Summary
Natation induite paralysie (SWIP) est un test comportemental bien établi utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents de la dopamine signalisation chez Caenorhabditis elegans (c. elegans). Toutefois, une méthode détaillée pour effectuer le test fait défaut. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour SWIP.
Abstract
Le test de natation décrit dans le présent protocole est un outil valable pour identifier les protéines réglementant le dopaminergique synapses. Tout comme les mammifères, la dopamine (DA) contrôle plusieurs fonctions chez c. elegans , y compris l’activité d’apprentissage et de moteur. Conditions qui stimulent la libération de DA (p. ex., les traitements stimulants (AMPH)) ou qui empêcherait DA clearance (p. ex., les animaux dépourvus du transporteur DA (dat-1) qui sont incapables de pourraient DA dans les neurones) générer un excès de DA extracellulaire au bout du compte résultant dans la locomotion inhibée. Ce comportement est particulièrement évident lorsque les animaux nagent dans l’eau. En effet, tandis que les animaux sauvage continue à nager pendant une période prolongée, dat-1 mutants nuls et sauvage traitement avec AMPH ou inhibiteurs du transporteur DA coulent au fond du puits et ne bougent pas. Ce comportement est appelé « Paralysie due Swimming » (SWIP). Bien que l’essai SWIP est bien établie, une description détaillée de la méthode fait défaut. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour effectuer SWIP. Pour effectuer le test, fin larvaire étape-4 animaux est placés dans une spot sur plaque de verre contenant une solution de saccharose contrôle avec ou sans AMPH. Animaux est notés pour leur comportement de nage soit manuellement par la visualisation sous un stéréoscope, soit automatiquement par l’enregistrement d’une caméra montée sur le stéréoscope. Vidéos sont ensuite analysées à l’aide d’un logiciel de suivi, ce qui donne une représentation visuelle de la fréquence de volée et paralysie sous forme de cartes de la chaleur. Les systèmes manuels et automatisés garantissent un affichage facilement quantifiable de la capacité de nage des animaux et ainsi facilitent le dépistage des animaux portant des mutations au sein du système dopaminergique ou gènes auxiliaire. En outre, SWIP peut servir à élucider le mécanisme d’action des drogues d’abus comme AMPH.
Introduction
Animaux exécutent une variété de comportements innés et complexes qui sont véhiculées par les différents neurotransmetteurs, coordonnés par les processus complexes de signalisation. La dopamine, un neurotransmetteur (DA) intervient dans des comportements hautement conservées à travers les espèces, y compris l’apprentissage, la fonction motrice et le traitement de la récompense.
Les nématodes du sol c. elegans, avec un système nerveux relativement simple et bien cartographiée consistant seulement 302 neurones, montre des comportements fortement complexes, dont beaucoup sont réglementées par DA comme accouplement, apprentissage, recherche de nourriture, la locomotion et la ponte 1. parmi les autres caractéristiques, cycle de vie court, facilité de manipulation et la conservation des molécules de signalisation, mettre en évidence les avantages de l’utilisation de c. elegans comme modèle pour étudier les bases neurales des comportements conservées.
L’hermaphrodite c. elegans contient huit des neurones dopaminergiques ; En outre, le mâle contient six paires supplémentaires pour fins d’accouplement. Comme les mammifères, ces neurones synthétisent DA et expriment le transporteur DA (DAT-1), une protéine de membrane trouve exclusivement dans les neurones dopaminergiques, qui transporte DA relâché dans la fente synaptique dans les neurones dopaminergiques. En outre, la plupart des protéines impliqués dans chaque étape de la synthèse, de conditionnement et de libération de DA est hautement conservée entre worms et les êtres humains et, comme chez les mammifères, DA module alimentation de comportements et de locomotion chez c. elegans2.
