Summary
السباحة التي يسببها الشلل (سويب) مقايسة سلوكية راسخة المستخدمة لدراسة الآليات الكامنة الدوبامين إشارات في ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس). ومع ذلك، تفتقر إلى طريقة مفصلة للقيام التحليل. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة سويب.
Abstract
مقايسة السباحة الموصوفة في هذا البروتوكول هو أداة صالحة لتحديد البروتينات التي تنظم تتميز synapses. مماثلة للثدييات، الدوبامين (DA) يتحكم في عدة مهام في C. ايليجانس بما في ذلك النشاط الحركي والتعلم. الظروف التي تحفز دا الإصدار (مثلاً، علاجات المنشطات (أمف)) أو التي تمنع إزالة دا (مثل الحيوانات التي تفتقر إلى الناقل دا (دات-1) التي هي غير قادرة على ريككومولاتينج دا إلى الخلايا العصبية) توليد فائض في دا خارج الخلية وفي نهاية المطاف أدى إلى تحول دون تنقل. هذا السلوك واضح بصورة خاصة عند الحيوانات تسبح في المياه. في الواقع، بينما لا تزال الحيوانات البرية من نوع السباحة لفترة ممتدة، طفرات فارغة دات-1 والبرية من نوع تعامل مع أمف أو مثبطات للناقل دا تنزل إلى أسفل البئر ولا تتحرك. ويطلق على هذا السلوك "الشلل الناجم عن السباحة" (سويب). على الرغم من أن التحليل سويب بشكل جيد، تفتقر إلى وصف مفصل للأسلوب. وهنا يصف لنا دليل خطوة بخطوة لتنفيذ سويب. للقيام التحليل، توضع أواخر الحيوانات 4 مرحلة اليرقات في صفيحة بقعة زجاج الذي يحتوي على محلول السكروز التحكم مع أو بدون أمف. وسجل الحيوانات لسلوكهم السباحة أما يدوياً بواسطة التصور تحت ستيريوسكوبي أو تلقائياً بتسجيل مع كاميرا محمولة على ستيريوسكوبي. ويتم تحليل أشرطة الفيديو ثم استخدام برنامج تعقب، الذي يعطي تمثيل مرئي لسحق التردد والشلل في شكل خرائط الحرارة. ضمان قراءات يمكن قياسها بسهولة من السباحة قدرة الحيوانات النظامين اليدوي والآلي ومما يسهل الفرز للحيوانات إذ تضع الطفرات داخل منظومة تتميز أو للجينات مساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام سويب لتوضيح إليه العمل من المخدرات لتعاطي مثل أمف.
Introduction
الحيوانات أداء مجموعة متنوعة من السلوكيات الفطرية والمعقدة التي هي توسط العصبية المختلفة في تنسيق عمليات إرسال الإشارات معقدة. الناقل العصبي الدوبامين (DA) يتوسط السلوكيات العالية حافظ عبر الأنواع، بما في ذلك التعلم ووظيفة الحركة وتجهيز مكافأة.
ديدان أسطوانية التربة C. ايليجانس، مع نظام عصبي بسيط نسبيا وكذلك معين يتكون من 302 فقط من الخلايا العصبية، يبين السلوكيات ملحوظ المعقدة، بما في ذلك العديد من التي ينظمها دا مثل التزاوج، والتعلم، والمؤن، والحركة ووضع البيض 1-من بين الميزات الأخرى، دورة حياة قصيرة، وسهولة المناولة والحفاظ على إشارات الجزيئات، تسليط الضوء على مزايا استخدام C. ايليجانس كنموذج لدراسة العصبية أساس السلوكيات مصانة.
خنثي C. ايليجانس يحتوي على ثمانية تتميز الخلايا العصبية؛ وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن الذكور ستة أزواج إضافية لأغراض التزاوج. كما هو الحال في الثدييات، وتوليف دا هذه الخلايا العصبية والتعبير عن الناقل دا (دات-1)، بروتين غشائي موجودة حصرا في تتميز الخلايا العصبية، الذي ينقل دا صدر في المشقوق متشابك العودة إلى الخلايا العصبية تتميز. وعلاوة على ذلك، معظم البروتينات المشاركة في كل خطوة من التوليف والتعبئة والتغليف والإفراج عن دا هي المحافظة جداً بين البشر والديدان، ومثل في الثدييات، دا ينظم سلوكيات التغذية والحركة في ايليجانس جيم-2.
