Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Плавательный паралич индуцированных для оценки допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans

Published: April 3, 2019 doi: 10.3791/59243
Automatic Translation
1, 2, 1,3,4
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Summary

Плавательный вызванных паралич (SWIP) является устоявшейся поведенческих пробирного используется для изучения основных механизмов допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans (C. elegans). Однако отсутствует подробный метод для выполнения анализа. Здесь мы опишем пошаговое протокол для SWIP.

Abstract

Плавательный assay, указанных в настоящем Протоколе является действенным инструментом для определения белков, регулирующих дофаминергические синапсы. Подобно млекопитающих, допамин (DA) контролирует несколько функций в C. elegans , включая обучение и двигательной активности. Условия, стимулировать да выпуска (например, амфетамин (AMPH) лечения) или что предотвратить да Распродажа (например, животных, не хватает да транспортера (dat-1) которые неспособны reaccumulating Да в нейроны) генерировать избыток внеклеточного да в конечном итоге приводит в стабилизированном опорно. Это поведение особенно очевидна, когда животные плавать в воде. В самом деле хотя одичал тип животных по-прежнему плавать в течение длительного периода, dat-1 null мутантов и одичал тип относились с AMPH или ингибиторы да транспортера опускаться на дно колодца и не двигаться. Это поведение называется «Паралич индуцированных плавательный» (SWIP). Хотя SWIP assay устоявшейся, отсутствует подробное описание метода. Здесь мы опишем пошаговое руководство для выполнения SWIP. Для выполнения анализа, конце личиночной стадии-4 животных помещаются в стеклянной пластины пятно, содержащий решение управления сахарозы с или без AMPH. За их поведение плавательный, либо вручную путем визуализации под стереоскоп автоматически записи с камеры смонтированы на стереоскоп забил животных. Видео затем анализируются с помощью отслеживания программного обеспечения, которое дает визуальное представление обмолота частоты и паралич в виде тепловых карт. Ручной и автоматизированной системы гарантируют легко количественной индикации животных плавательный способности и тем самым облегчить скрининга для животных, принимая мутации в системе дофаминергической или вспомогательные генов. Кроме того SWIP может использоваться для выяснения механизма действия наркотиков например AMPH.

Introduction

Животные выполняют разнообразные врожденные и сложных поведений посредничестве различных нейромедиаторов, координируется замысловатые сигнальных процессов. Нейротрансмиттеров допамина (DA) опосредует высоко сохранены поведения различных видов, включая обучение, моторики и вознаграждение обработки.

Почвы нематоду C. elegans, с относительно простой и хорошо сопоставленных нервной системы, состоящей из всего 302 нейронов, показывает заметно сложного поведения, включая многие, которые регулируются да как спаривания, обучение, нагула, передвижения и откладки 1. среди других особенностей, короткий жизненный цикл, простота обработки и сохранения сигнальных молекул, выделить преимущества использования C. elegans как модель для изучения нейронной основе сохранившихся поведения.

Гермафродит C. elegans содержит восемь дофаминергических нейронов; Кроме того самец содержит шесть дополнительных пар для спаривания целей. Как и млекопитающие эти нейроны синтезировать да и выразить да транспортера (DAT-1), мембранный белок, найдены исключительно в дофаминергических нейронов, который перевозит Да, выпущенный в синаптическую щель обратно в дофаминергических нейронов. Кроме того большинство белков, участвующих в каждом шаге синтеза, упаковки и выпуск да высоко консервируют между червями и людей, и, как у млекопитающих, да модулирует кормления поведения и передвижения в C. elegans2.

C. elegans ползет на твердых поверхностях и плавает с характерным обмолота поведением в воде. Интересно, что мутанты, отсутствует выражение DAT-1 (dat-1) обхода обычно на твердой поверхности, но не для поддержания плавательный при погружении в воду. Это поведение был назван индуцированных плавательный паралич, или SWIP. Предыдущие эксперименты показали, что SWIP, частично вызваны избытком Да в синаптическую щель, что в конечном итоге overstimulates D2-как постсинаптических рецепторов (DOP-3). Хотя первоначально определенных в dat-1 нокаут животных3, SWIP наблюдается также в одичал тип животных, препаратами что блок деятельность DAT (например, имипрамин4) и/или побудить да выпуска (например, амфетамин,5). С другой стороны фармакологической или генетических манипуляций, предотвращения синтеза и выпуск да и блокирование DOP-3 рецепторов функция предотвращения SWIP6. Взятые вместе, эти уже опубликованных данных создали SWIP как надежный инструмент для изучения поведенческие эффекты, вызванные мутированными белков внутри дофаминергические синапсы3,4,7 и использоваться для Форвард генетических экраны для идентификации Роман регулирования пути, участвующие в DA сигнализации7,8,9,10,,1112. Кроме того путем предоставления легко количественной индикации лекарственно индуцированные поведения в живых животных, SWIP включает разъяснение механизмов действия наркотиков, как амфетамин (AMPH) и азаперон на дофаминергические синапсы5, 6 , 13 , 14 , 15.