C. elegans se traîne sur des surfaces solides et nage avec un comportement caractéristique de s’emballer dans de l’eau. Fait intéressant, des mutants dépourvus d’expression du 1 DAT (dat-1) rampent normalement sur une surface solide, mais ne parviennent pas à maintenir la natation lorsqu’immergé dans l’eau. Ce comportement a été appelé natation induite une paralysie, ou SWIP. Des expériences précédentes ont démontré que SWIP, est en partie causée par un excès de DA dans la fente synaptique qui finalement surexcite les récepteurs postsynaptiques de D2-like (DOP-3). Bien qu’identifié à l’origine de dat-1 knockout animaux3, SWIP est également observée chez les animaux sauvage, traités avec des médicaments qui bloquent l’activité de DAT (p. ex., l’imipramine4) et/ou inciter la libération de DA (p. ex., stimulants5). En revanche, les manipulations pharmacologiques ou génétiques conjurer la synthèse et la libération de DA et bloquant la fonction des récepteurs DOP-3 empêchent SWIP6. Pris ensemble, ces données déjà publiées ont établi SWIP comme un outil fiable pour étudier les effets comportements de protéines mutées dans dopaminergique synapses3,4,7 et devant être utilisés pour avancer les écrans génétiques pour l’identification de nouvelles voies réglementaires impliquées dans DA signalisation7,8,9,10,11,12. En outre, en fournissant un affichage facilement quantifiable du comportement drogue-induite chez les individus vivants, SWIP permet à l’élucidation des mécanismes d’action des drogues comme l’amphétamine (AMPH) et azapérone à la dopaminergique synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocoles pour effectuer les dosages SWIP ont été décrits avant16. Ici, nous décrivons en détail la méthodologie et le programme d’installation pour effectuer le test avec le but de fournir un guide visuel pour la communauté de c. elegans remplir efficacement SWIP.
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Protocol
1. préparation des Solutions et des médias
- Préparer M9 tampon en dissolvant KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) et NaCl 5,0 g (85,5 mM) dans 1 L d’eau déionisée autoclavé. Ajouter 1,0 mL de 1 M MgSO4 (12 g dans un volume final de 100 mL d’eau désionisée autoclavé) après la stérilisation. Mélanger 100 mL de 10 x qui en résulte M9 avec 900 mL d’autoclave désionisée pour faire une solution de 1 x.
- Pour faire le tampon de le œuf, dissoudre 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), g 0,406 MgCl2-6 H2O (2 mM) et 5,958 g (25 mM) de HEPES dans 1 L d’eau déionisée autoclavé. Ajuster le pH de 7,3 à l’aide de NaOH.
- Préparer la solution de l’hypochlorite de sodium/NaOH frais en ajoutant 1 mL de 5-6 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel) et 180 µL de 10 N NaOH à 3,8 mL d’eau désionisée.
- Peser 60 g de saccharose et se dissolvent dans l’eau désionisée autoclavé pour un volume final de 100 mL pour faire 60 % solution sucrée.
- Dissoudre 0,684 g de saccharose dans 10 mL d’eau désionisée stérilisés à l’autoclave pour faire le saccharose de 200 mM. Vérifier et ajuster au même une osmolarité utilisant osmomètre. Faire des aliquotes de 1 mL à 1,5 mL microtubes à centrifuger et congeler à-20 ° C.
- Peser 0,184 g de AMPH (poids moléculaire 184.75 g/mol) et dissoudre dans 10 mL d’eau déminéralisée pour faire une solution stock de 100 mM. Mélanger 2 µL de la solution mère dans 400 µL d’eau pour faire la solution de travail de 0,5 mM.
-
Préparer des éléments nutritifs croissance plaques de médias (NGM)
- Mélanger 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptone, 25 g de bacto-agar et 975 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Inclure une barre magnétique remuer et autoclave (121 ° C, pression de 15 PSI) pendant 1 heure à l’aide de liquide.
- Laisser refroidir à et maintenir la température à environ 50 ° C en plaçant le ballon sur un appareil de chauffage tout en remuant. Ajouter 0,5 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2 et 25 mL de tampon de phosphate potassium 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 désionisée à 1 L).
- Pipetter 25 mL de chaque dans les plats de pétri 100 x 15 mm et autoriser les médias à se solidifier. Stocker les plaques à l’envers à 4 ° C dans une boîte pendant 4 semaines.
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Préparation du bouillon de Lysogénie (LB)
- Dissoudre 5 g de mélange de poudre LB dans 200 mL d’eau désionisée dans un Erlenmeyer. Cycle de l’autoclave pendant 30 minutes utilisant la stérilisation liquide. Laisser le bouillon refroidir. Conserver à température ambiante pendant 1 à 2 semaines.
