Summary
수영 유도 마비 (SWIP)가 잘 설립 행동 분석 결과 꼬마 선 충 (C. 선 충)에서 신호 하는 도파민의 기본 메커니즘을 연구 하는 데 사용. 그러나, 분석 결과 수행 하는 자세한 방법을 부족 이다. 여기, 우리가 SWIP에 대 한 단계별 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜에서 설명 하는 수영 분석 결과 dopaminergic 조절 단백질을 식별 하는 유효한 도구 synapses 이다. 포유류와 마찬가지로, 도파민 (DA) C. 선 충 등 학습과 모터 활동에에서 여러 기능을 제어 합니다. 다 릴리스 (예를 들어, 암페타민 (AMPH) 치료)를 자극 하는 또는 그 다 허가 조건 (예: 동물 다 전송 부족 (dat-1) 는 뉴런을 다를 reaccumulating 할 수 있다) 세포 외 다의 과잉 생성 궁극적으로 저해 운동의 결과. 이 동작은 동물 물에서 수영 하는 때 특히 분명 하다. 사실, 야생-타입 동물 오랜된 시간 동안 수영을 계속, 하는 동안 dat 1 null 돌연변이 야생-타입 AMPH 처리 또는 억제제 다 전송의 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 이 문제는 "수영 유도 마비" (SWIP) 이라고 불린다. SWIP 분석 결과 잘 설립, 방법의 자세한 내용은 부족 한. 여기, 우리가 SWIP 수행 하는 단계별 가이드를 설명 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 늦은 애벌레 단계 4 동물 또는 AMPH 없이 제어 자당 솔루션을 포함 하는 유리 자리 접시에 배치 됩니다. 동물은 stereoscope에 장착 하거나 수동으로 시각화는 stereoscope 아래 자동으로 카메라와 함께 녹음 하 여 그들의 수영 동작에 대 한 득점 된다. 동영상 다음 탈 곡 주파수와 마비 열 지도 형태로 시각적 표현 생성 하는 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 수동 및 자동 시스템 동물 들의 수영 능력의 쉽게 정량 판독을 보장 하 고 따라서 동물 dopaminergic 시스템 내에서 돌연변이 베어링에 대 한 또는 보조 유전자에 대 한 심사를 용이 하 게. 또한, SWIP 명료 AMPH 악용의 약물의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.
Introduction
동물 다양 한 복잡 한 신호 처리에 의해 조정 하는 다른 신경 전달 물질에 의해 중재는 타고 난 하 고 복잡 한 동작을 수행 합니다. 신경 전달 물질 도파민 (DA) 종, 학습, 운동 기능 및 보상 처리를 포함 하 여에 걸쳐 높은 보존된 행동 중재.
토양 선 충 류 C. 선 충만 302 뉴런으로 구성 된 비교적 간단 하 고 잘 매핑된 신 경계 표시 등 짝짓기, 학습, 구하고, 운동 달걀 누워 다에 의해 규제는 많은 포함 하 여 현저 하 게 복잡 한 동작 1. 다른 기능, 짧은 라이프 사이클, 취급의 용이성 및 신호 분자의 보존, 중 보존된 행동의 신경 기초 공부에 대 한 모델로 C. 선 충 의 장점을 강조.
C. 선 충 자웅 동체 포함 8 dopaminergic 신경; 이들 이외에, 남자 짝짓기 목적 6 여분의 쌍을 포함 합니다. 포유류에서 이러한 신경 다 합성 하 고 다 전송 (DAT-1)는 다 다시 dopaminergic 신경 세포에 시 냅 스 갈라진 틈에 발표 전송 dopaminergic 신경에서 독점적으로 찾아낸 막 단백질을 표현 한다. 또한, 합성, 포장 및 다의 출시의 각 단계에 관련 된 단백질의 대부분은 매우 벌레와 인간 사이 보존 하 고, 같은 포유류, 다 변조 먹이 행동과 C. 선 충2운동.