Протоколы для выполнения анализов SWIP были описаны до16. Здесь мы подробно описать, методологии и программы установки для выполнения анализа с целью обеспечения визуального руководство для C. elegans сообщества эффективно выполнять SWIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка решений и средств массовой информации

  1. Подготовить M9 буфера путем растворения KH2PO4 3.0 g (22.05 мм), Na2HPO4 g 6.0 (42.2 мм) и g (85,5 мм) NaCl 5.0 в 1 Л газобетона деионизованной воды. После автоклавирования добавьте 1,0 мл 1 М MgSO4 (12 g окончательного объема газобетона деионизованной воды 100 мл). Смесь 100 мл в результате 10 x M9 с 900 мл ячеистого деионизированной воды, чтобы сделать раствор 1 x.
  2. Чтобы сделать яйцо буфера, растворяют 6.896 г NaCl (118 мм), 3.578 г хлористого калия (48 мм), 0,294 g CaCl2-2 H2O (2 мм), 0,406 g MgCl2-6 H2O (2 мм) и 5.958 g (25 мм) из HEPES в 1 Л газобетона деионизованной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,3, использующая NaOH.
  3. Готовят раствор свежего гипохлорита натрия/NaOH, добавив 1 мл раствора гипохлорита натрия 5-6% (Блич) и 180 мкл 10 N NaOH до 3,8 мл деионизованной воды.
  4. Вешу 60 г сахарозы и растворить в газобетона деионизированной воды в окончательный объем 100 мл сделать 60% раствора сахарозы.
  5. Растворите 0,684 г сахарозы в 10 мл газобетона деионизированной воды, чтобы сделать 200 мм сахарозы. Проверка и регулировка к тому же осмолярности, используя осмометре. 1 мл аликвоты в 1,5 мл microcentrifuge трубы и заморозить при температуре-20 ° C.
  6. Весят 0,184 г AMPH (молекулярная масса 184.75 г/моль) и растворяют в 10 мл деионизированной воды, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм. Смешайте 2 мкл Стоковый раствор в 400 мкл воды, чтобы сделать рабочий раствор 0,5 мм.
  7. Подготовка питательной роста СМИ (НГМ) пластины
    1. Смешайте 3 g NaCl (52.65 мм), 20 г Пептон, 25 g, bacto агар и 975 мл обессоленной воды в колбу Эрленмейера 2 Л. Включают бар магнитные перемешать и автоклав (121 ° C, 15 PSI) за 1 час с использованием жидкого цикла.
    2. Здорово и поддерживать температуру в около 50 ° C, поставив флакон на подогреватель помешивая. Добавить 0,5 мл холестерин (5 мг/мл в этиловом спирте), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 М CaCl2 и 25 мл 1 М калия фосфат буфера, рН 7,4 (108.3 g KH2PO4, 35.6 g K2HPO4 деионизированной воды на 1 Л).
    3. Пипетка 25 мл в 100 мм x 15 мм пластины и Петри и позволяют укрепить средства массовой информации. Храните пластины вниз на 4 ° C в коробке на срок до 4 недель.
  8. Подготовка бульон Lysogeny бульон (LB)
    1. Растворяют 5 g LB порошка смеси в 200 мл обессоленной воды в колбу Эрленмейера. Автоклав для 30 минут, используя жидкий стерилизации цикла. Разрешить отвар охладить вниз. Хранить при комнатной температуре в течение 1-2 недель.
  9. Подготовка NA22 бактериальной пластин
    1. Используйте кончик стерильной пипеткой или стерильной бактериальных цикла испещрять LB пластины с небольшой объем бактерий E. coli NA22 из глицерина запасов и перевернутом инкубировать пластину в инкубаторе 37 ° C ночь расти изолированной колонии. Выбрать и внедрить единую колонию в 200 мл LB отвара, подготовленную на этапе 1.8 и пусть растут на ночь при 37 ° C на тряску платформе.
    2. Для заполнения пластины, отказаться от 200 мкл бактериальной культуры на плиты NGM подготовленного ранее на шаге 1.7 и распространение с стерильных стеклянных хоккейная клюшка. Пусть плит сухой на ночь или дольше под капотом и перевернутом хранить в герметичной упаковке при 4 ° C.
  10. Чтобы сделать ресницы/платина инструмент выбрать червей, клей толстые ресницы или платиновой нити в стакан пипетка Пастера, с использованием супер клей. Отрежьте кончик ресниц под углом с помощью лезвия бритвы. Кроме того горелка Бунзена может использоваться для расплава кончиком Пипетки стеклянные вокруг платиновой нити накаливания.

