Summary
Zwemmen geïnduceerde verlamming (SWIP) is een gevestigde gedrags test gebruikt bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen van dopamine signalering in Caenorhabditis elegans (C. elegans). Een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van de bepaling ontbreekt echter. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor SWIP.
Abstract
De bepaling van de zwemmen beschreven in dit protocol is een geldig instrument om te identificeren eiwitten reguleren van de Dopaminerge synapses. Net als bij zoogdieren, dopamine (DA) bepaalt verscheidene functies in C. elegans met inbegrip van leren en motorische activiteit. Voorwaarden die stimuleren DA vrijkomen (bijvoorbeeld amfetamine (AMPH) behandelingen) of die voorkomen DA klaring (bijvoorbeeld dieren ontbreekt de DA vervoerder (dat-1) die zijn niet in staat van DA reaccumulating in de neuronen) genereren van een overmaat van extracellulaire DA wat uiteindelijk resulteert in geremde motoriek. Dit probleem is vooral duidelijk wanneer dieren in water zwemmen. In feite, terwijl de wild-type dieren blijven om te zwemmen voor een langere periode, dat-1 null mutanten en wild-type behandeld met AMPH of remmers van de DA vervoerder zinken naar de bodem van de put en niet verplaatst. Dit gedrag heet "Zwemmen geïnduceerde verlamming" (SWIP). Hoewel de bepaling SWIP goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de methode. Hier beschrijven we een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van SWIP. Voor het uitvoeren van de bepaling, worden laat larvale stadium-4 dieren geplaatst in een plek glasplaat met sacharose bedieningsoplossing met of zonder AMPH. Dieren worden gescoord voor hun zwemmen gedrag of handmatig door visualisatie onder een stereoscoop automatisch door opname met een camera gemonteerd op de stereoscoop. Video's worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een tracking-software, die een visuele weergave van pak slaag frequentie en verlamming in de vorm van warmte kaarten levert. Zowel de handmatige en geautomatiseerde systemen garanderen een gemakkelijk meetbare uitlezing van de dieren zwemmen vermogen en aldus vergemakkelijken screening voor vaneenkeurmerkzijnvoorzien mutaties binnen het Dopaminerge systeem of voor ondersteunende genen. Daarnaast kan de SWIP ophelderen van het werkingsmechanisme van drugs misbruik zoals AMPH worden gebruikt.
Introduction
Dieren te vervullen, een verscheidenheid van aangeboren en complexe problemen die worden bemiddeld door verschillende neurotransmitters gecoördineerd door ingewikkelde signalering processen. De neurotransmitter dopamine (DA) bemiddelt zeer geconserveerde gedrag over soorten, waaronder learning, motor functie en verwerking van beloning.
De bodem nematode C. elegans, met een relatief eenvoudige en goed toegewezen zenuwstelsel bestaande uit alleen 302 neuronen, toont duidelijk complexe gedrag, waaronder vele die zijn geregeld bij DA zoals paring, leren, foerageren, motoriek en leggen van eieren 1. Markeer onder andere functies, korte levenscyclus, gebruiksgemak en de instandhouding van de signalering van moleculen, de voordelen van het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de neurale basis van geconserveerde gedrag.
De hermafrodiet C. elegans bevat acht Dopaminerge neuronen; Naast deze bevat de man zes extra paren voor paring doeleinden. Zoals bij zoogdieren, deze neuronen DA synthetiseren en express de DA transporter (DAT-1), een membraan eiwit gevonden uitsluitend in Dopaminerge neuronen, waarvan transports DA vrijkomen in de synaptische gespleten terug de Dopaminerge neuronen. Bovendien, de meeste van de eiwitten die betrokken zijn bij elke stap van synthese, de verpakking en de release van DA zijn zeer bewaard tussen wormen en mens en zoals bij zoogdieren, DA moduleert voeding gedrag en motoriek in C. elegans2.