C. 선 충 고체 표면에 크롤 링 하 고 물에 특성 때리는 행동으로 수영. 흥미롭게도, DAT-1 (dat-1)의 표현 부족 돌연변이 고체 표면에 일반적으로 크롤 링 하지만 물 때 수영을 유지 하기 위해 실패 합니다. 이 문제는 수영 유도 마비 또는 SWIP 되 나. 이전 실험 SWIP, 부분적으로, 발생 했다고 궁극적으로 d 2 같은 postsynaptic 수용 체 (DOP-3) overstimulates 시 냅 스 갈라진 틈에 다의 과잉에 의해 설명 했다. 원래 dat 1 녹아웃 동물3확인, SWIP 야생-타입 동물 블록 활동 DAT (예: imipramine4)의 약물 치료에 관찰 및 유도 다 릴리스 (예: 암페타민5). 다른 한편으로, 합성 및 다의 릴리스를 averting와 DOP-3 수용 체 기능을 차단 약리학 또는 유전자 조작 방지 SWIP6. 함께 찍은, 이러한 이미 게시 된 데이터는 설립 SWIP dopaminergic 시 냅 스3,,47 돌연변이 단백질에 의해 발생 하는 행동 효과 공부 하 고 하에 대 한 신뢰할 수 있는 도구로 다7,,89,10,,1112신호에 관련 된 소설 규제 통로의 식별에 대 한 앞으로 유전 스크린. 또한, 생체에 약물 유발 동작의 쉽게 정량 판독 함으로써 SWIP 수 암페타민 (AMPH) 같은 약물의 행동의 메커니즘의 해명 및 azaperone는 dopaminergic에서 synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP 분석 실험을 수행 하기 위한 프로토콜16전에 설명 했습니다. 방법론 및 설치 SWIP를 효과적으로 수행 하기 위해 선 충 C. 커뮤니티에 대 한 시각적 가이드를 제공 하는 목적으로 시험을 수행 하는 여기, 우리가 자세히 설명.
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Protocol
1입니다. 솔루션 및 미디어 준비
- KH2포4 3.0 g (22.05 m m), 나2HPO4 6.0 g (42.2 m m), 용 해 하 여 M9 버퍼를 준비 하 고 압력가 이온 물 1 L에 NaCl 5.0 g (85.5 m m). 압력가 마로 소독 후 1m MgSO4 (12 g 100 mL 압력가 이온된 수의 최종 볼륨에서)의 1.0 mL를 추가 합니다. 결과 10 x의 믹스 100 mL 압력가 마로 소독의 900 mL와 M9 저온 1 x 솔루션.
- 계란 버퍼 수 있도록, HEPES 압력가 이온 물 1 L에의 6.896 g의 NaCl (118 m m), KCl (48 m m), CaCl2-2 H2O (2 mM), MgCl2-6 H2O (2 mM)의 0.406 g의 0.294 g의 3.578 g과 5.958 g (25 mM)를 분해. PH를 7.3 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다.
- 이온된 수의 3.8 mL에 5-6% 염소 (표 백제)의 1 mL 및 10 N NaOH의 180 µ L을 추가 하 여 신선한 염소/NaOH 솔루션을 준비 합니다.
- 그리고 60 g 자당 무게 60% 자당 해결책을 100 mL의 최종 볼륨을 압력가 이온된 물에 용 해.
- 0.684 g 200 m m 자당을 압력가 이온된 수 10 mL에 자당의 분해. 확인 하 고는 osmolarity osmometer를 사용 하 여 동일한 조정. Microcentrifuge 튜브 1.5 mL에 1 mL aliquots을 확인 하 고-20 ° c.에 동결
- 100 m m 재고 솔루션을 만들고 이온된 물 10 mL에 용 해 및 0.184 g AMPH (분자량 184.75 g/mol)의 무게. 0.5 m m 작업 솔루션을 물 400 µ L에서 재고 솔루션의 믹스 2 µ L.