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Préparation des plaques bactériennes NA22
- Utiliser un embout de la pipette stérile ou une boucle bactérienne stérile pour ensemencer un LB avec un petit volume de la bactérie e. coli de la NA22 du stock de glycérol et incuber la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour faire croître des colonies isolées. Choisir et introduire une seule colonie dans 200 mL de bouillon LB préparée à l’étape 1.8 et laissez pousser pendant une nuit à 37 ° C sur une plate-forme vibrante.
- Pour les plaques de graines, distribuer 200 µL de culture bactérienne sur les plaques NGM établi plus tôt dans l’étape 1.7 et étalez avec un bâton de hockey de verre stériles. Laisser les plaques sécher pendant une nuit ou plus sous une hotte et de mettre à l’envers dans une boîte hermétique à 4 ° C.
- Pour rendre l’outil cils/Palladium de choisir vers, coller un cils épais ou un filament de platine dans un verre à Pasteur pipeter avec de la colle super. Couper l’extrémité de la cil à un angle à l’aide d’une lame de rasoir. Par ailleurs, un bec Bunsen peut servir à faire fondre l’embout de la pipette de verre autour du filament de platine.
2. Elevage de c. elegans
Remarque : La culture sauvage N2C. elegans souche Escherichia coli NA22 plaques. Les méthodes de culture détaillées sont décrites ci-dessous.
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Préparation de la culture du ver
- Pour faire une culture starter de worms, couper un petit morceau d’agar d’une plaque contenant des animaux bien nourris et transférez-la sur une plaque de bactéries NA22 e. coli préparée à l’étape 1.9 à l’aide d’une spatule stérile. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 3 à 4 jours. Sous un microscope stéréo, visuellement confirment la présence d’adultes gravides.
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Préparation de population synchronisée de worms
- Recueillir les adultes gravides depuis au moins 2 plaques en distribuant de l’eau désionisée autoclavé tout autour de la plaque à l’aide d’un vaporisateur. Agiter doucement de la plaque pour déloger les vers et de collecter les vers dans un tube conique en polystyrène de 15 mL à l’aide d’une pipette en plastique jetable.
- Tournez en bas le tube dans une centrifugeuse à 140 x g pendant 2 min pour les vers de granule, puis aspirer hors surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou avec construit dans le vide de laboratoire.
- Remettre et laver les vers en remplissant le tube avec autoclavés eau désionisée et mélanger et centrifuger à 140 x g pendant 2 min. aspirer le surnageant et répéter ce dernier étape deux fois de plus ou jusqu'à ce que les vers sont claires des bactéries (l’eau apparaît clairement lorsqu’il est mélangé avec les vers).
- Ajouter 5 mL de solution d’hypochlorite de sodium/NaOH fraîchement préparés (point 1.3) dans le culot de ver et mélanger rapidement à l’aide d’un vortex. Incuber le tube sur un balancier pendant environ 4 à 8 min. Le temps d’incubation avec une solution d’hypochlorite de sodium/NaOH oscille entre 4 à 8 minutes selon la qualité de la solution stock hypochlorite de sodium (eau de Javel).
- Mettre une goutte d’eau (2 à 50 µL) de solution contenant worms sur une lame de microscope de verre et de vérifier toutes les 2 min sous le microscope pour la lyse de ver. Lorsque environ 70 % vers sont lysées et œufs sont libérés, remplir le tube avec le tampon de œuf préparé à l’étape 1.2 et immédiatement centrifuger pendant 1 min à 140 g pour les embryons de granule et vis sans fin de carcasses.
- Aspirer le surnageant et laver le culot 3 fois plus en remplissant le tube chaque fois avec le tampon de l’oeuf. Tournez en bas à 140 x g pendant 1 min et retirer le surnageant à chaque fois. La pastille devienne blanche à la fin du lavage.
- Après le lavage final, séparer les carcasses mortes dans une solution de saccharose 30 % sur les embryons. Ajouter 5 mL d’eau désionisée autoclavé au culot, resuspendre et ajouter 5 mL de 60 % de sucrose préparée à l’étape 1.4. Bien mélanger et centrifuger à 160 g pendant 6 min.