C. elegans doorzoekt op vaste oppervlakken en zwemt met een karakteristieke pak slaag gedrag in water. Interessant, mutanten expressie voor DAT-1 (dat-1) ontbreekt normaal kruipen op harde ondergrond maar niet zwemmen wanneer ondergedompeld in water te houden. Dit probleem was zwemmen geïnduceerde verlamming of SWIP genoemd. Eerdere experimenten aangetoond dat SWIP, gedeeltelijk wordt veroorzaakt door een overmaat aan DA in de synaptische spleet die uiteindelijk overstimulates de D2-achtige postsynaptisch receptoren (DOP-3). Hoewel oorspronkelijk geïdentificeerd in dat-1 knockout dieren3, SWIP is ook waargenomen in het wild-type dieren behandeld met medicijnen die de activiteit blok DAT (bijvoorbeeld imipramine4) en/of induceren DA release (bijvoorbeeld amfetamine5). Aan de andere kant, voorkomen farmacologische of genetische manipulaties afwenden van synthese en release van DA en het blokkeren van DOP-3 receptor functie SWIP6. Samen hebben deze reeds gepubliceerde gegevens SWIP opgericht als een betrouwbaar hulpmiddel te bestuderen van de gedragsmatige gevolgen veroorzaakt door gemuteerde eiwitten binnen Dopaminerge synapsen3,4,7 en kunnen worden ingezet voor voorwaartse genetische schermen voor de identificatie van nieuwe regelgevende trajecten die betrokken zijn bij DA signalering7,8,9,10,11,12. Bovendien, door het verstrekken van een gemakkelijk meetbare uitlezing van drug-geïnduceerde gedrag in levende dieren, SWIP maakt het ontrafelen van de mechanismen van de actie van drugs zoals amfetamine (AMPH) en azaperone op de Dopaminerge synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocollen voor het uitvoeren van de tests SWIP zijn vóór16beschreven. Hier beschrijven we in detail de methodologie en de setup voor het uitvoeren van de test met het doel van het verstrekken van een visuele gids voor de C. elegans -Gemeenschap voor het effectief uitvoeren van SWIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de oplossingen en Media
- M9 buffer door ontbinding KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42.2 mM), bereiden en NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water. Voeg 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g in een eindvolume van 100 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water) na autoclaaf. Mix 100 mL van de resulterende 10 x M9 met gesteriliseerde met autoclaaf 900 mL gedeïoniseerd water zodat een oplossing 1 x.
- Los 6.896 g NaCl (118 mM), 3.578 g van KCl (48 mM), 0,294 g CaCl2-2 H2O (2 mM), 0.406 g MgCl2-6 H2O (2 mM) en 5.958 g (25 mM) voor HEPES in 1 L gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water om ei buffer. Breng de pH op 7.3 met NaOH.
- Bereid verse natriumhypochloriet/NaOH-oplossing door toevoeging van 1 mL van 5-6% natriumhypochloriet (bleekwater) en 180 µL van 10 N NaOH tot 3,8 mL gedeïoniseerd water.
- Weeg 60 g sacharose en ontbinden in gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 100 mL om 60% sacharoseoplossing.
- Los 0.684 g van sacharose in 10 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water om 200 mM sacharose. Controleren en aanpassen aan de zelfde een osmolariteit met behulp van osmometer. Maak 1 mL aliquots in 1,5 mL microcentrifuge buizen en bevriezen bij-20 ° C.
- Weeg 0.184 g van AMPH (moleculair gewicht 184.75 g/mol) en los op in 10 mL gedeïoniseerd water te maken van een stamoplossing van 100 mM. Meng 2 µL van de stockoplossing in 400 µL van water om 0.5 mM werkende oplossing.
-
Bereiden van nutriënten groei media (NGM) platen
- Meng 3 g NaCl (52.65 mM), 20 g pepton, 25 g bacto-agar en 975 mL gedeïoniseerd water in een erlenmeyer van 2 L. Ook een magnetische roer bar en de autoclaaf (121 ° C, 15 PSI) gedurende 1 uur met behulp van vloeibare cyclus.