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영양 성장 미디어 (NGM) 접시를 준비
- 믹스 NaCl의 3 세대 (52.65 m m), 펩, 25 g bacto agar의 및 2 L 삼각 플라스 크에 이온된 수의 975 mL의 20 g. 액체 주기를 사용 하 여 1 시간 동안 자기 저 어 바와 오토 클레이 브 (121 ° C, 15 PSI)를 포함 합니다.
- 냉각 하 고 감동 하는 동안 히터에 플라스 크를 배치 하 여 약 50 ° C에서 온도 유지 합니다. 추가 (5 mg/mL에 에탄올), 콜레스테롤의 0.5 mL 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2 와 25 mL의 1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.4 (KH2포4108.3 g, K2HPO4 의 35.6 g의 1 mL 저온 1 l).
- 100 m m x 15 mm 페 트리 접시에 25 mL를 플라스틱 하 고 강화 하기 위해 미디어를 허용 합니다. 최대 4 주에 대 한 상자에 4 ° C에서 거꾸로 접시를 저장.
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Lysogeny (파운드) 국물 국물의 준비
- 5 g 파운드 가루 믹스 200 mL를 삼각 플라스 크에 이온을 제거 된 물에서 용 해. 액체 살 균을 이용 하 여 30 분 동안 고압 주기. 진정 국물을 허용 합니다. 1-2 주 동안 실내 온도에 상점.
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NA22 세균성 접시의 준비
- 살 균 피 펫 팁 또는 살 균 세균 루프를 사용 하 여 글리세롤 재고에서 NA22 대장균 박테리아의 작은 볼륨으로 파운드 플레이트를 행진 하 고 품 어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 밤새 고립 된 식민지를 성장 하는 것을. 선택 및 준비 단계 1.8에서에서 파운드 국물의 200 mL에 단일 식민지를 소개 하 고 떨고 플랫폼에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 하자.
- 씨앗 판, 200 µ L 세균성 문화 단계 1.7에서에서 준비 하 고 메 마른 유리 하 키 막대기로 확산 NGM 접시에의 분배. 플레이트 후드 아래에서 하룻밤 이상 말리 고 4 ° c.에 밀폐 상자에 거꾸로 저장 하자
- 벌레를 데리 러 속눈썹/백 금 도구를 접착제 파스퇴르 슈퍼 접착제를 사용 하 여 플라스틱 유리에 두꺼운 속눈썹 또는 백 금 필 라 멘 트. 면도날을 사용 하 여 각도에 속눈썹의 끝을 잘라. 또는 백 금 필 라 멘 트 주위 유리 피 펫의 끝을 녹기 분 젠 버너를 사용할 수 있습니다.
2. 선 충 C. 축산
참고: 야생-타입 N2C. 선 충 문화 대장균 NA22 격판덮개에 긴장. 세부 문화 방법 아래 설명 되어 있습니다.
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벌레 문화의 준비
- 벌레의 스타터 문화, 잘 먹이 동물을 포함 하는 접시에서 agar의 작은 조각을 잘라와 1.9 메 마른 주걱을 사용 하 여 단계에서 준비 NA22 대장균 박테리아 접시에 그것을 전송. 3-4 일 동안 20 ° C에서 접시를 품 어. 스테레오 현미경 시각 벗 성인의 존재를 확인 합니다.
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벌레의 동기화 된 인구의 준비
- 물 총 병을 사용 하 여 접시 주위 압력가 이온된 수를 분배 하 여 최소 2 접시에서 벗 성인을 수집 합니다. 부드럽게 소용돌이 벌레를 꺼내 려 하 고 일회용 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 15 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 벌레를 수집 판을 친다.
- 작은 벌레, 다음 진공 펌프를 사용 하 여 표면에 뜨는 발음 2 분 140 x g 에서 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 시키십시오 또는 실험실 진공 내장.
- Resuspend 및 세척 압력가 이온된 수와 믹스 2 분에 대 한 140 x g 에서 원심 분리기와 튜브를 작성 하 여 벌레는 상쾌한 발음 하 고이 마지막 반복 단계 2 번 더 또는 벌레는 박테리아 (물 혼합 때 분명 나타납니다에서 분명 때까지 벌레).