C. ايليجانس يزحف على السطوح الصلبة وتسبح مع سلوك سحق مميزة في المياه. من المثير للاهتمام، طفرات تفتقر إلى التعبير عن دات-1 (دات-1) الزحف عادة على سطح صلب، لكنهم فشلوا في الحفاظ على السباحة عندما مغمورة بالمياه. ووصف هذا السلوك كان الشلل الناجم عن السباحة، أو سويب. التجارب السابقة أثبتت أن سويب، جزئيا، ناجم عن وجود فائض دا في المشقوق متشابك التي أوفيرستيمولاتيس في نهاية المطاف مستقبلات D2 مثل بوستسينابتيك (DOP-3). على الرغم من أن المحددة أصلاً في دات-1 خروج المغلوب الحيوانات3، سويب ويلاحظ أيضا في الحيوانات البرية من نوع التعامل مع المخدرات أن كتلة النشاط دات (مثلاً، إيميبرامين4) و/أو حمل الإصدار دا (مثل الأمفيتامين5). من ناحية أخرى، منع التلاعب دوائية أو الجينية تجنب التوليف والإفراج عن دا وحظر إعلان المبادئ-3 وظيفة مستقبلات سويب6. أخذت معا، وهذه البيانات المنشورة بالفعل أنشأت سويب كأداة موثوقة دراسة الآثار السلوكية الناتجة عن البروتينات تحور داخل تتميز نهايات3،،من47 والتي ستستخدم شاشات الجينية إلى الأمام لتحديد مسارات تنظيمية رواية المتورطين في دا مما يشير إلى7،،من89،10،،من1112. بالإضافة إلى ذلك، من خلال توفير قراءات يمكن قياسها بسهولة من السلوك الناجم عن المخدرات في الحيوانات الحية، سويب يتيح توضيح آليات عمل الأدوية مثل الأمفيتامين (أمف) وأزابيروني في تتميز سينابسيس5، 6 , 13 , 14 , 15.
وقد وصف بروتوكولات لإجراء فحوصات سويب قبل16. هنا، نحن تصف بالتفصيل المنهجية والإعداد لإجراء التحليل بهدف توفير دليل مرئي للمجتمع C. ايليجانس لفعالية أداء سويب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الحلول ووسائل الإعلام
- إعداد المخزن المؤقت M9 بتذويب خ2بو4 ز 3.0 (22.05 مم)، غ2هبو4 ز 6.0 (42.2 مم)، وكلوريد الصوديوم 5.0 g (85.5 ملم) في 1 لتر مياه يعقم. إضافة مل 1.0 من 1 م MgSO4 (ز 12 في وحدة تخزين نهائي من 100 مل يعقم المياه.) بعد التعقيم. مزيج 100 مل من x 10 الناتج M9 مع 900 مل من يعقم منزوع الماء لجعل حل 1 x.
- لجعل البيض المخزن المؤقت، حل 6.896 ز من كلوريد الصوديوم (118 ملم)، 3.578 ز بوكل (48 مم)، ز 0.294 كاكل2-2 ح2س (2 مم)، ز 0.406 مجكل2-6 ح2س (2 مم) و 5.958 ز (25 مم) من حبيس في 1 لتر مياه يعقم. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد حل جديدة تحت كلوريت الصوديوم/هيدروكسيد الصوديوم بإضافة 1 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5-6% (التبييض) وميليلتر 180 من 10 N هيدروكسيد الصوديوم إلى 3.8 مل مياه.
- تزن 60 ز السكروز وتذوب في الماء منزوع يعقم إلى وحدة تخزين نهائي من 100 مل جعل 60% من محلول السكروز.
- حل ز 0.684 السكروز في 10 مل من يعقم المياه جعل السكروز 200 ملم. فحص وضبط لنفس اسموليه استخدام أوسموميتير. جعل مختبرين 1 مل في 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي وتجميد في-20 درجة مئوية.
- وزن ز 0.184 من أمف (الوزن الجزيئي 184.75 g/mol) وتذوب في 10 مل مياه لجعل حل أسهم 100 مم. ميكس 2 ميليلتر من الحل الأسهم في 400 ميليلتر من الماء لجعل الحل العامل 0.5 مم.