2. C. elegans животноводства

Примечание: Культура-дикого N2C. elegans нагрузку на кишечной палочки NA22 пластины. Антибиотикорезистентность методы описаны ниже.

  1. Подготовка червь культуры
    1. Чтобы сделать закваски червей, вырезать небольшой кусок агар с плиты, содержащих сытых животных и перенести его на тарелку бактерии E. coli NA22 подготовлен на шаге 1.9 с помощью стерильных шпателя. Инкубируйте пластины при 20 ° C для 3-4 дней. Под микроскопом стерео визуально подтвердите присутствие взрослых, беременных.
  2. Подготовка синхронизированных населения червей
    1. Соберите беременных взрослых по крайней мере 2 пластины с дозирования газобетона деионизированной воды вокруг пластину, используя шприц бутылку. Аккуратно водоворот пластину выбить червей и собрать червей в 15 мл полистирола Конические трубки, с помощью одноразовых пластиковых дозаторов.
    2. Спин вниз по трубе в центрифуге на 140 x g на 2 мин Пелле червей, а затем удалить супернатант при помощи вакуумного насоса или с построенный в лаборатории вакууме.
    3. Ресуспензируйте и мыть червей, заполнив трубки с газобетона деионизированной воды и смеси и центрифуги на 140 x g на 2 мин аспирационная супернатант и повторить последний шаг второй раз или до тех пор, пока черви ясно от бактерий (вода появляется ясно, когда смешанная с червями).
    4. Добавьте 5 мл раствора свежеприготовленные гипохлорита натрия/NaOH (шаг 1.3) червь гранулы и быстро перемешать с помощью вихря. Инкубируйте трубку на рокер для около 4-8 мин. Время инкубации с раствор гипохлорита натрия/NaOH колеблется от 4-8 минут на основе качества запасов натрия гипохлорита раствор (Блич).
    5. Капнуть каплю (2-50 мкл) раствора, содержащего червей на стекло микроскопа и проверять каждые 2 мин под микроскопом для лизиса червя. Когда лизированы около 70% червей и выпускаются яйца, заполнить трубу с яйцо буфера подготовлен на шаге 1.2 и немедленно центрифуги за 1 мин на 140 x g Пелле эмбрионы и каркасы шнековый.
    6. Аспирационная супернатант и помыть лепешка 3 раз, заполнив каждый раз трубку с яйцо буфера. Спин вниз на 140 x g за 1 мин и удалить супернатант каждый раз. Лепешка становится белым в конце мойки.
    7. После окончательной стирки отделите эмбрионы от мертвой туши в 30% раствора сахарозы. Добавьте 5 мл газобетона деионизованной воды гранулы, Ресуспензируйте и добавьте 5 мл 60% сахарозы, подготовленную на этапе 1.4. Тщательно перемешать и центрифуги на 160 x g за 6 мин.
    8. Для переноса эмбрионов, плавающие в верхней мениска в свежий 15 мл Конические трубки Используйте стеклянной пипетки Пастера. Не принимайте более чем 3-4 мл. Чтобы удалить все оставшиеся сахарозы, мыть эмбрионы 3 раза газобетона водой центрифугированием при 140 x g на 3 мин, удаление супернатант и resuspending гранулы (и заполнения трубки) каждый раз.
    9. Повторите автомойки с 1 x M9 буфера. После окончательной стирки Ресуспензируйте гранулы в 10 мл M9. Оставьте трубы на шейкер на ночь (не более 14 h) для яиц люк в личинок L1. Черви останется в личиночной стадии L1 из-за нехватки продовольствия.
    10. Мыть L1 личинки 3 раза с газобетона водой, чтобы удалить любые феромоны, выпущенная личинки центрифугированием при 140 x g на 2 мин Ресуспензируйте личинки в 1 мл воды. 1:10 сделать разведение червей в воде, Пипетка 10 мкл падение на слайде стекла, надел coverslip и подсчитать количество червей под стереоскоп. Повторите это дважды и средняя результаты.
    11. Пипетки, объем червей, соответствует около 1000 червей на NA22 пластину, (который был ранее доведен до комнатной температуры), поместив небольшой капли на плите. Оставьте пластину половин открытого, пока падение высыхает. Затем крышка и инкубировать вниз головой в инкубаторе 20 ° C около 44-48 h или червей до поздней стадии L4, как подтвердил визуально под стереомикроскопом. Теперь черви готовы пройти тестирование на SWIP.