- Koel af tot en handhaving van de temperaturen bij ongeveer 50 ° C door de erlenmeyer op een kachel al roerend te plaatsen. Voeg 0,5 mL van cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 en 25 mL van de 1 M kalium fosfaatbuffer, pH 7.4 (108.3 g van KH2PO4, 35.6 g K2HPO4 gedeïoniseerd water tot 1 L).
- Pipetteer 25 mL elke in 100 x 15 mm Petri platen en laat de media om te stollen. Bewaar de platen ondersteboven bij 4 ° C in een doos voor maximaal 4 weken.
-
Voorbereiding van lysogenie Bouillon (LB) Bouillon
- Los 5 g voor LB poeder mix in 200 mL gedeïoniseerd water in een erlenmeyer. Autoclaaf gedurende 30 minuten met behulp van de vloeibare sterilisatie cyclus. Laat de Bouillon om af te koelen. Bewaren bij kamertemperatuur voor 1-2 weken.
-
Voorbereiding van NA22 bacteriële platen
- Gebruik een steriele pipet-tip of een steriele bacteriële lus Strijk een LB-plaat met een klein volume van NA22 E. coli bacteriën uit glycerol voorraad en de plaat ondersteboven in een incubator 37 ° C na een nacht bebroeden om te groeien van geïsoleerde kolonies. Kies en introduceren een één kolonie in 200 mL van de pond-Bouillon in stap 1.8 voorbereid en laat 's nachts groeien bij 37 ° C op een schudden platform.
- Afzien om het zaad van de platen, 200 µL van bacteriële cultuur op de platen van de NGM bereid eerder in stap 1.7 en verspreid dit met een steriele glazen hockeystick. Laat de platen droog 's nachts of langer onder een motorkap en ondersteboven Bewaar in een luchtdichte doos bij 4 ° C.
- Lijm om de wimper/platina tool te halen van wormen, een dikke wimper of een platina gloeidraad in een glas Pasteur Pipetteer met behulp van superlijm. Snijd het puntje van de wimper in een hoek met een scheermesje. Anderzijds kan een bunsenbrander te smelten van het uiteinde van de glazen pipet rond de platina gloeidraad worden gebruikt.
2. C. elegans veehouderij
Opmerking: Cultuur van wild-type N2C. elegans stam op Escherichia coli NA22 platen. De gedetailleerde cultuur-methoden worden hieronder beschreven.
-
Voorbereiding van worm cultuur
- Om een starter cultuur van wormen, Knip een klein stukje agar van een plaat met weldoorvoede dieren en breng het op een NA22 E. coli bacteriën bord bereid in stap 1.9 met behulp van een steriele spatel. Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende 3-4 dagen. Controleer onder een stereomicroscoop, visueel of de aanwezigheid van gravid volwassenen.
-
Voorbereiding van gesynchroniseerde bevolking van wormen
- Verzamelen gravid volwassenen van ten minste 2 platen door verstrekking van gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water rondom de plaat met behulp van een spuit fles. Zachtjes swirl de plaat om te verjagen van de wormen en verzamelen van de wormen in een 15 mL polystyreen conische buis met behulp van een wegwerp plastic pipet.
- Spin naar beneden de buis in een centrifuge bij 140 x g gedurende 2 min naar de wormen pellet en gecombineerd uit het supernatant met behulp van een vacuümpomp of met gebouwd in laboratorium vacuüm.
- Resuspendeer en wassen de wormen door de buis te vullen met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water en mix en centrifugeer bij 140 x g gedurende 2 min. gecombineerd het supernatant en herhaal deze laatste stap twee vaker of totdat de wormen zijn duidelijk van bacteriën (water blijkt duidelijk wanneer gemengd met de wormen).
