव में, कीड़े लंबे समय से दवाओं के साथ खिलाया जा करने की आवश्यकता है, और यह मर्मगति और बंद लक्ष्य प्रभाव में परिणाम सकता है । इस प्रकार, यह दवाओं के लिए स्क्रीन के रूप में प्रभावी नहीं हो सकता है ।

SWIP के प्रमुख अनुप्रयोगों में से एक विभिन्न दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए है कि डोपाइन्सरजिक मार्ग को लक्षित. मामलों में जहां दवाओं पानी में घुलनशील नहीं हैं (जैसे, mazindol), उचित dilutions सांद्रता प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए जहां वाहक समाधान कीड़े करने के लिए विषाक्त नहीं है । इसके अलावा, यदि एक ही दवा के विभिंन सांद्रता5,13,14, खुराक-प्रतिक्रिया घटता भी विश्लेषण किया जा सकता है इस्तेमाल किया जाता है । उदाहरण के लिए, प्रगति की दर (प्रति मिनट पशुओं की वक्र की ढलान, चित्रा 2) एकाग्रता के समारोह के रूप में रिपोर्ट किया जा सकता है और विभिंन दवाओं के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया (जैसे, amph बनाम कोकीन) ।

जब SWIP का उपयोग करने के लिए दवाओं की कार्रवाई के तंत्र की जांच करने के लिए डोपाइन्नरजिक synapses, ध्यान दिया जाना चाहिए यदि परिणाम अन्य जानवरों के लिए विस्तारित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, इमीप्रामीन, स्तनधारी नोरेपिनेरीन ट्रांसपोर्टर (नेट) के एक विशिष्ट अवरोध को द2 पशुओं में दा-मध्यस्थता SWIP प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया गया है । C. एलिगेंस norepinephrine को संश्लेषी नहीं करता है और परिणामतः नेट व्यक्त नहीं करता है । हालांकि, सी. एलेगेंस डीए ट्रांसपोर्टर शेयर समजातता के साथ स्तनधारी नेट21। इस कारण से, दवाओं है कि स्तनधारी नेट के विशिष्ट inhibitors रहे है और स्तनधारी dat पर सीमित प्रभाव है (जैसे, imipramine) सी. एलिगेंस dat को उच्च चयनात्मकता दिखाओ । इस प्रकार, प्रजातियों चयनात्मकता हमारे करने के लिए C. एलिगेंस से निष्कर्ष एक्सट्रपोलेट करने की क्षमता को सीमित हो सकता है मनुष्यों के लिए ।

सबसे महत्वपूर्ण कारक पर विचार करने के लिए जब SWIP assays डिजाइन प्रयोग है कि SWIP डोपनेनरजिक प्रणाली द्वारा मध्यस्थता की है साबित करने का समावेश है । वास्तव में, बिगड़ा तैराकी डीए प्रणाली (जैसे, मांसपेशियों में संकुचन में सामांय दोष) से संबंधित जीन के अलावा अंय कारकों द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि SWIP वास्तव में DA द्वारा मध्यस्थता की गई है, प्रोटोकॉल्स में उन जंतुओं के साथ किए गए प्रयोग शामिल होने चाहिए जिनमें मंहगाई समाप्त हो गई है । यह या तो पीटकर जानवरों बिल्ली की अभिव्यक्ति की कमी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है -2, tyrosine hydroxylase, जो दर-दा संश्लेषण के लिए एंजाइम सीमित है की सी एलिगेंस homologue, या पूर्व के द्वारा-reserpine के साथ जंगली प्रकार के जानवरों के इलाज, एक दवा है कि3पीव से मंहगाई घट जाती है । उदाहरण के लिए, मैकडॉनल्ड्स एट अल.3 पता चला है कि बेसल swip dat-1 म्यूटेंट में मनाया जब इन जानवरों reserpine के साथ पूर्व इलाज किया गया था बरामद किया गया था । इस परिणाम से पता चलता है कि SWIP DA-mediated है । दूसरी ओर, बिल्ली का उपयोग कर -2, dat-1 और ंयूटेंट dopaminergic रिसेप्टर्स में से प्रत्येक की अभिव्यक्ति की कमी, safratowich एट अल. (२०१४) का प्रदर्शन किया है कि ट्रेस amine β-phenylethylamine (βpea) उपचार के 1 मिनट के भीतर swip लाती स्वतंत्र रूप से डीए से लेकिन ligand के प्रत्यक्ष सक्रियण-gated आयन चैनल LGC-५५14। लेखकों ने दिखाया कि βPEA-और दा प्रेरित SWIP यंत्रवत् अलग हैं और वे आसानी से प्रयोगात्मक रूप से भेदभाव किया जा सकता है । वास्तव में, जबकि βPEA-प्रेरित SWIP दा है और dop-3-स्वतंत्र, यह 1 मिनट के भीतर अधिक से अधिक मूल्यों तक पहुँचता है और तेजी से कम हो जाती है 2 मिनट14के बाद, DA-mediated swip कैट-2 और dop-3 निर्भर है और अनिवार्य रूप से शून्य के बाद 1 मिनट (चित्रा 2) । इस प्रकार, वहां समय अधिकतम प्रभाव तक पहुंचने के लिए आवश्यक में एक बड़ा अंतर है, और यह जल्दी से दो घटनाओं के बीच भेदभाव करने की अनुमति देता है: 1) 1 मिनट के भीतर तेजी से βPEA प्रेरित SWIP LGC-५५ चैनल और 2 के प्रत्यक्ष सक्रियण द्वारा प्राप्त की धीमी गति से DA-mediated SWIP जो तब होता है जब extracellular दा के एक अधिशेष समय (10-15 मिनट) और DA रिसेप्टर्स DOP-3 के ऊपर बनाता है overstimulated3हैं ।