3. SWIP

Примечание: Мы описываем ручной метод оценки SWIP в одичал типа червей, получавших AMPH. Мы также кратко обсудить отслеживания червей и дальнейшего анализа кинетики червя, используя автоматизированный червь трекер и отслеживания программного обеспечения, которые ранее были описаны Hardaway et al.10.

  1. Ручной метод для проверки SWIP
    1. Аликвота 40 мкл 200 мОсм/Л раствора сахарозы с или без 0,5 мм AMPH в месте стеклянной пластины. В стереоскоп забрать, 8-10 поздно L4 стадии червей с ресниц или платины выбрать и погружать забрать в пластине, содержащие решения до тех пор, пока червей перейти от подбора и плавать в раствор. Обратите внимание на количество червей, взял в колодец, запустить таймер, наблюдать и записывать количество червей выставке SWIP каждую минуту Марк.
    2. Скопируйте данные в электронную таблицу и рассчитать процент червей, парализована путем деления числа червей, парализована в каждую минуту, общее количество червей, тестирование по всему анализ и умножить на 100. Скопируйте значения % в любой графический и статистического программного обеспечения и сюжет формат данных с процент значений по оси Y и время по с помощью диаграммы XY оси X.
    3. Выполняйте двустороннюю ANOVA, следуют пост hoc анализа (например, Бонферрони после тестирования) для проверки статистической значимости среди управления, AMPH групп и время лечения.
  2. Автоматизированный анализ SWIP
    1. Выполните автоматизированный анализ на одного червя в то время. Протокол для установки камеры, червь трекера программного обеспечения и сценарий для запуска программного обеспечения отслеживания анализа подробно описаны в Hardaway et al.16.
    2. Вкратце место одного конца L4 стадии гермафродита в стеклянной пластины пятно использованием ресниц забрать, как описано в методе вручную в разделе 3.1.2. Запись видео плавательный одного червя в то время и использовать трекер программное обеспечение червь для вычисления частоты изгибы тела.
    3. Выполните сценарий, предоставленный с помощью отслеживания программного обеспечения для получения червь обмолота частоты и генерировать тепло карт из данных обмолота червя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы представляем пример SWIP пробирного индуцированных AMPH лечения. Рисунок 1 показывает схематическое представление пробирного настройки, как описано выше. Для ручного анализа, около 8-10 лет, синхронизированные конце L4 стадии черви собираются с ресниц или платины выбрать и помещены в место стеклянной пластины с 40 мкл 200 мОсм/Л сахарозы (решение управления) или сахароза с 0,5 мм AMPH и испытанию SWIP.

Когда животные остановить плавательный (то есть, экспонат SWIP), они быстро опускаться на дно колодца и не двигаться. Таким образом дискриминация между животными, которые до сих пор плавают на поверхности воды по сравнению с те, что неуклонный в нижней части скважины очень проста. Большинство червей испытания в плавать решение управления непрерывно в течение по крайней мере 10 минут, тогда как под AMPH лечения, количество животных, экспонируется SWIP постепенно увеличивается. Максимальный процент животных экспонируется SWIP пропорциональна концентрации AMPH используется1,5,13. Когда DAT-1 нокаут (dat-1) червей проверяются в решение управления, 40-70% червей экспонат SWIP в течение 10 минут4,13. Этот результат сопоставим с процент парализована животных измеряется в одичал тип животных, получавших 0,5 мм AMPH (рис. 2).