- Voeg 5 mL van versgemaakte natriumhypochloriet/NaOH-oplossing (stap 1.3) naar de worm pellet en snel mengen met behulp van een vortex. Incubeer de buis op een rocker voor ongeveer 4-8 min. De tijd van incubatie met natriumhypochloriet/NaOH oplossing schommelt tussen 4-8 minuten op basis van de kwaliteit van de voorraad natriumhypochloriet-oplossing (bleekwater).
- Zet een daling (2-50 µL) oplossing met wormen op een microscoopglaasje van glas en controleer elke 2 min onder de Microscoop voor lysis van de worm. Bij ongeveer 70% van de wormen zijn lysed en eieren zijn vrijgegeven, vullen de buis met ei buffer bereid in stap 1.2 en onmiddellijk centrifuge voor 1 min bij 140 x g pellet van de embryo's en worm karkassen.
- De bovendrijvende substantie gecombineerd en wassen van de pellet 3 vaker door de buis te vullen telkens met ei buffer. Spin down bij 140 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant telkens. De pellet wordt wit aan het einde van wast.
- Na de definitieve wash, de embryo's van de dode kadavers in 30% sacharoseoplossing te scheiden. Voeg 5 mL van gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water toe aan de pellet, resuspendeer en voeg 5 mL van 60% sucrose bereid in stap 1.4. Meng samen en centrifugeer bij 160 x g voor 6 min.
- Gebruik een glazen pipet van Pasteur om de transfer van de embryo's zweven op de bovenste meniscus in een conische buis van vers 15 mL. Neem niet meer dan 3-4 mL. Als u wilt verwijderen van alle resterende sacharose, het wassen van de embryo's 3 keer met gesteriliseerde met autoclaaf water door centrifugatie bij 140 x g gedurende 3 minuten, het verwijderen van het supernatant en resuspending van de pellet (en vullen van de buis) elke keer.
- Herhaal de wasbeurten met 1 x M9 buffer. Na de definitieve wash, resuspendeer de pellet in 10 mL M9. Laat de buizen op een shaker's nachts (ten hoogste 14 h) voor de eieren om te Luik in larven van L1. Wormen blijven in L1 larvale stadium wegens gebrek aan voedsel.
- Wash de L1 larven 3 keer met gesteriliseerde met autoclaaf water te verwijderen elke feromonen vrijgegeven door de larven door centrifugatie bij 140 x g gedurende 2 min. resuspendeer de larven in 1 mL water. Maken van een 1:10 verdunning van de wormen in water, Pipetteer een druppel 10 µL op een glasplaatje, een dekglaasje aan gezet en het aantal wormen onder een stereoscoop. Herhaal dit twee keer en het gemiddelde van de resultaten.
- Pipetteer de hoeveelheid wormen die correspondeert met ongeveer 1.000 wormen op een NA22-bord (die kwam eerder tot kamertemperatuur) door het plaatsen van kleine druppels op de plaat. Laat de plaat halfopen totdat de daling droogt uit. Vervolgens de afdekplaat en incubeer ondersteboven in 20 ° C incubator voor ongeveer 44-48 h of totdat de wormen bij late L4 stadium, zoals bevestigd visueel onder een stereomicroscoop. De wormen zijn nu klaar om te worden getest voor SWIP.
3. SWIP
Opmerking: We beschrijven de handmatige methode voor de beoordeling van SWIP in wild-type wormen AMPH behandeld. Ook kort bespreken we het volgen van wormen en verdere analyse van de worm kinetiek met behulp van een geautomatiseerde worm tracker en een tracking-software die eerder werden beschreven door Hardaway et al.10.
-
Handmatige methode om te testen voor SWIP
- Aliquot 40 µL van 200 mOsm/L sacharoseoplossing met of zonder 0.5 mM AMPH in een plek glasplaat. Onder de stereoscoop, pick 8-10 eind-L4 fase wormen met een wimper of platina halen en dompelen de pick in de plaat met de oplossing tot wormen uit de pick verplaatsen en zwemmen vandaar naar de oplossing. Noteer het nummer van wormen geplukt in de put, start de timer, observeren en registreren het aantal wormen SWIP exposeren op elke minuut mark.