- Utiliser une pipette Pasteur en verre pour transférer les embryons flottant au ménisque supérieur dans un tube conique frais 15 mL. Ne prenez pas plus de 3 à 4 mL. Pour enlever toute saccharose restant, lavez les embryons 3 fois avec de l’eau stérilisé par centrifugation à 140 x g pendant 3 min, retirer le surnageant et resuspendant le culot (et le tube de remplissage) chaque fois.
- Répétez les lavages avec 1 tampon x M9. Après le lavage final, resuspendre le culot dans 10 mL de M9. Laisser les tubes sur un agitateur pendant la nuit (pas plus de 14 h) pour les œufs éclosent en larves L1. Vers restera en L1 stade larvaire due au manque de nourriture.
- Larves de lavage L1 3 fois avec de l’eau autoclavé pour enlever toute les phéromones libérés par les larves par centrifugation à 140 x g pendant 2 min. remettre en suspension les larves dans 1 mL d’eau. Faire un 01:10 dilution vers dans l’eau, pipette une goutte de 10 µL sur une lame de verre, chaussez un lamelle couvre-objet et compter le nombre de vers dans un stéréoscope. Répétez ceci deux fois et la moyenne des résultats.
- Pipette, le volume vers qui correspond à environ 1 000 vers sur un plat de NA22 (qui a été préalablement porté à température ambiante) en plaçant des petites gouttes sur la plaque. Laisser la plaque entrouverte jusqu'à ce que la goutte se dessèche. Ensuite la plaque de recouvrement et incuber à l’envers dans l’incubateur de 20 ° C pendant environ 44 à 48 heures ou jusqu'à ce que les vers atteint L4 tardivement, comme l’a confirmé visuellement sous un stéréomicroscope. Maintenant, les vers sont prêts à être testés pour SWIP.
3. SWIP
Remarque : Nous décrivons la méthode manuelle d’appréciation SWIP sauvage Worms traités avec AMPH. Nous discutons également brièvement le suivi vers et une analyse plus approfondie de la cinétique de ver à l’aide d’un tracker ver automatisé et un logiciel de suivi qui ont été décrites précédemment par Hardaway et al.,10.
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Méthode manuelle pour tester SWIP
- Aliquote 40 µL de solution de saccharose 200 mOsm/L avec ou sans 0,5 mM AMPH dans une plaque de verre de spot. Sous le stéréoscope, pick 8-10 fin-L4 étape vers avec un cil ou platine pick et submerger le prélèvement dans le plat contenant la solution jusqu'à ce que vers quittent la pioche et nagent dans la solution. Notez le nombre de vers pris dans le puits, démarrer le compte à rebours, observer et de consigner le nombre de vers présentant SWIP à chaque marque minute.
- Copier les données brutes dans un tableur, calculer le pourcentage de worms paralysés en divisant le nombre de vers paralysé à chaque minute par nombre total de worms testés tout au long de l’essai et multipliez par 100. Copier les valeurs de pourcentage dans un graphique et intrigue et un logiciel de statistique les données avec les valeurs de pourcentage sur l’axe des Y et le temps sur axe en utilisant le graphe XY X format.
- Effectuer bidirectionnelle ANOVA suivie d’analyse post-hoc (par exemple, Bonferroni après le test) pour tester la signification statistique entre contrôle, les groupes AMPH et les temps de traitement.
-
Analyse automatisée du SWIP
- Effectuer une analyse automatisée sur un seul ver à la fois. Le protocole de mettre caméra, le logiciel de traqueur de ver et le script à exécuter le logiciel de suivi analyse sont décrites en détail dans Hardaway et al.,16.
- Brièvement, placez un hermaphrodite de stade L4 fin unique dans une plaque de verre de spot utilisant un prélèvement de cil, comme décrit dans la méthode manuelle à la section 3.1.2. Enregistrer des vidéos de natation d’un ver dans le temps et utiliser le logiciel de traqueur de ver pour calculer la fréquence des courbes du corps.
- Suivez le script fourni avec le logiciel de suivi d’obtenir ver raclée fréquence et produire des cartes de chaleur d’après les données de volée de ver.
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Representative Results
Nous présentons un exemple de test SWIP induite par le traitement AMPH. La figure 1 montre une représentation schématique de l’installation d’essai tel que décrit ci-dessus. Le dosage manuel, environ 8-10 ans synchronisée fin vers stade de L4 est recueillies avec un cil ou platine et placé dans une plaque de verre spot rempli de 40 µL de 200 de saccharose mOsm/L (solution de contrôle) ou de saccharose avec 0,5 mM AMPH et testé pour SWIP.