Черви, подвергается сахарозы или сахароза, содержащие AMPH не показывать SWIP на первой минуте наблюдения (рис. 2). Однако хотя Черви, относились с сахарозой по-прежнему плавать в течение 10 минут, червей, получавших AMPH начинают exhibit SWIP после 2 минут лечения и через 10 минут, 66 ± 3% животных показывают SWIP (рис. 2).

Для автоматического анализа, записываются видео червей под контролем или AMPH лечения одного червя в то время, используя программное обеспечение записи видео. Компьютер, программное обеспечение отслеживания используется для отслеживания червь обмолота и результирующие данные импортированы и проанализированы с костюмом программного обеспечения. Образцы карт тепла животных подвергаются AMPH или управления, отображение активно перемещение животных в черви красные и парализована в зеленом, являются показано на рисунке 3.

Figure 1
Рисунок 1 : Assay создан для SWIP. С лечением гипохлорита натрия/NaOH выпустить эмбрионы были лизированы беременных взрослых червей (N2) одичал тип. Эмбрионы были разрешено люк и развивать в синхронизированный L1 личинок в буфере M9 для 14 h на шейкере и затем покрытием на плите NGM семенами с NA22 бактериями. После 42-48 h поздней стадии личинки L4 были визуально определили под Стереоскоп и взял с ресниц забрать в месте плиту с или без стимуляторов в растворе сахарозы управления и забил SWIP вручную или с помощью автоматического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Амфетамин индуцированной SWIP, используя ручной пробирного. Черви в сахарозы или сахароза с 0,5 мм амфетамин (AMPH) были визуально забил SWIP поведение каждую минуту с помощью стереоскоп. Процент животных, которые выставке SWIP был рассчитан путем деления числа парализована червей на общее количество червей assayed для каждой точке времени и затем умножением на 100. Процент червей, подвергается AMPH (синий квадрат) показаны SWIP увеличение сверхурочных, необработанной червей (красные круги) по-прежнему плавать в течение 10-ти минутах окна. N представляет количество животных, протестированы в каждой группе. Планки погрешностей указывают стандартная ошибка средств (SEM). Статистическая значимость оценивалась путем выполнения двустороннего ANOVA с Бонферрони множественные сравнения теста (p < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Амфетамин индуцированной SWIP через автоматизированный анализ. Видео червей в сахарозы или сахароза с 0,5 мм AMPH были записаны с помощью камеры, установленной на стереоскоп. Плавательный видео отдельных червей были отслежены с отслеживания программного обеспечения и анализируются с помощью отслеживания программного обеспечения иска. Тепло карт были получены из данных, где красные области показывают червей, которые активно двигаются, и зеленые участки соответствуют парализована червей. Каждой экспериментальной группы является представителем 6 животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выполнения поведенческого анализа, SWIP, в C. elegans. Этот протокол является простым и ясным с без крупных технических препятствий, сделать очень пользователя этот assay дружественные. Тем не менее есть некоторые критические аспекты, которые необходимо рассмотреть для того, чтобы эффективно выполнять assay.

Осторожность следует обеспечить хорошо кормили, черви, используемые для assay так как диетическое ограничение затрагивает SWIP17. Нежный, обработка червей при комплектации как хорошо приурочен гипохлорита натрия/NaOH лечения во время лизис важнейшие шаги, как травмы во время комплектации (чаще при использовании Платиновый забрать) или длительного воздействия эмбрионов раствор гипохлорита натрия/NaOH привести к повреждению червей18 и таким образом ставят под угрозу их способность плавать.

Чтобы избежать загрязнения следует использовать стерильные приемы. Радиоактивное загрязнение плиты агара подрывает здоровье животных и таким образом изменяет их способность плавать. Незначительные различия в процентном содержании животных, экспонируется SWIP могут наблюдаться что использование плиты агара семенами с различных штаммов бактерий E. coli (NA22, ОР50, и т.д.). В нашем протокол мы используем NA22 давать большое количество червей.

Стекло пятно пластины, используемые в ходе анализа SWIP, предпочитают пластиковые пластины, потому что они могут быть тщательно промывают, газобетона и повторно используются при тестировании различных видов наркотиков.