अंत में, प्रयोगों का सही सेट है, जो dopaminergic प्रणाली (कैट-2, dat-1, dop-3) के प्रमुख खिलाड़ी जीन के लिए पीटकर जानवरों का उपयोग शामिल है और दा भंडार (reserpine) घट दवाओं के उपयोग के साथ, swip गया है एएमपीएच5,13, βpea14,15 और अजाफोन6जैसी औषधियों की क्रियाविधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक के लिए डॉ. ओसामा SWIP के स्वचालित विश्लेषण के साथ मार्गदर्शन के लिए Dr. रेंडी है Blakely प्रयोगशाला से Refai शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम NIH R01 DA042156 से नियंत्रण रेखा से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil Reynolds wrap 1091835
Amphetamine Sigma 51-63-8  
Autoclave
Bacterial Incubator New Brunswick scientific M1352-0000
Bacteriological grade, Agar Lab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) Peptone BD REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Thorlabs U-CMAD3
Centrifuge  Eppendorf 5810R 15amp E215059
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5
Deionized water Millipore Z00QSV0WW Milli-Q
Depression glass spot plate Corning Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask ThermoFisher 4103-0250PK
Eye lash
Glass slide Fisherbrand 12-550-15
Graphing and statistical software Prism Graphpad 5
HEPES Sigma-Aldrich RB=H3375 & H7006
Hypochlorite Hawkins Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller Fisher BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate) Sigma-Aldrich RB=M0250 500 g
Magnesium sulfate (heptahydrate) Sigma-Aldrich M1880
Magnetic stir bar Fisherbrand 16-800-510 
Microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
NA 22 bacteria CGC
Nystatin Sigma 1400-61-9
Osmometer Advanced Instruments, Inc Model 3320
Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20A
Petriplates Falcon 351007
pH Meter Orion VersaStar Pro IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes Falcon 352095
Potassium Chloride Sigma-Aldrich  P9541
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 7778-77-0
Potassium Phosphate - DIBASIC Sigma-Aldrich P-8281
Potassium Phosphate - MONOBASIC Sigma-Aldrich P0662
Serological pipettes VWR 10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific 55S 12x16
Sodium Chloride Fisher RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate Fisher RB=S381
Spreadsheet MS office Microsoft Excel
Stereo Microscope Zeiss Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips Various 02-707-400
Sucrose Sigma-Aldrich RB=S5016
Superglue Loctite 1647358 .14 oz.
SwimR sofware 10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2 Worm Tracker 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software Virtualdub http://www.virtualdub.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli, L. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (146), e59243, doi:10.3791/59243 (2019).

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