-
يعد النمو المغذيات لوحات إعلامية (NGM)
- ز 3 مزيج من كلوريد الصوديوم (52.65 ملم)، 20 غراما ببتون، 25 جرام من بكتو أجار و 975 مل من المياه في قارورة Erlenmeyer ل 2. وتشمل بار إثارة المغناطيسية والاوتوكلاف (121 درجة مئوية، 15 PSI) لمدة ساعة واحدة باستخدام دورة السائل.
- كول إلى والحفاظ على درجة حرارة حوالي 50 درجة مئوية بوضع في قارورة على سخان أثناء التحريك. إضافة 0.5 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الإيثانول)، 1 مل 1 م MgSO4، 1 مل من كاكل 1 م2 و 25 مل من م 1 البوتاسيوم الفوسفات المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.4 (108.3 ز خ2ص4، ز 35.6 ك2هبو4 ، منزوع الماء إلى 1 لتر).
- "الماصة؛" 25 مل في لوحات بيتري 100 ملم × 15 ملم، والسماح لوسائل الإعلام لترسيخ. تخزين لوحات رأسا على عقب عند 4 درجة مئوية في مربع لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
-
إعداد مرق مرق (رطل) ليسوجيني
- حل 5 غ مزيج مسحوق رطل في 200 مل مياه في قارورة Erlenmeyer. دورة اﻷوتوكﻻف لمدة 30 دقيقة استخدام التعقيم السائل. تسمح المرق ليبرد. تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 أسابيع.
-
إعداد لوحات البكتيرية NA22
- استخدام تلميح ماصة معقمة أو حلقة جرثومي عقيمة لمتتالية صفيحة رطل مع كمية صغيرة من بكتيريا NA22 كولاي من مخزون والغليسيرول واحتضان اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية، بين عشية وضحاها تنمو المستعمرات المعزولة. اختيار وإدخال مستعمرة واحدة في 200 مل مرق LB إعدادها في الخطوة 1.8 واسمحوا تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على منصة تهتز.
- أن البذور اللوحات، الاستغناء عن 200 ميليلتر من ثقافة البكتيرية على لوحات NGM أعدت في وقت سابق في خطوة 1.7 وانتشرت بعصا هوكي زجاج عقيمة. واسمحوا لوحات الجاف بين عشية وضحاها أو لم يعد تحت غطاء محرك السيارة وتخزين رأسا على عقب في مربع محكم في 4 درجات مئوية.
- لجعل الأداة جفن/البلاتين لاختيار الديدان، الصق جفن سميك أو خيوط البلاتين في زجاج باستور "الماصة؛" استخدام الغراء سوبر. قص طرف جفن زاوية باستخدام شفرة حلاقة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام موقد بنسن لإذابة غيض ماصة زجاجية حول خيوط البلاتين.
2-تربية C. ايليجانس
ملاحظة: الثقافة البرية من نوع N2C-ايليجانس ضغطاً على لوحات NA22 الإشريكيّة القولونية . يتم وصف الأساليب ثقافة مفصلة أدناه.
-
إعداد الثقافة دودة
- جعل ثقافة كاتب من الديدان، قطع قطعة صغيرة من أجار من صفيحة تحتوي على تغذية جيدة الحيوانات وتحويلها إلى لوحة بكتيريا NA22 كولاي إعدادها في الخطوة 1.9 استخدام ملعقة عقيمة. احتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. تحت مجهر ستيريو، بصريا تأكيد وجود جرابيد الكبار.
-
إعداد السكان متزامنة من الديدان
- جمع جرابيد الكبار من لوحات 2 على الأقل بالاستغناء عن المياه يعقم جميع أنحاء اللوحة باستخدام زجاجة بخ. دوامة لوحة لطرد الديدان وجمع الديدان في أنبوب مخروطي البوليستيرين 15 مل باستخدام ماصة بلاستيك القابل للتصرف لطف.
- تدور أسفل الأنبوبة في أجهزة الطرد مركزي في 140 س ز 2 دقيقة لبيليه الديدان، ثم نضح قبالة طافية باستخدام مضخة فراغ أو مع بني في فراغ المختبر.
- ريسوسبيند وغسل الديدان عن طريق ملء الأنبوب مع يعقم المياه. ومزيج وأجهزة الطرد المركزي في العاشر 140 غ للحد الأدنى 2 نضح المادة طافية وكرر هذا آخر الخطوة الثانية أكثر من مرة أو حتى الديدان واضحة من البكتيريا (المياه يبدو واضحا عندما مختلطة مع الديدان).