- Kopiëren van de ruwe gegevens naar een spreadsheet en bereken het percentage van wormen verlamd door het verdelen van het aantal wormen op elk moment verlamd door totale aantal wormen getest in de bepaling en vermenigvuldig met 100. Kopieer het percentage waarden in elke graphing en statistische software en plot de gegevensindeling met percentage waarden op de Y-as en tijd op de X-as met behulp van de XY-grafiek.
- Two-way ANOVA gevolgd door post-hoc analyse (bijvoorbeeld Bonferroni na de test) om te testen voor statistische significantie onder controle, AMPH groepen en het tijdstip van behandeling uit te voeren.
-
Geautomatiseerde analyse van SWIP
- Geautomatiseerde analyse uitvoeren op een enkele worm tegelijk. Het protocol bij het instellen van de camera, de worm tracker software en script de tracking-software uit te voeren analyse zijn in detail beschreven in Hardaway et al.16.
- Kort, plaatst u een enkele late L4 fase hermafrodiet in een plek glasplaat met behulp van een wimper te halen, zoals beschreven in de handmatige methode in punt 3.1.2. Record zwemmen video's van een worm op het moment en de worm tracker software gebruiken voor het berekenen van de frequentie voor het lichaam buigt.
- Volg het script dat wordt geleverd met de tracking-software te verkrijgen van worm pak slaag frequentie en voor het genereren van warmte kaarten uit de worm pak slaag gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presenteren we een voorbeeld van SWIP assay geïnduceerd door AMPH behandeling. Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de test setup zoals hierboven beschreven. Voor de handmatige assay, ongeveer 8-10 leeftijd gesynchroniseerde laat L4 fase wormen verzameld met een wimper of platina worden halen en geplaatst in een plek glasplaat gevuld met 40 µL van 200 mOsm/L sacharose (bedieningsoplossing) of sacharose met 0,5 mM AMPH en getest voor SWIP.
Wanneer dieren zwemmen stoppen (dat wil zeggen, vertonen SWIP), ze snel zinken naar de bodem van de put en niet verplaatst. Daarom is de discriminatie tussen dieren die nog zwemmen op het oppervlak van het water ten opzichte van degenen die stabiel op de bodem van de put zijn is heel eenvoudig. Allermeest naar de wormen getest in control oplossing zwemmen voortdurend voor ten minste 10 minuten, terwijl onder AMPH behandeling, het aantal dieren vertonen SWIP geleidelijk toeneemt. Het maximale percentage dieren vertonen SWIP is evenredig aan de concentratie van AMPH gebruikt1,5,13. Wanneer DAT-1 knock-out (dat-1) wormen worden getest in bedieningsoplossing, vertonen 40-70% wormen SWIP binnen 10 minuten4,13. Dit resultaat is vergelijkbaar met het percentage verlamd dieren gemeten bij wild-type dieren behandeld met 0,5 mM AMPH (Figuur 2).
Wormen blootgesteld aan sacharose of sacharose met AMPH vertonen geen SWIP in de eerste minuut van observatie (Figuur 2). Echter, terwijl wormen behandeld met saccharose zwemmen voor 10 minuten blijven, wormen behandeld met AMPH beginnen te vertonen SWIP na 2 minuten van behandeling en na 10 minuten, 66 ± 3% dieren vertonen SWIP (Figuur 2).
Voor de geautomatiseerde analyse, video's van wormen onder controle of AMPH behandelingen worden geregistreerd één worm tegelijk met behulp van een video-opname-software. Een computertraceringssoftware wordt gebruikt voor het bijhouden van worm pak slaag en de resulterende gegevens worden geïmporteerd en geanalyseerd met het pak van de software. Monsters van de serie kaarten van dieren blootgesteld aan controle of AMPH, weergave actief bewegen dieren in rood en verlamd wormen in het groen, zijn afgebeeld in Figuur 3.