- 웜 펠 릿을 갓 만든된 염소/NaOH 솔루션 (1.3 단계)의 5 mL을 추가 하 고 빠르게 소용돌이 사용 하 여 혼합. 약 4-8 분 동안 로커에 튜브를 품 어. 염소/NaOH 솔루션 외피의 시간 4-8 분 재고 염소 솔루션 (표 백제)의 품질에 따라 번갈아 사용 합니다.
- 유리 현미경 슬라이드에 벌레를 포함 하는 솔루션의 드롭 (2-50 µ L)을 넣고 모든 2 분 웜 세포에 대 한 현미경 검사. 벌레의 약 70%는 lysed 계란 출시 때 채우기 계란 버퍼 튜브 단계 1.2에서에서 준비 하 고 즉시 배아 작은 벌레 시체를 140 x g 에서 1 분 동안 원심.
- 상쾌한 발음 하 고 때마다 계란 버퍼와 튜브를 작성 하 여 펠 릿 3 번 더 씻어. 140 x g 1 분 동안에 아래로 회전 하 고 제거는 상쾌한 때마다. 펠 릿 세척의 끝에 흰색으로 변합니다.
- 최종 세척 후 30% 자당 해결책에서 죽은 시체에서 배아를 구분 합니다. 펠 릿에 압력가 이온된 수의 5 mL을 추가 하 고 resuspend 단계 1.4에서에서 준비 하는 60% 자당의 5 mL을 추가. 철저 하 게 혼합 하 고 6 분 160 x g 에서 원심.
- 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신선한 15 mL 원뿔 튜브로 위 초승달 모양에 부동 하는 배아를 전송. 3-4 mL 이상 복용 하지 마십시오. 제거 하려면 모든 나머지 자당, 배아를 씻어 3 번 centrifuging 140 x g 3 분에 의해 압력가 물 제거는 상쾌한 고 펠 릿 resuspending (와 튜브를 작성) 각 시간.
- 1 x M9 버퍼와 세척을 반복 합니다. 최종 세척 후 M9 10 mL에 펠 릿을 resuspend. L1 애벌레로 부 화 계란을 위해 밤새 통 (더 이상 14 h)에 튜브를 둡니다. 벌레는 음식의 부족으로 인해 L1 애벌레 단계에서 유지 됩니다.
- 3 시간 2 분에 대 한 140 x g 에서 centrifuging 애벌레에 의해 발표 어떤 페로몬을 제거 하려면 압력가 물으로 워시는 L1 애벌레 물의 1 mL에서 애벌레를 Resuspend. 1:10 희석 물에 벌레의 플라스틱 유리 슬라이드에 10 µ L 드롭는 coverslip에 넣고는 stereoscope 아래 벌레의 수를 계산. 이것을 두 번 반복 하 고 결과 평균.
- 피 펫 작은 배치 하 여 약 1000 벌레는 NA22 플레이트 (실내 온도에 주어진 이전)에 해당 하는 벌레의 볼륨 접시에 떨어진다. 드롭 마르면 때까지 반 오픈 접시를 둡니다. 그런 다음 접시를 커버 하 고 거꾸로 약 44-48 h 또는 벌레는 stereomicroscope에서 시각적으로 확인으로 늦은 L4 단계에 도달 될 때까지 20 ° C 배양 기에서 품 어. 이제 벌레 SWIP에 대 한 테스트할 준비가 되어 있다.
3입니다. SWIP
참고: 야생-타입 웜 AMPH 치료에서 SWIP 평가의 수동 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 짧게 벌레의 추적 및 자동된 웜 추적기와 Hardaway 외.10이전에 설명한 추적 소프트웨어를 사용 하 여 웜 활동의 추가 분석을 논의.