- إضافة 5 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم تقدم طازجة/هيدروكسيد الصوديوم (الخطوة 1، 3) إلى بيليه دودة واستخدام دوامة مزيج سريعاً. احتضان الأنبوب في الروك لحوالي 4-8 دقيقة. وقت الحضانة بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم/هيدروكسيد الصوديوم يتراوح بين 4-8 دقائق استناداً إلى نوعية الحل الأسهم تحت كلوريت الصوديوم (التبييض).
- وضع قطره (2-50 ميليلتر) من محلول يحتوي على الديدان على شريحة الميكروسكوب زجاجية والاختيار في كل دقيقة 2 تحت المجهر لتحلل دودة. عندما يتم تفكيك حوالي 70% الديدان ويتم الإفراج عن البيض، ملء الأنبوب مع البيض المخزن المؤقت إعداد في الخطوة 1، 2 والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 140 x ز بيليه الأجنة والدودة الذبائح فورا.
- نضح المادة طافية وتغسل بيليه 3 مرات أكثر عن طريق ملء الأنبوب في كل مرة مع المخزن المؤقت للبيض. زيادة ونقصان لأسفل في 140 x ز لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية في كل مرة. بيليه يتحول أبيض في نهاية يغسل.
- بعد الغسيل النهائي، فصل الأجنة من جثث القتلى في محلول السكروز 30%. إضافة 5 مل من يعقم المياه إلى بيليه، ريسوسبيند، وإضافة 5 مل سكروز 60% إعدادها في الخطوة 1، 4. مزيج دقيق والطرد المركزي في 160 x ز لمدة 6 دقائق.
- استخدام زجاج ماصة باستور لنقل الأجنة العائمة في غضروف العلوي في أنبوب مخروطي طازجة 15 مل. لا تأخذ أكثر من 3-4 مل. لإزالة أي السكروز المتبقية، تغسل الأجنة 3 مرات مع يعقم المياه التي سينتريفوجينج في العاشر 140 غ لمدة 3 دقائق، إزالة المادة طافية وريسوسبيندينج بيليه (وملء الأنبوب) في كل مرة.
- كرر يغسل مع المخزن المؤقت x M9 1. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند بيليه في 10 مل M9. ترك هذه الأنابيب على شاكر بين عشية وضحاها (أي أكثر من 14 h) للبيض يفقس إلى يرقات L1. الديدان ستبقى في مرحلة اليرقات L1 الواجبة لنقص الأغذية.
- ريسوسبيند اليرقات الغسيل L1 3 مرات مع يعقم ماء لإزالة أي الفيرومونات أصدرته اليرقات سينتريفوجينج في 140 س ز 2 دقيقة اليرقات في 1 مل من الماء. تجعل من 01:10 إضعاف الديدان في الماء، "الماصة؛" قطره 10 ميليلتر على شريحة زجاجية ووضع ساترة على وإحصاء عدد الديدان تحت ستيريوسكوبي. كرر هذه العملية مرتين ومتوسط النتائج.
- ماصة حجم الديدان يتوافق مع الديدان 1,000 تقريبا على صفيحة NA22 (التي عرضت سابقا على درجة حرارة الغرفة) عن طريق وضع الصغيرة يسقط على اللوحة. اترك اللوحة نصف مفتوحة حتى يجف القطرة. ثم تغطي صفيحة واحتضان رأسا على عقب في حاضنة 20 درجة مئوية لحوالي 44-48 ساعة أو حتى الديدان تصل إلى المرحلة L4 المتأخرة، كما أكد بصريا تحت ستيريوميكروسكوبي. الآن على استعداد لاختبار سويب الديدان.
3-سويب
ملاحظة: ونحن تصف الأسلوب اليدوي لتقييم سويب في البرية من نوع الديدان تعامل مع أمف. نحن نناقش بإيجاز أيضا تتبع الديدان وإجراء مزيد من التحليل لحركية الدودة تستخدم تعقب دودة الآلي وبرمجيات تتبع التي وصفت سابقا هارداواي et al.10.