Figuur 1 : Assay ingesteld voor SWIP. Gravid volwassen wild-type (N2) wormen waren lysed met natriumhypochloriet/NaOH behandeling om embryo's vrij te geven. De embryo's waren mogen uitkomen en uitgroeien tot gesynchroniseerde L1 larven in de buffer van de M9 voor 14u op een shaker en vervolgens verguld op een plaat van de NGM bezaaid met NA22 bacteriën. Na 42-48 h waren late L4 fase larven visueel geïdentificeerd onder de stereoscoop en geplukt met een wimper te halen in een plek plaat met of zonder amfetamine in sacharose bedieningsoplossing en scoorde voor SWIP handmatig of via geautomatiseerde analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Amphetamine-geïnduceerde SWIP met behulp van handmatige assay. Wormen in sacharose of sacharose met 0,5 mM amfetamine (AMPH) gescoord visueel voor SWIP gedrag elke minuut met behulp van een stereoscoop. Het percentage van dieren die exposerende SWIP werd berekend door het aantal verlamd wormen door het totale aantal wormen vehiculumcontrolegroep voor elk punt van tijd, en vervolgens het resultaat vermenigvuldigen met 100. Het percentage van wormen blootgesteld aan AMPH (blauwe vierkantjes) tonen SWIP verhogingen overuren, terwijl de onbehandelde wormen (rode cirkels) blijven zwemmen tijdens de 10-minuten-venster. N voorstelt het aantal dieren in elke groep getest. Foutbalken geven de standaardfout van middelen (SEM). Statistische significantie werd beoordeeld door het uitvoeren van two-way ANOVA met Bonferroni meerdere vergelijkingstest (p < 0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Amphetamine-geïnduceerde SWIP via geautomatiseerde analyse. Video's van wormen in sacharose of sacharose met 0,5 mM AMPH werden opgenomen met behulp van een camera gemonteerd op een stereoscoop. Zwemmen video's van individuele wormen werden bijgehouden met een tracking-software en geanalyseerd met behulp van software pak bijhouden. Warmte kaarten werden gegenereerd uit de gegevens waar rode gebieden tonen de wormen die actief bewegen, en groene gebieden aangeven verlamd wormen. Elke experimentele groep is vertegenwoordiger van 6 dieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een gedrags assay, SWIP, in C. elegans. Dit protocol is eenvoudig en ongecompliceerd met geen grote technische hindernissen maken van deze test zeer gebruiker vriendelijk. Er zijn echter enkele kritieke aspecten die worden genomen moeten om het effectief uitvoeren van de bepaling.
Zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de wormen gebruikt voor de assay goed gevoed, aangezien dieet beperking SWIP17 beïnvloedt. Zachte behandeling van wormen terwijl plukken aangezien zo goed getimede natriumhypochloriet/NaOH behandeling tijdens cellysis zijn kritische stappen, mogelijk van trauma tijdens plukken (vaker bij het gebruik van een platina pick) of langdurige blootstelling van embryo's tot natriumhypochloriet/NaOH oplossing permanente schade aan de wormen18 en dus hun vermogen om te zwemmen in gevaar brengen.
Steriele technieken moeten worden gevolgd om besmetting te voorkomen. Besmetting van de agar platen compromissen van de gezondheid van de dieren en dus verandert hun vermogen om te zwemmen. Klein verschil in het percentage dieren vertonen SWIP kan worden waargenomen met behulp van agar platen bezaaid met verschillende stammen van E. coli bacteriën (NA22, OP50, etc.). In ons protocol gebruiken we NA22 om de opbrengst van een groot aantal wormen.