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수동 메서드 SWIP에 대 한 테스트를
- Aliquot 40 µ L 200 mOsm/L 자당 솔루션 또는 자리 유리판에 0.5 m m AMPH 없이. Stereoscope, 아래 속눈썹 또는 백 금 8-10 늦은 L4 단계 웜 선택 선택 하 고 잠수함 웜 선택 밖으로 이동 하 고 솔루션으로 수영 때까지 솔루션을 포함 하는 접시에서 선택. 잘으로 선택 하는 벌레의 수, 타이머 시작, 관찰 하 고 각 분 마크에서 SWIP를 전시 하는 벌레의 수를 기록.
- 원시 데이터를 스프레드시트에 복사 고 웜 웜 분석 결과 통해 테스트의 총 수에 의해 각 순간에 마비 하는 벌레의 수를 나누어 마비의 비율을 계산 하 고 100을 곱하십시오. 어떤 그래프에 백분율 값을 복사 하 고 통계 소프트웨어 및 플롯 Y 축 백분율 값 및 X 축 XY 그래프를 사용 하 여 시간 데이터 형식.
- 다음에 post hoc 분석 (예를 들어, Bonferroni 테스트 후) 제어, AMPH 그룹 및 치료 시간 중 통계적 의미를 테스트 하는 양방향 ANOVA를 수행 합니다.
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SWIP의 자동된 분석
- 한 번에 단일 벌레에 자동화 된 분석을 수행 합니다. 프로토콜 설정 카메라, 벌레 추적 소프트웨어 및 추적 소프트웨어를 실행 하는 스크립트를 분석 Hardaway 외.16에 자세하게 설명 되어 있습니다.
- 간단히, 절 3.1.2에에서 수동 방법에 설명 된 대로 속눈썹 선택, 활용 하 여 유리 자리 접시에는 단일 늦은 L4 단계 자웅 동체를 놓습니다. 당시 한 벌레의 수영 동영상을 기록 하 고 벌레 추적 소프트웨어를 사용 하 여 신체 굴곡의 빈도 계산.
- 벌레 탈 곡 데이터에서 열 지도 생성 하 고 웜 탈 곡 주파수를 추적 소프트웨어와 함께 제공 하는 스크립트에 따라.
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Representative Results
선물이 SWIP 분석 결과 AMPH 치료에 의해 유도 된의 예. 그림 1 에서는 위에서 설명한 대로 분석 결과 설정의 도식 대표. 수동 분석 결과, 약 8-10 나이 동기화 된 늦은 L4 단계 벌레는 속눈썹 또는 백 금 수집 선택 하 고 유리 자리 접시 200 mOsm/L 자당 (제어 솔루션) 또는 0.5 m m AMPH 자당의 40 µ L를 채워지고, SWIP에 대 한 테스트에 배치.
동물 수영을 중지 하는 경우 (즉, SWIP 전시), 그들은 신속 하 게 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 따라서, 여전히 우물의 바닥에 꾸준한 사람 대 물의 표면에 수영 동물 사이 차별은 매우 간단 합니다. 벌레의 대부분 AMPH 치료에서 SWIP 점차적으로 전시 하는 동물의 수는 증가 하는 반면에 적어도 10 분 동안 지속적으로 제어 솔루션 수영 테스트. 동물 SWIP 전시의 극대 비율 AMPH 사용1,5,13의 농도에 비례 이다. DAT-1 녹아웃 (dat-1) 웜 제어 솔루션에서 테스트, 40-70% 벌레 10 분4,13이내 SWIP을 전시 한다. 이 결과 마비 동물 야생-타입 동물 0.5 m m AMPH (그림 2)로 치료 측정의 비율에 대 등 하다.
자당 또는 자당 AMPH 들어 있는 노출 벌레 관찰 (그림 2)의 첫 번째 분에 SWIP 표시 되지 않습니다. 그러나, 웜 자당으로 치료 10 분 동안 수영을 계속, 웜 AMPH 치료 전시 SWIP 치료의 2 분 후 10 분 후 66 ± 3% 동물 쇼 SWIP (그림 2)를 시작 합니다.