-
الأسلوب اليدوي لاختبار سويب
- اليكووت 40 ميكروليتر من محلول السكروز موسم/لتر 200 أما مع أو بدون 0.5 مم أمف في لوحة بقعة زجاج. تحت ستيريوسكوبي، اختيار اختيار المرحلة المتأخرة L4 8-10 الديدان مع جفن أو البلاتين وتغرق بيك في اللوحة التي تحتوي على الحل حتى الانتقال خارج الانتقاء الديدان وتسبح في الحل. ملاحظة عدد الديدان التي التقطت في البئر، وبدء تشغيل جهاز ضبط الوقت، ومراقبة وتسجيل عدد الديدان العارضة سويب في كل علامة دقيقة.
- انسخ البيانات الخام إلى جدول بيانات وحساب النسبة المئوية للديدان مشلولة بقسمة عدد الديدان بالشلل في كل دقيقة بالعدد الإجمالي للديدان اختبارها طوال المقايسة وأضرب 100. نسخ قيم النسبة المئوية إلى أي رسوم بيانية وتنسيق البيانات مع قيم النسبة المئوية على المحور Y والوقت على محور باستخدام الرسم البياني XY X البرمجيات الإحصائية والأرض.
- أداء ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعاً بتحليل الوظائف المخصصة (مثلاً، بعد اختبار بونفيروني) لاختبار دلالة إحصائية بين التحكم والجماعات أمف وقت المعاملة.
-
التحليل الآلي من سويب
- إجراء تحليل الآلي على دودة واحدة في وقت واحد. البروتوكول لتعيين إعداد الكاميرا وبرامج تعقب دودة والبرنامج النصي لتشغيل برامج تتبع التحليل يتم وصف بالتفصيل في هارداواي et al.16.
- بإيجاز، ضع واحد من أواخر خنثي مرحلة L4 في صفيحة بقعة زجاج الاستفادة انتقاء جفن، كما هو موضح في الطريقة اليدوية في قسم 3.1.2. تسجيل الفيديو سباحة من دودة واحدة في الوقت واستخدام برامج تعقب دودة لحساب تواتر الانحناءات الجسم.
- اتبع البرنامج النصي المتوفرة مع برنامج التعقب للحصول على وتيرة سحق دودة وتوليد خرائط الحرارة من دودة إتلاف البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونقدم مثالاً للمقايسة سويب الناجمة عن العلاج أمف. ويبين الشكل 1 تمثيل تخطيطي لإعداد المقايسة كما هو موضح أعلاه. للفحص اليدوي، وحوالي 8-10 سن L4 متزامنة أواخر المرحلة الديدان يتم جمعها مع جفن أو البلاتين بيك ووضعها في لوحة زجاج بقعة مليئة ميليلتر 40 200 السكروز موسم/لتر (حل السيطرة) أو السكروز مع 0.5 مم أمف واختبارها سويب.
عند توقف الحيوانات السباحة (أي، يحمل سويب)، أنها سرعان ما تنزل إلى أسفل البئر ولا تتحرك. ولذلك، للتمييز بين الحيوانات التي لا تزال تسبح على سطح الماء مقابل تلك التي ثابتة في أسفل البئر بسيط جداً. اختبار معظم الديدان في السباحة حل التحكم بشكل مستمر لمدة 10 دقائق على الأقل، بينما يزيد عدد الحيوانات العارضة سويب تدريجيا تحت العلاج أمف،. النسبة المئوية القصوى للحيوانات العارضة سويب يتناسب مع تركيز أمف تستخدم1،،من513. عندما يتم اختبار دات-1 خروج المغلوب (دات-1) الديدان في حل السيطرة، يحمل الديدان 40-70% سويب ضمن 10 دقائق4،13. هذه النتيجة مماثلة للنسبة المئوية للحيوانات شلت تقاس في الحيوانات البرية من نوع تعامل مع 0.5 مم أمف (الشكل 2).
لا تظهر الديدان مكشوف أما السكروز أو السكروز التي تحتوي على أمف سويب في الدقيقة الأولى من المراقبة (الشكل 2). ومع ذلك، بينما لا تزال الديدان تعامل مع السكروز السباحة لمدة 10 دقائق، بدء الديدان تعامل مع أمف يحمل سويب بعد دقيقتين علاج، وبعد 10 دقائق، وإظهار 66 ± 3% الحيوانات سويب (الشكل 2).