Quand les animaux arrête natation (c.-à-d., pièce SWIP), rapidement, ils se déposent au fond du puits et ne bougent pas. Par conséquent, la discrimination entre les animaux qui nagent toujours sur la surface de l’eau par rapport à celles qui sont stables au fond du puits est très simple. La plupart vers testé en natation de solution de contrôle en continu pendant au moins 10 minutes, alors que sous traitement AMPH, augmente le nombre d’animaux présentant SWIP progressivement. Le pourcentage maximal d’animaux présentant SWIP est proportionnel à la concentration de AMPH utilisé1,5,13. Lorsque les vers de DAT-1 knockout (dat-1) sont testés dans la solution de contrôle, 40-70 % vers pièce SWIP dans 10 minutes4,13. Ce résultat est comparable au pourcentage des animaux paralysés mesurée chez les animaux sauvage traitée avec 0,5 mM AMPH (Figure 2).
Vers exposés à saccharose ou sucrose contenant AMPH ne montrent pas de SWIP dans la première minute d’observation (Figure 2). Toutefois, alors que vers traités avec saccharose continuent à nager pendant 10 minutes, vers traités avec AMPH commencent à pièce SWIP après 2 minutes de traitement et après 10 minutes, 66 ± 3 % animaux montrent SWIP (Figure 2).
Pour l’analyse automatique, les vidéos de worms sous contrôle ou traitements AMPH figurent un ver à la fois à l’aide d’un logiciel d’enregistrement vidéo. Un ordinateur logiciel de suivi est utilisé pour suivre la raclée de ver et les données résultantes sont importées et analysées avec le costume de logiciel. Échantillons de cartes de la chaleur des animaux exposés au contrôle ou AMPH, affichant activement déplacement des animaux dans les vers rouges et paralysés en vert, sont indiquées à la Figure 3.
Figure 1 : Test mis en place pour SWIP. Gravides adultes vers (N2) de type sauvage sont lysées avec traitement de l’hypochlorite de sodium/NaOH pour libérer des embryons. Les embryons ont été autorisés à éclore et se développer en synchronisée larves L1 dans un tampon M9 pendant 14 heures sur un agitateur et ensuite plaqués sur une plaque NGM ensemencée par des bactéries NA22. Après 42-48 h fin de larves de stade L4 ont été visuellement identifiés sous le stéréoscope et ramassés avec un pic de cils dans un spot de la plaque avec ou sans stimulants dans la solution de saccharose de contrôle et marque SWIP manuellement ou via une analyse automatisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : SWIP induite par l’amphétamine, à l’aide de dosage manuel. Worms en saccharose ou sucrose avec amphétamine 0,5 mM (AMPH) ont été visuellement marqués pour le comportement de SWIP chaque minute à l’aide d’un stéréoscope. Le pourcentage d’animaux de que SWIP exposante a été calculé en divisant le nombre paralysé vers par le nombre total de worms dosés pour chaque point dans le temps et puis en multipliant le résultat par 100. Le pourcentage de worms exposés à AMPH (cases bleues) montrant SWIP hausses supplémentaires, tandis que les vers non traitées (cercles rouges) continuent à nager pendant la fenêtre de 10 minutes. N représente le nombre d’animaux testés dans chaque groupe. Barres d’erreur indiquent erreur-type de moyens (SEM). Signification statistique a été évaluée en effectuant une ANOVA bidirectionnelle avec Bonferroni test de comparaison multiple (p < 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : SWIP induite par l’amphétamine via une analyse automatisée. Vidéos de worms en saccharose ou sucrose avec 0,5 mM AMPH ont été enregistrées à l’aide d’une caméra montée sur un stéréoscope. Vidéos de natation de worms individuels ont été suivis avec un logiciel de suivi et analysés par combinaison de logiciels de suivi. Cartes de chaleur ont été générées des données où les zones rouges montrent les vers qui se déplacent activement, et espaces verts indiquent vers paralysés. Chaque groupe expérimental est représentatif des 6 animaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour effectuer un test comportemental, SWIP, chez c. elegans. Ce protocole est simple et directe avec aucun obstacles techniques majeurs effectuez ce test très amical. Néanmoins, il y a certains aspects essentiels qui doivent être examinées afin de s’acquitter efficacement le dosage.