자동된 분석에 대 한 제어 또는 AMPH 치료 벌레의 동영상 기록 비디오 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 한 번에 한 웜. 추적 소프트웨어는 컴퓨터 웜 탈 곡을 추적 하기 위해 사용 되 고 결과 데이터 가져올 및 소프트웨어 슈트와 분석. 동물 제어 또는 AMPH 노출의 열 지도 샘플, 그림 3에 나와 있습니다 적극적으로 녹색, 빨간색과 마비 벌레에서 동물을 이동 표시.
그림 1 : 분석 결과 SWIP 설정. 벗 성인 야생-타입 (N2) 벌레는 배아를 출시 염소/NaOH 처리 lysed 했다. 배아 부 화 통에 14 h M9 버퍼에서 동기화 된 L1 애벌레로 발전을 허용 하 고 NA22 박테리아와 시드 NGM 접시에 도금 했다. 42-48 h 후 늦은 L4 단계 애벌레 시각적으로 stereoscope 밑에 확인 하 고 또는 암페타민 제어 자당 솔루션에서 없이 자리 격판덮개로 속눈썹 선택 선택 되었고 SWIP 수동으로 또는 자동화 된 분석을 통해 득점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 암페타민 유발 SWIP 수동 분석 결과 사용 하 여. 자당 또는 0.5 m m 암페타민 (AMPH)와 자당 웜 시각적으로 득점 했다 SWIP 행동는 stereoscope를 사용 하 여 모든 분. 동물 전시 SWIP의 수를 분할 하 여 계산 된 백분율 웜 웜 각 시간 지점에 대 한 분석 하 고 다음 100을 곱한 결과의 총 수로 마비. 벌레 AMPH (파란색 사각형) 치료 웜 (빨간색 원) 10 분 창 동안 수영을 계속 하는 동안 SWIP 증가 초과 보여주는에 노출의 백분율. N 각 그룹에서 테스트 하는 동물의 수를 나타냅니다. 오차 막대는 수단 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 통계적 의미는 Bonferroni와 양방향 ANOVA 여러 비교 테스트 (p < 0.0001)를 수행 하 여 평가 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 자동된 분석 통해 SWIP 암페타민 유발. 자당 또는 0.5 m m AMPH 자당에 벌레의 비디오는 stereoscope에 장착 된 카메라를 사용 하 여 기록 되었다. 수영의 개별 벌레 추적 소프트웨어와 함께 추적 된 동영상과 사용 하 여 분석 소프트웨어 슈트를 추적. 열 지도 빨간색 영역 표시는 적극적으로, 벌레 녹지 나타냅니다 마비 벌레 데이터에서 생성 되었습니다. 각 실험 그룹 6 동물의 대표 이다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 행동 분석 결과, SWIP, C. 선 충에서 수행 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 없이 주요 기술적인 장애물이 분석 결과 매우 사용자 친화적인 만들기로 간단 하 고 직관적입니다. 그럼에도 불구 하 고, 분석 결과 효과적으로 수행 하기 위해 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 측면 있다.
분석 결과 대 한 사용 하는 웜 때문에 식이 제한에 영향을 미치는 SWIP17잘 먹이 되도록 주의 한다. 부드러운 따기 (백 금 선택을 사용 하는 경우에 일반적인 더) 또는 염소/NaOH 솔루션에 배아의 확장된 노출 동안 외상 할 수 있는 세포 중 잘 초과 염소/NaOH 처리는 중요 한 단계를 따기 동안 벌레의 처리 웜18 에 영구적인 손상을 원인과 따라서 수영을 자신의 능력을 손상 시킬.
무 균 기법 오염을 피하기 위하여 지켜져야 한다. 한 천 배지 오염 동물의 건강을 손상 하 고 따라서 수영을 자신의 능력을 변경. (NA22, OP50, 등.) 대장균 박테리아의 다른 변종으로 시드 한 천 배지를 사용 하 여 동물 SWIP 전시의 비율에서 약간의 차이 관찰할 수 있습니다. 우리의 프로토콜을 사용 하 여 NA22 벌레의 많은 수를.