وتسجل للتحليل الآلي، وأشرطة فيديو ديدان تحت السيطرة أو علاجات أمف دودة واحدة في وقت واحد باستخدام برنامج تسجيل فيديو. تتبع برامج كمبيوتر يتم استخدامه لتتبع سحق دودة واستيرادها إلى البيانات الناتجة وتحليلها مع الدعوى البرمجيات. نماذج خرائط الحرارة من الحيوانات المعرضة لعنصر التحكم أو أمف، عرض نشاط نقل الحيوانات في الديدان الحمراء وشلت باللون الأخضر، تظهر في الشكل 3.
الشكل 1 : إعداد مقايسة سويب. تم تفكيك جرابيد الكبار البرية من نوع (N2) الديدان مع العلاج تحت كلوريت الصوديوم/هيدروكسيد الصوديوم للإفراج عن الأجنة. يسمح تفقس وتتحول إلى يرقات L1 متزامنة في M9 المخزن المؤقت لح 14 عن شاكر الأجنة وثم مطلي على صفيحة NGM المصنف مع البكتيريا NA22. بعد 42-48 ساعة L4 أواخر مرحلة اليرقات بصريا المحددة بموجب ستيريوسكوبي وانتقاء مع اختيار جفن في لوحة بقعة مع أو بدون المنشطات في محلول السكروز التحكم وسجل سويب أما يدوياً أو من خلال التحليل الآلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : سويب الناجمة عن المنشطات باستخدام الفحص اليدوي- وسجل الديدان في السكروز أو السكروز مع الأمفيتامين 0.5 مم (أمف) كانت بصريا للسلوك سويب كل دقيقة باستخدام ستيريوسكوبي. المئة من الحيوانات سويب العارضة تم حسابها بقسمة العدد شل الديدان بالعدد الإجمالي للديدان جزيئي لكل نقطة من الوقت ومن ثم ضرب النتيجة 100. النسبة المئوية من الديدان يتعرض إلى أمف (المربعات الزرقاء) عرض سويب الزيادات الإضافي، بينما لا تزال الديدان غير المعالجة (دوائر حمراء) للسباحة خلال نافذة بعد 10 دقائق. N تمثل عدد الحيوانات التي اختبرت في كل مجموعة. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي للوسائل (SEM). وقيمت دلالة إحصائية عن طريق إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه مع بونفيروني التجارب المقارنة متعددة (ف < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : سويب الناجمة عن المنشطات عن طريق التحليل الآلي- وسجلت أشرطة فيديو ديدان في السكروز أو السكروز مع 0.5 مم أمف باستخدام كاميرا محمولة على ستيريوسكوبي. كليب سباحة من الديدان الفردية تم تعقبها مع برمجيات تتبع وتحليلها باستخدام تتبع البرنامج الدعوى. تم توليد خرائط الحرارة من البيانات حيث المناطق الحمراء تظهر الديدان التي تتحرك بنشاط، والمساحات الخضراء تبين الديدان مشلولة. كل مجموعة تجريبية هو الممثل للحيوانات 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للقيام تحليل السلوكي، سويب، في C. ايليجانس. هذا البروتوكول بسيط ومباشر مع لا عقبات فنية رئيسية مما يجعل هذا الفحص المستخدم جداً ودية. ومع ذلك، هناك بعض الجوانب الهامة التي تحتاج إلى النظر فيها من أجل القيام بفعالية المقايسة.
وينبغي الحرص على ضمان أن الديدان المستخدمة للفحص تغذية جيدة، نظراً للقيود الغذائية يؤثر سويب17. لطيف معالجة الديدان أثناء الانتقاء كما جيدا كما توقيت العلاج تحت كلوريت الصوديوم/هيدروكسيد الصوديوم أثناء تحلل الخطوات الحاسمة، كما يمكن أن الصدمات أثناء الانتقاء (أكثر شيوعاً عند استخدام اختيار البلاتين) أو التعرض لمدة طويلة للأجنة للحل تحت كلوريت الصوديوم/هيدروكسيد الصوديوم يتسبب في ضرر دائم ل الديدان18 ومما يعرض للخطر قدرتها على السباحة.
وينبغي اتباع تقنيات عقيمة لتجنب التلوث. تلوث ألواح أجار يهدد صحة الحيوانات ويغير وبالتالي قدرتهم على السباحة. ويمكن ملاحظة اختلاف طفيف في النسبة المئوية للحيوانات العارضة سويب استخدام لوحات أجار المصنف مع سلالات مختلفة من البكتيريا كولاي (NA22، OP50، إلخ.). نستخدم في أعمالنا البروتوكول، NA22 أن تسفر عن عدد كبير من الديدان.