Il faut s’assurer que les vers utilisés pour l’essai sont bien nourris, puisque la restriction alimentaire affecte SWIP17. Manipulation vers lors de la cueillette comme traitement de l’hypochlorite de sodium/NaOH bien aussi chronométré lors de la lyse sont des étapes critiques, comme un traumatisme lors de la cueillette (plus commune lorsque vous utilisez une pioche de platine) ou une exposition prolongée des embryons de solution d’hypochlorite de sodium/NaOH peut en douceur causer des dommages permanents au vers18 et ainsi compromettre leur capacité à nager.
Les techniques stériles doivent être suivies pour éviter toute contamination. La contamination de la gélose compromet la santé des animaux et modifie ainsi leur capacité à nager. Légère différence dans le pourcentage d’animaux présentant SWIP peut être observée à l’aide des boîtes de gélose ensemencée avec différentes souches de bactéries e. coli (NA22, OP50, etc.). Dans notre protocole, nous utilisons NA22 pour produire un grand nombre de vers.
Plaques de verre-spot, utilisé pendant le test SWIP, préfèrent de plaques en plastique parce qu’ils peuvent être lavés, stérilisés à l’autoclave et réutilisés lors de différents types de médicaments sont testés.
Un autre facteur important à prendre en considération lors d’un essai SWIP est l’osmolarité du liquide média dans lequel les animaux sont testés19. Dans notre protocole, nous utilisons saccharose pour apporter l’osmolarité d’eau jusqu'à 200 mOsm/L, ce qui a déjà été démontré pour être une condition optimale pour les animaux (communication personnelle de Blakely RD.). L’eau avec une osmolarité contrôlée est préférable car il élimine les possibles différences de qualité de l’eau au fil de multiples analyses exécutées à différents jours, des semaines ou des mois. Notamment, dat-1 et type sauvage animaux traités avec AMPH ne présentent pas SWIP si solutions salées (p. ex., M9 solution) sont utilisées comme support de contrôle.
Le temps requis pour la plupart des animaux pour pièce SWIP peut changer légèrement entre les stades différents ver (L1-L4). Par exemple, Mesa et coll. (2014) ont signalé qu’après que 5 min 80 % des animaux de dat-1 L1 encore nager, ainsi que 20 % des animaux pièce SWIP. En revanche, seulement 50 % des animaux de dat-1 L4 nager encore après 5 min20. Par conséquent, il est important que les animaux testés pour SWIP est dosés au même âge. Nous avons optimisé notre essai utilisant des animaux de L4 mise en scène toujours fin. Les larves de L4 fin ont l’avantage d’être facilement reconnaissable parmi les autres stades larvaires, parce que, à ce stade, les animaux ont atteint leur taille adulte et présentent une caractéristique fine ligne divisant la tache blanche dans le centre de leur corps qui sera plus tard se différencient en une vulve mature. La durée de l’essai est également essentielle. Par exemple, au bout de 15 minutes, 90 % de mutants de dat-1 L4 pièce SWIP mais ultérieurement (30 min), seulement 60 % d'entre eux présentent SWIP20.
Le test automatisé de SWIP élimine les erreurs humaines et améliore le criblage à haut débit en ce qui concerne les tests manuels. Cependant, logiciel de suivi des programmes demandent beaucoup de temps puisqu’ils peuvent suivre uniquement un seul ver à la fois.
En ce qui concerne les autres comportements dépendant DA c. elegans , SWIP est un type beaucoup moins de temps de test. Par exemple, le ralentissement basale réponse2 n’est pas un type immédiat du dosage. En fait, les vers doivent être alimentés de façon chronique avec les médicaments, et cela pourrait entraîner des effets par ressuage et hors cible. Ainsi, il ne serait pas aussi efficace dépister les drogues.