Glas-spot platen, gebruikt tijdens de SWIP assay, zijn voorkeur aan plastic platen, omdat ze worden grondig, gesteriliseerde met autoclaaf gewassen kunnen en hergebruikt wanneer verschillende soorten drugs worden getest.
Een andere belangrijke factor beschouwd in een SWIP assay is de osmolariteit van de vloeibare media waarin de dieren getest19 worden. In ons protocol gebruiken we sacharose te brengen van de osmolariteit van water tot 200 mOsm/L waarvan werd eerder aangetoond een optimale voorwaarde voor de dieren (Blakely RD. persoonlijke mededeling). Water met een gecontroleerde osmolariteit verdient de voorkeur omdat het elimineert eventuele verschillen in de kwaliteit van het water over meerdere tests uitgevoerd verschillende dagen, weken of maanden. Met name vertonen dat-1 en wild-type dieren behandeld met AMPH geen SWIP als Zoute oplossingen (bijvoorbeeld M9 oplossing) worden gebruikt als controle media.
De tijd die nodig is voor de meeste van de dieren te exposeren SWIP kan iets wijzigen onder verschillende worm stadia (L1-L4). Bijvoorbeeld, meldde Masoudi et al. (2014) dat na 5 min 80% van dat-1 L1 dieren nog zwemmen, dus slechts 20% van de dieren SWIP vertonen. Aan de andere kant, zwemmen slechts 50% van L4 dat-1 dieren nog na 5 min20. Daarom is het belangrijk dat dieren getest voor SWIP vehiculumcontrolegroep worden op de dezelfde leeftijd. We hebben onze assay gebruik altijd laat L4 geënsceneerd dieren geoptimaliseerd. Laat L4 larven hebben het voordeel dat ze gemakkelijk herkenbaar zijn onder andere de larvale stadia omdat, in dit stadium, dieren hun volwassen grootte hebben bereikt en vertonen een karakteristiek dunne scheidingslijn tussen de witte vlek in het midden van hun lichaam dat zal later onderscheiden in een volwassen vulva. De duurtijd van de bepaling is ook van cruciaal belang. Bijvoorbeeld, na 15 minuten 90% van L4 dat-1 mutanten vertonen SWIP maar op later tijdstip (30 min), slechts 60% van hen vertonen SWIP20.
De geautomatiseerde SWIP assay elimineert menselijke fouten en verbetert de high-throughput screening ten aanzien van manuele testen. Echter, het bijhouden van software programma's zijn tijdrovend, omdat ze kunnen alleen een enkele worm tegelijk bijhouden.
Met betrekking tot andere C. elegans DA-afhankelijke gedrag is SWIP een minder tijdrovende soort assay. Bijvoorbeeld, is de basale vertragende reactie2 niet een onmiddellijke-soort van test. In feite, wormen moeten chronisch worden gevoed met de drugs, en dit kan resulteren in penetrant en af-target effecten. Dus, het kan niet zo effectief op het scherm voor drugs.
Een van de belangrijke toepassingen van SWIP is het scherm voor verschillende drugs dat doel het Dopaminerge traject. In gevallen waar de drugs, niet oplosbaar in water (bijvoorbeeld mazindol zijn), moeten juiste verdunningen worden uitgevoerd om het bereiken van concentraties waar de vervoerder oplossing is niet giftig voor de wormen. Bovendien, als verschillende concentraties van de dezelfde drug gebruikte5,13,14, dosis / respons-curven kunnen ook analyseren. Bijvoorbeeld, kan de snelheid van progressie (helling van de curve van dieren per minuut, Figuur 2) worden gerapporteerd als functie van de concentratie en gebruikt om te vergelijken de effecten van verschillende drugs (bijvoorbeeld AMPH vs cocaïne).