유리-자리 접시, SWIP 분석 결과 중 사용 플라스틱 접시를 선호 하는 그들은 세척 될 수 있다 철저 하 게, 압력가 마로 소독 때문에 있으며 약물의 종류는 시험 때 다시 사용.
SWIP 분석 결과에 고려해 야 할 또 다른 중요 한 요소는 동물은 시험된19액체 미디어의 osmolarity입니다. 우리의 프로토콜을 사용 하 여 자당 동물 (Blakely로 개인 커뮤니케이션)에 대 한 최적의 조건으로 줬던 이전 200 mOsm/L까지 물 osmolarity를가지고. 물 제어 osmolarity와 다른 일, 주 또는 달에서 수행 하는 여러 분석을 통해 수 질에 가능한 차이 제거 하기 때문에 선호 된다 특히, dat-1 와 야생-타입 동물 AMPH 치료지 않습니다 하지 전시 SWIP 짠 솔루션 (예: M9 솔루션) 제어 미디어로 사용 하는 경우.
SWIP 전시 하는 동물의 대부분에 필요한 시간 약간 다른 웜 단계 (L1-L4) 사이에서 변경할 수 있습니다. 예를 들어, Masoudi 그 외 여러분 (2014) 그 후 5 분 dat-1 L1 동물의 80%는 여전히 수영, 따라서 동물의 20%만 전시 SWIP 보고. 다른 한편으로, L4 dat-1 동물의 단지 50%는 여전히 5 분20후 수영. 따라서, 같은 나이에 동물 SWIP에 대 한 시험 분석은 중요 하다.입니다. 우리는 항상 늦게 개최 L4 동물을 사용 하 여 우리의 분석 결과 최적화 했습니다. 늦은 L4 애벌레 다른 애벌레 단계 사이에서 쉽게 인식할 수 있기 때문에,이 단계에서 그들의 성인 크기에 도달 했습니다 동물과 특성 얇은 라인 나누어 나중 그들의 바디의 중심에 하얀 점이 전시 되 고의 이점이 있다 성숙한 외 음부로 구분 합니다. 분석 결과의 기간도 중요 하다. 예를 들어 15 분 후 L4 dat-1 돌연변이의 90% 전시 SWIP 하지만 나중에 (30 분), 그들의 60%만 전시 SWIP20.
자동된 SWIP 분석 결과 인간의 오류를 제거 하 고 수동 분석 실험에 대해 높은 처리량 검열을 향상 시킵니다. 그러나, 추적 하는 소프트웨어 프로그램은 시간이 소요 때문에 그들은 단지 한 번에 단일 벌레를 추적할 수 있습니다.
다른 선 충 C. 다-종속 동작에 관하여 SWIP 분석 결과의 보다 적게 시간이 걸리는 유형입니다. 예를 들어, 기저 둔화 응답2 의 분석 결과 즉시 유형 아니다. 사실, 웜 만성 약물, 먹이로 해야 하 고이 침투 및 오프 대상 효과 귀 착될 수 있었다. 따라서, 그것은 의약품에 대 한 화면에 효과적인 않을 수 있습니다.
SWIP의 주요 응용 프로그램 중 하나는 대상 dopaminergic 통로 다양 한 약물에 대 한 화면입니다. 약 하지 않은 수용 성 (예, mazindol)의 경우, 적절 한 희석 수행 되어야 한다 농도 달성 하기 위해 캐리어 솔루션은 벌레에 유해 하지 않습니다. 또한, 같은 약물의 다른 농도 사용된5,,1314인 경우 복용량 응답 곡선 또한 분석할 수 있습니다. 예를 들어 진행 (분당, 그림 2동물의 곡선의 기울기)의 속도 농도의 기능으로 보고 하 고 다른 약물 (예: AMPH 대 코카인)의 효과 비교 하는 데 사용 될 수 있습니다.