ألواح الزجاج-سبوت، تستخدم أثناء الفحص سويب، يفضل أن الصفائح البلاستيكية نظراً لأنها يمكن أن تكون دقة غسلها، يعقم وإعادة استخدامها عندما يتم اختبار أنواع مختلفة من المخدرات.
عامل مهم آخر سينظر في مقايسة سويب هو الاسموليه لوسائل الإعلام السائلة التي هي الحيوانات المختبرة19. نستخدم في أعمالنا البروتوكول، السكروز لجلب الاسموليه للماء حتى موسم 200/لتر الذي كان سابقا تبين أن شرط أمثل للحيوانات (ش بلاكلي الاتصال الشخصي). المياه مع اسموليه التي تسيطر عليها المفضل لأنه يقضي على الاختلافات المحتملة في نوعية المياه على مدى عدة فحوصات أجريت في مختلف أيام أو أسابيع أو أشهر. جدير بالذكر أن دات-1 والحيوانات البرية من نوع تعامل مع أمف لا يحمل سويب إذا الحلول المالحة (مثلاً، حل M9) تستخدم كمراقبة وسائل الإعلام.
يمكنك تغيير الوقت اللازم لمعظم الحيوانات يحمل سويب قليلاً بين مراحل مختلفة من دودة (L1-L4). على سبيل المثال، مزودي et al. (2014) ذكرت أن بعد 5 دقائق 80% من الحيوانات دات-1 L1 لا يزال السباحة، وهكذا 20% فقط من الحيوانات يحمل سويب. من ناحية أخرى، لا يزال 50 في المائة فقط من الحيوانات دات-1 L4 السباحة بعد 5 دقائق20. ولذلك، من المهم أن الحيوانات اختبار سويب هي جزيئي في نفس السن. نحن الأمثل لدينا المقايسة تستخدم دائماً أواخر L4 نظموا الحيوانات. أواخر L4 اليرقات لها ميزة كونها يمكن التعرف عليه بسهولة من بين المراحل اليرقات الأخرى لأنه، في هذه المرحلة، قد بلغ حجمها الكبار الحيوانات ويحمل خط رفيع مميزة تقسيم بقعة بيضاء في وسط الجسم الذي سيتم في وقت لاحق تفرق في الفرج ناضجة. فترة الزمنية للمقايسة الأهمية أيضا. على سبيل المثال، بعد 15 دقيقة يحمل 90% طفرات دات-1 L4 سويب ولكن في وقت لاحق (30 دقيقة)، المعرض 60 في المائة فقط منهم سويب20.
والرزن سويب الآلي يزيل الأخطاء البشرية ويحسن الفرز الفائق فيما يتعلق بالاختبارات اليدوية. ومع ذلك، تتبع البرامج برامج تستغرق وقتاً طويلاً نظراً لأنهم فقط تتبع دودة واحدة في وقت واحد.
فيما يتعلق بالسلوكيات C. ايليجانس دا-تعتمد على الأخرى، سويب نوع أقل استهلاكاً للوقت للمقايسة. على سبيل المثال، استجابة تباطؤ القاعدية2 ليست فورية نوع تحليل. وفي الواقع، الديدان بحاجة إلى تغذية مزمن بالعقاقير، وهذا يمكن أن يسفر عن آثار الاختراق وخارج الهدف. وهكذا، قد لا تكون فعالة الكشف عن المخدرات.
واحد من التطبيقات الرئيسية سويب هو الشاشة للمخدرات المختلفة التي تستهدف مسار تتميز. في الحالات حيث المخدرات لا للذوبان في الماء (مثلاً، مازيندول)، ينبغي إجراء تخفيف السليم لتحقيق تركيزات حيث حل الناقل ليست سامة للديدان. وعلاوة على ذلك، إذا كانت تركيزات مختلفة من الدواء نفسه يستخدم5،،من1314، منحنيات الاستجابة للجرعة يمكن أيضا أن تحلل. على سبيل المثال، يمكن ذكر كدالة للتركيز معدل التدرج (انحدار منحنى الحيوانات الدقيقة، الشكل 2) والمستخدمة لمقارنة آثار المخدرات مختلفة (مثلاً، أمف مقابل الكوكايين).