Wanneer SWIP wordt gebruikt voor het onderzoeken van het werkingsmechanisme van drugs op de Dopaminerge synapsen, moet aandacht worden besteed als resultaten worden uitgebreid tot andere dieren. Bijvoorbeeld, is imipramine, een specifieke inhibitor van de omwenteling van de zoogdieren noradrenaline vervoerder (NET) gebruikt voor het opwekken van DA-bemiddelen SWIP in N2 dieren4. C. elegans doet niet synthetize noradrenaline en dus niet NET doet express. De vervoerder C. elegans DA deelt echter homologie met zoogdieren NET21. Om deze reden tonen drugs die zijn specifieke remmers van zoogdieren NET en hebben beperkte effecten op zoogdieren DAT (bijvoorbeeld, imipramine) hoge selectiviteit aan C. elegans DAT. Dus misschien soorten selectiviteit beperken ons vermogen om te extrapoleren bevindingen van C. elegans voor de mens.
De belangrijkste factor om te overwegen wanneer ontwerpen SWIP testen is de integratie van experimenten waaruit blijkt dat SWIP wordt gemedieerd door het Dopaminerge systeem. In feite, kan verminderde zwemmen worden gegenereerd door andere factoren dan genen verwant met het systeem van de DA (bijvoorbeeld algemene gebreken in de contractie van de spieren). Om ervoor te zorgen dat SWIP is inderdaad gemedieerd door DA, moeten protocollen zijn experimenten met dieren waarin DA heeft uitgeput. Dit kan worden bereikt door ofwel met behulp van knock-out dieren expressie van kat-2, de C. elegans homologe van de tyrosine hydroxylase, oftewel de snelheidslimieten enzym voor DA synthese of door vooraf behandelen wild-type dieren met reserpine, ontbreekt een medicijn dat ervoor zorgt dat DA uitputting van blaasjes3. Bijvoorbeeld, toonde McDonald et al.3 dat basale SWIP waargenomen in dat-1 mutanten toen deze dieren vooraf behandeld met reserpine waren werd teruggevonden. Dit resultaat wijst erop dat SWIP DA-gemedieerde. Aan de andere kant, met behulp van kat-2, dat-1 en mutanten ontbreekt expressie van elk van de Dopaminerge receptoren, Safratowich et al. (2014) aangetoond dat het trace amine β-phenylethylamine (βPEA) SWIP binnen 1 minuut van behandeling induceert onafhankelijk van DA maar door directe activering van het ligand-gated ion kanaal LGC-5514. De auteurs toonden dat βPEA - en DA-geïnduceerde SWIP mechanistically verschillend zijn en ze kunnen worden gemakkelijk gediscrimineerd experimenteel. In feite, terwijl βPEA-geïnduceerde SWIP is DA- en dop-3-onafhankelijke, bereikt het maximale waarden binnen 1 min en snel afneemt na 2 min14, DA-gemedieerde SWIP is kat-2 en dop-3 afhankelijk en is in wezen een nul na 1 minuut (Figuur 2). Dus, er is een groot verschil in de benodigde tijd voor het bereiken van de maximale effecten, en dit laat toe om snel onderscheid maken tussen de twee fenomenen: 1) de snel βPEA-geïnduceerde SWIP binnen 1 minuut verkregen door directe activering van de LGC-55-kanalen en 2) de trage DA-gemedieerde SWIP die optreedt wanneer een overschot van extracellulaire DA na verloop van tijd (10-15 min bouwt) en de DA receptoren DOP-3 zijn overstimulated3.
Kortom, met de juiste set van experimenten, waaronder het gebruik van knock-out dieren voor Sleutelspeler genen van de Dopaminerge systeem (kat-2, dat-1, dop-3) en het gebruik van drugs afbreken DA opslagplaatsen (reserpine), SWIP geweest met succes gebruikt ophelderen van het werkingsmechanisme van drugs zoals AMPH5,13, βPEA14,15 en azaperone6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Osama Refai van Dr. Randy Blakely van lab voor begeleiding met de geautomatiseerde analyse van SWIP. Dit werk werd gesteund door de financiering van NIH R01 DA042156 LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