Другим важным фактором будет считаться в SWIP assay является осмолярности жидких сред, в которых животные находятся протестированных19. В нашем протокол мы используем сахарозы довести осмолярности воды до 200 мОсм/Л, которая ранее была показана оптимальным условием для животных (Blakely RD. личное сообщение). Вода с контролируемой осмолярности является предпочтительным, поскольку он устраняет возможные различия в качества воды над несколько анализов, выполненных в разные дни, недели или месяца. В частности dat-1 и одичал тип животных, получавших AMPH не exhibit SWIP если соленые решения (например, раствор M9) используются в качестве средств массовой информации управления.

Время, необходимое для большинства животных выставлять SWIP можно слегка изменить среди различных червь этапов (L1-L4). Например Массуди et al. (2014) сообщила, что после того, как по-прежнему плавать 5 мин 80% животных dat-1 L1, таким образом только 20% животных exhibit SWIP. С другой стороны только 50% L4 dat-1 животных по-прежнему плавать после 5 минут20. Таким образом важно, что животные протестированы для SWIP являются assayed в том же возрасте. Мы оптимизировали наши пробирного, используя всегда поздно L4 устроили животных. Конце L4 личинки имеют преимущество быть легко узнаваемой среди других личиночных стадий, потому, что на данном этапе животных достигли их взрослого размера и демонстрируют характерные тонкой линии, разделяющей белое пятно в центре их органа, который будет позже дифференцироваться в зрелых вульвы. Важно также промежуток времени анализа. Например после 15 минут 90% L4 dat-1 мутантов выставку SWIP, но в позднее время (30 мин), только 60% из них проявляют SWIP20.

Автоматизированный SWIP устраняет человеческих ошибок и улучшает высокопроизводительного скрининга в отношении ручной анализов. Однако, отслеживание программного обеспечения программы много времени, поскольку только они могут отслеживать одного червя в то время.

В отношении других да C. elegans зависит от поведения SWIP — меньше времени тип пробирного. Например базальной Замедление отклика2 не является непосредственной тип анализа. В самом деле черви нужно хронически кормить с наркотиками, и это может привести к эффекты капиллярный и пробить. Таким образом она не может быть столь же эффективным для наркотиков.

Одно из основных применений SWIP является экран для различных лекарств, предназначенных допаминергических путей. В тех случаях, когда препараты не растворяется в воде (например, мазиндол) должны выполняться надлежащим разведений достичь концентрации где перевозчик решение не является токсичным для червей. Кроме того если различные концентрации же препарата используется5,13,14, доза реакция кривых также могут быть проанализированы. Например скорость прогрессирования (наклон кривой животных в минуту, рис. 2) можно как функция концентрации и используется для сравнения эффекты различных лекарственных препаратов (например, AMPH против кокаина).

Когда SWIP используется для изучения механизм действия препаратов на дофаминергические синапсы, следует уделять внимание, если результаты распространяются на других животных. Например чтобы побудить SWIP DA-посредником в N2 животных4был использован имипрамин, ингибитор конкретные млекопитающих норадреналина транспортера (нетто). C. elegans не не synthetize норадреналина и следовательно не выразить NET. Однако, C. elegans да транспортер разделяет гомологии с млекопитающих NET21. По этой причине препараты, которые являются конкретные ингибиторы млекопитающих NET и ограниченное воздействие на млекопитающих DAT (например, имипрамин) показывают высокую избирательность в C. elegans DAT. Таким образом виды избирательность может ограничивать нашу способность экстраполировать результаты от C. elegans для людей.