عندما يتم استخدام سويب التحقيق في إليه عمل المخدرات عند نهايات تتميز، ينبغي إيلاء اهتمام إذا كانت النتائج هي تمديد للحيوانات الأخرى. على سبيل المثال، إيميبرامين، مثبط محددة من الناقل إفراز الثدييات (صافي) وقد استخدمت للحث على التوسط دا سويب في N2 الحيوانات4. C. ايليجانس لا عدم إفراز سينثيتيزي ونتيجة لذلك لا يعبر عن صافي. ومع ذلك، تشاطر الناقل C. ايليجانس دا التماثل مع الصافي الثدييات21. ولهذا السبب، تظهر العقاقير مثبطات محددة من صافي الثدييات ولها آثار محدودة على دات الثدييات (مثل إيميبرامين) انتقائية عالية إلى C. ايليجانس دات. وهكذا، انتقاء الأنواع قد تحد من قدرتنا على استقراء النتائج التي توصل إليها من C. ايليجانس للبشر.
أهم عامل للنظر في تصميم الاختبارات سويب عند إدراج تجارب تثبت أن هو بالنظام تتميز بوساطة سويب. في الواقع، يمكن أن تولد السباحة البصر بعوامل أخرى بخلاف الجينات المتعلقة بالنظام دا (مثلاً، عيوب عامة في انكماش العضلات). لضمان أن سويب هو توسط بل دا، ينبغي أن تتضمن بروتوكولات التجارب التي يؤديها مع الحيوانات التي استنفدت دا. ويمكن تحقيق ذلك أما عن طريق استخدام الحيوانات بالضربة القاضية التي تفتقر إلى التعبير عن القط-2، المناظرة C. ايليجانس من hydroxylase التيروزين، وهو إنزيم يحد من معدل لتوليف دا، أو من قبل معاملة الحيوانات البرية من نوع مع reserpine، المخدرات التي تسبب نضوب دا من حويصلات3. على سبيل المثال، أظهرت ماكدونالد وآخرون3 أنه تم انتشال سويب القاعدية التي لوحظت في طفرات دات-1 عندما كانت هذه الحيوانات ما قبل المعالجة مع reserpine. هذه النتيجة تشير إلى أن سويب دا بوساطة. من ناحية أخرى، استخدام القط-2، دات-1 وطفرات تفتقر إلى التعبير عن كل من مستقبلات تتميز، سافراتوويتش et al. (2014) أثبتت أن تتبع أمين β-فينيليثيلاميني (βPEA) يدفع سويب داخل 1 دقيقة للعلاج بشكل مستقل من دا لكن بالتنشيط المباشر لايون بوابات يجند القناة LGC-5514. وأظهر الكتاب أن βPEA ودا--المستحثة سويب ميتشانيستيكالي مختلفة ويمكن أن تكون بسهولة تمييز تجريبيا. وفي الواقع، حين سويب الناجمة عن βPEA دا-و إعلان المبادئ-3-مستقل، أن تصل إلى القيم القصوى داخل 1 دقيقة وسرعة النقصان بعد 2 دقيقة14، بوساطة دا سويب القط-2 و إعلان المبادئ-3 تعتمد وهو أساسا من الصفر بعد 1 دقيقة (الشكل 2). وهكذا، هناك فرق كبير في الوقت المطلوب للوصول إلى أقصى حد من الآثار، وهذا ما يسمح بالتمييز بسرعة بين هاتين الظاهرتين: 1) سويب السريع الناجم عن βPEA داخل 1 دقيقة التي حصل عليها التنشيط المباشر للقنوات LGC-55 و 2) بطء Overstimulated دا بوساطة سويب الذي يحدث عندما يتراكم فائض دا خارج الخلية مع مرور الزمن (10-15 دقيقة) ومستقبلات دا إعلان المبادئ-33.
وفي الختام، مع الحق في المجموعة من التجارب، والتي تشمل استخدام الحيوانات بالضربة القاضية للجينات لاعب أساسي للنظام تتميز (لجنة مناهضة التعذيب-2، دات-1، إعلان المبادئ-3) واستعمال المخدرات المستنفدة للمخازن دا (reserpine)، قد تم سويب استخدمت بنجاح لتوضيح إليه العمل للمخدرات مثل أمف5،13، βPEA،من1415 وأزابيروني6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر الدكتور أسامة الرفاعي من مختبر الدكتور راندي بلاكلي للتوجيه مع تحليل الآلي سويب. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة R01 DA042156 إلى LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