Une des applications principales de SWIP est de dépister les divers médicaments qui ciblent la voie dopaminergique. Dans les cas où les médicaments ne sont pas solubles dans l’eau (p. ex., le mazindol), des dilutions appropriées doivent être effectuées pour obtenir des concentrations où la solution transporteur n’est pas toxique pour les vers. En outre, si les différentes concentrations du même médicament sont utilisé5,13,14, courbes dose-réponse aussi peuvent être analysés. Par exemple, le taux de progression (pente de la courbe des animaux par minute, Figure 2) peut être déclaré en fonction de la concentration et utilisé pour comparer les effets des différentes drogues (par exemple, la cocaïne vs AMPH).
Lorsque SWIP est utilisé pour étudier le mécanisme d’action des médicaments au niveau des synapses de dopaminergique, attention devrait être accordée si les résultats sont étendus à d’autres animaux. Par exemple, l’imipramine, un inhibiteur spécifique du transporteur chez les mammifères de la noradrénaline (NET) a été utilisé pour induire SWIP DA-médiation en N2 animaux4. C. elegans ne pas faire la synthèse de la noradrénaline et par conséquent n’exprime pas NET. Toutefois, le transporteur c. elegans DA partage une homologie avec mammifères NET21. Pour cette raison, médicaments qui sont des inhibiteurs spécifiques des mammifères NET et ont des effets limités sur DAT mammifères (p. ex., l’imipramine) montrent une sélectivité élevée c. elegans DAT. Ainsi, sélectivité des espèces peut-être limiter notre capacité à extrapoler les conclusions de c. elegans aux humains.
Le facteur le plus important à considérer quand la conception d’essais SWIP est l’inclusion d’expériences prouvant que SWIP est véhiculé par le système dopaminergique. En fait, la natation avec facultés affaiblies pourrait être générée par des facteurs autres que les gènes liés au système de DA (p. ex., les défauts généraux dans la contraction des muscles). Pour vous assurer que SWIP est en effet médié par DA, protocoles devraient inclure des expériences réalisées avec des animaux où la DA est épuisée. Ceci peut être réalisé soit par l’utilisation d’animaux knock-out manque d’expression de chat-2, l’homologue de c. elegans de la tyrosine hydroxylase, qui est l’enzyme limitante pour la synthèse de la DA, ou par des animaux sauvage prétraitement à la réserpine, un médicament qui provoque l’appauvrissement DA de vésicules3. Par exemple, McDonald et al.,3 a montré que SWIP basale observée chez les mutants de dat-1 a été récupéré lorsque ces animaux ont été traités au préalable à la réserpine. Ce résultat suggère que SWIP est induite par le DA. En revanche, Safratowich et coll. (2014) à l’aide de chat-2, dat-1 et des mutants dépourvus d’expression de chacun des récepteurs dopaminergiques, démontré que la trace amine β-phényléthylamine (βPEA) induit SWIP dans la minute de traitement indépendamment de la DA mais par une activation directe de l’ion de ligand-gated canal LGC-5514. Les auteurs ont montré que βPEA DA induite et SWIP sont mécaniquement différente et ils peuvent être facilement distinguées expérimentalement. En effet, alors que SWIP induite par le βPEA est DA - et dop-3-indépendante, elle atteint des valeurs maximales moins de 1 min et rapidement diminue après 2 min14, DA-mediated SWIP est cat-2 et 3-dop dépend et est pratiquement de zéro après 1 minute (Figure 2). Ainsi, il y a une grande différence dans le temps nécessaire pour atteindre les effets maximums, et cela permet de distinguer rapidement les deux phénomènes : 1) le SWIP rapide induite par le βPEA dans la minute obtenue par une activation directe des canaux LGC-55 et 2) la lente SWIP induite par le DA qui se produit lorsqu’un surplus de DA extracellulaire s’accumule au fil du temps (10-15 min) et les récepteurs DA DOP-3 sont être hyperstimulé3.
En conclusion, avec le bon ensemble d’expériences, qui incluent l’utilisation d’animaux knock-out de gènes d’acteur clé du système dopaminergique (cat-2, dat-1, dop-3) et la consommation de drogues destructrices DA/place (la réserpine), Piso a été utilisé avec succès pour élucider le mécanisme d’action des médicaments comme AMPH5,13, βPEA14,15 et azapérone6.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiens à remercier le Dr. Osama Refai du laboratoire du Dr Randy Blakely d’orientation avec l’analyse automatique de SWIP. Ce travail a été financé par NIH R01 DA042156 à LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
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