SWIP 약물 dopaminergic 시 냅 스에서의 행동의 메커니즘을 조사 하는, 결과 다른 동물을 확장 하는 경우 주의 지불 합니다. 예를 들어, imipramine, 포유류 norepinephrine 전송 (인터넷)의 특정 억제제 N2 동물4SWIP 다 중재를 유도 하기 위해 사용 되었습니다. C. 선 충 synthetize norepinephrine 하지 않으며 따라서 그물을 표현 하지 않는다. 그러나, C. 선 충 다 전송 포유류 NET21상 동을 공유합니다. 이러한 이유로, 포유류 그물의 특정 억제제와 포유류 DAT (예: imipramine)에 효과 제한 했다 마약 C. 선 충 DAT.에 높은 선택도 표시 따라서, 종족 선택도 인 간에 게 C. 선 충 에서 결과 추정 하는 우리의 기능 제한.
분석 실험 SWIP 디자인할 때 고려해 야 할 가장 중요 한 요소 SWIP dopaminergic 체계에 의해 중재는 증명 하는 실험의 포함 이다. 사실, 장애인된 수영 다 시스템 (예: 근육 수축에 일반 결함)에 관련 하는 유전자 이외의 요인에 의해 생성 될 수 있습니다. SWIP 다 중재 실제로 되도록 프로토콜 다 고갈 되어가는 동물 들과 함께 수행 하는 실험을 포함 해야 합니다. 이 중 하나에 의해 달성 될 수 있다 녹아웃 동물 고양이-2, 속도 제한 효소 다 합성, 또는 미리 치료 야생-타입 동물 reserpine은 티로신 hydroxylase의 선 충 C. homologue 표현의 부족을 사용 하는 마약 소포3에서 다 고갈 되도록. 예를 들어, 맥도날드 외.3 기저 SWIP dat-1 돌연변이에서 관찰이 동물 reserpine과 사전 치료 때 복구 되었다 보여주었다. 이 결과 SWIP 다 중재가 나왔다. 다른 한편으로, 고양이-2, dat-1 및 돌연변이 dopaminergic 수용 체의 각의 표현 부족을 사용 하 여, Safratowich 그 외 여러분 (2014) 시연 추적 아민 β-phenylethylamine (βPEA)의 치료 1 분 이내 SWIP 유도 독립적으로 다 하지만 ligand 문을 단 이온의 직접 활성화 하 여 채널 LGC-5514하지. 저자는 βPEA-고 다-유도 SWIP mechanistically와 다른 그들은 수 있습니다 쉽게 차별 실험적으로 보여주었다. 사실, βPEA 유도 SWIP는 다- dop-3에서-독립적인, 그것은 1 분 이내 최대 값에 도달 하 고 빠르게 2 분14후 감소, 다 중재 SWIP 고양이-2 와 dop-3 종속 이며 본질적으로 0 1 후 분 (그림 2)입니다. 따라서, 최대 효과 도달 하는 데 필요한 시간에 큰 차이가 있다 고 신속 하 게 두 현상 사이 차별 수 있습니다: 1 분 이내 1) 빨리 βPEA 유도 SWIP LGC-55 채널의 직접 활성화 하 여 얻은 2) 및 느린 세포 외 다의 잉여 시간 (10-15 분) 동안 일으키 다 수용 체 DOP-3은 되었을 때 발생 하는 다 중재 SWIP overstimulated 일3.
결론적으로, 실험, dopaminergic 시스템 (고양이-2, dat-1, dop-3)의 핵심 선수 유전자와 다 저장 (reserpine)을 없애고 약물의 사용에 대 한 녹아웃 동물의 사용을 포함 하는 올바른 집합 SWIP 되었습니다. 성공적으로 AMPH5,13, 같은 약물의 행동의 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 βPEA14,15 와 azaperone6.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 오사마 Refai SWIP의 자동 분석 지침에 대 한 박사 랜디 Blakely의 연구소에서 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 LC NIH R01 DA042156에서 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
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