Наиболее важный фактор для рассмотрения при разработке SWIP анализов является включение экспериментов, доказав, что SWIP опосредовано дофаминергической системы. В самом деле нарушением плавательный могут создаваться факторы помимо генов, связанных с системой DA (например, общие дефекты в сокращение мышц). Чтобы гарантировать, что да действительно опосредуется SWIP, протоколы должны включать эксперименты, проведенные с животными, в которых были истощены да. Это может быть достигнуто путем либо с помощью нокаут животных отсутствует выражение Кот-2, C. elegans гомолог тирозин-гидроксилазы, который является фермент ограничения скорости для DA синтеза, или предварительно обрабатывая одичал тип животных с резерпин, наркотиков, что вызывает истощение да от везикулы3. К примеру McDonald et al.3 показал, что Базальные SWIP наблюдается в мутантов dat-1 была восстановлена при этих животных были предварительно обработаны с резерпин. Этот результат свидетельствует о том, что SWIP DA-опосредованной. С другой стороны с помощью cat-2, dat-1 и мутантов, отсутствует выражение каждого из допаминергических рецепторов, Safratowich et al. (2014) продемонстрировал, что трассировки Амин β-фенилэтиламин (βPEA) индуцирует SWIP в течение 1 минуты лечения независимо от Да но прямой активации иона лиганд закрытый канал14LGC-55. Авторы показали, что βPEA - и да индуцированной SWIP механистически разные, и они могут быть легко подвергнут экспериментально. В самом деле, в то время как βPEA-индуцированной SWIP DA - и dop-3-независимый, он достигает максимального значения в течение 1 мин и быстро уменьшается после 2 минут14, DA-опосредованной SWIP Кот-2 и dop-3 зависимых и это по сути ноль после 1 минута (рис. 2). Таким образом, существует большая разница в то время, необходимое для достижения максимального воздействия, и это позволяет быстро различать эти два явления: 1 быстро βPEA-индуцированной SWIP в течение 1 минуты, полученные путем прямой активации LGC-55 каналов и 2 медленно DA-опосредованной SWIP, которое происходит, когда избыток внеклеточного да нарастают с течением времени (10-15 мин) и рецепторов да DOP-3 overstimulated3.

В заключение с правильным набором экспериментов, которые включают в себя использование нокаут животных для генов ключевым игроком дофаминергической системы (cat-2, dat-1, dop-3) и использования наркотиков, разрушающих Да хранилища (резерпин), был SWIP успешно используется для выяснения механизм действия препаратов как AMPH5,13, βPEA14,15 и азаперон6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Доктор Осама Refai от д-р Рэнди Blakely лаборатории для руководства с автоматизированного анализа SWIP. Эта работа была поддержана финансирование из низ R01 DA042156 LC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil Reynolds wrap 1091835
Amphetamine Sigma 51-63-8  
Autoclave
Bacterial Incubator New Brunswick scientific M1352-0000
Bacteriological grade, Agar Lab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) Peptone BD REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Thorlabs U-CMAD3
Centrifuge  Eppendorf 5810R 15amp E215059
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5
Deionized water Millipore Z00QSV0WW Milli-Q
Depression glass spot plate Corning Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask ThermoFisher 4103-0250PK
Eye lash
Glass slide Fisherbrand 12-550-15
Graphing and statistical software Prism Graphpad 5
HEPES Sigma-Aldrich RB=H3375 & H7006
Hypochlorite Hawkins Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller Fisher BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate) Sigma-Aldrich RB=M0250 500 g
Magnesium sulfate (heptahydrate) Sigma-Aldrich M1880
Magnetic stir bar Fisherbrand 16-800-510 
Microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
NA 22 bacteria CGC
Nystatin Sigma 1400-61-9
Osmometer Advanced Instruments, Inc Model 3320
Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20A
Petriplates Falcon 351007
pH Meter Orion VersaStar Pro IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes Falcon 352095
Potassium Chloride Sigma-Aldrich  P9541
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 7778-77-0
Potassium Phosphate - DIBASIC Sigma-Aldrich P-8281
Potassium Phosphate - MONOBASIC Sigma-Aldrich P0662
Serological pipettes VWR 10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific 55S 12x16
Sodium Chloride Fisher RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate Fisher RB=S381
Spreadsheet MS office Microsoft Excel
Stereo Microscope Zeiss Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips Various 02-707-400
Sucrose Sigma-Aldrich RB=S5016
Superglue Loctite 1647358 .14 oz.
SwimR sofware 10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2 Worm Tracker 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software Virtualdub http://www.virtualdub.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
  2. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  3. McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
  4. Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
  5. Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
  6. Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
  7. Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
  8. Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
  9. Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
  10. Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
  11. Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
  12. Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
  13. Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
  14. Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
  15. Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
  16. Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
  17. Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
  18. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  19. Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
  20. Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
  21. Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).

Tags

Поведение выпуск 146 C. elegans поведение допамина сигнализации транспортер дофамина амфетамин пробуксовка
Плавательный паралич индуцированных для оценки допамина сигнализации в <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli,… More

Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli, L. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (146), e59243, doi:10.3791/59243 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter