Summary
Yüzme indüklenen felç (SWIP) olan köklü bir davranış tahlil Caenorhabditis elegans içinde (C. elegans) sinyal dopamin temel mekanizmaları çalışırdım. Ancak, tahlil gerçekleştirmek için detaylı bir yöntem bulunmamaktadır. Burada, SWIP için bir adım adım Protokolü açıklar.
Abstract
Bu protokol için açıklanan Yüzme tahlil dopaminerjik düzenleyen proteinler tanımlamak için geçerli bir araç synapses olduğunu. Benzer şekilde memeliler, dopamin (DA) C. elegans öğrenme ve motor aktivite de dahil olmak üzere çeşitli işlevlerini kontrol eder. Bu DA yayın (örneğin, amfetamin (AMPH) tedavileri) teşvik veya DA izni engel koşulları (örneğin, hayvanlar DA ışınlama eksik (dat-1) DA nöronların reaccumulating aciz olan) hücre dışı DA aşırı oluşturmak Sonuçta ortaya çıkan Inhibe gezisidir. Bu davranış özellikle belirgin olduğunda hayvanlar yüzmek. Aslında, uzun bir süre için yüzmeyi vahşi-türü hayvanlar devam ederken, dat-1 boş mutantlar ve vahşi-tipi AMPH ile tedavi veya DA ışınlama inhibitörleri Kuyunun dibine batırın ve hareket etmiyor. Bu davranış "Yüzme felç" (SWIP) indüklenen olarak adlandırılır. SWIP tahlil iyi kurulmuş olsa da, yöntemin ayrıntılı bir açıklama bulunmuyor. Burada, SWIP gerçekleştirmek için adım adım yönergeler açıklanmaktadır. Tahlil gerçekleştirmek için geç larva sahne-4 hayvan kontrol Sükroz çözümü ile ya da ezelî AMPH içeren bir cam spot levha yerleştirilir. Hayvanlar için bir stereoscope altında görselleştirme tarafından el ile veya otomatik olarak kayıt ile bir fotoğraf makinesi üzerinde stereoscope monte Yüzme davranışlarını attı. Videolar sonra dayak frekans ve felç ısı haritaları şeklinde görsel bir gösterimini verir bir izleme yazılımı kullanılarak analiz edilir. El ile ve otomatik sistemler ve hayvanların Yüzme yeteneği kolayca ölçülebilir bir okuma garanti böylece tarama için mutasyonlar dopaminerjik sistem içinde taşıyan hayvan veya yardımcı genler için kolaylaştırmak. Buna ek olarak, SWIP kötüye AMPH gibi ilaçların etki mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.
Introduction
Hayvanlar farklı nörotransmitter karmaşık sinyalleşme işlemler tarafından koordine tarafından aracılı doğuştan gelen ve karmaşık davranışlar çeşitli gerçekleştirmek. Nörotransmitter dopamin (DA) son derece korunmuş davranışlar öğrenme, motor işlevleri ve ödül işleme gibi türler arasında aracılık eder.
Toprak Yuvarlak solucanlar C. elegans, nispeten basit ve de eşlenen sinir sadece 302 nöronlar oluşan sistemi ile belirgin karmaşık davranışları DA çiftleşme, öğrenme, yiyecek arama, hareket ve yumurta atma gibi düzenlenir da dahil olmak üzere, gösterir 1. diğer özellikleri arasında kısa yaşam döngüsü, kullanım kolaylığı ve moleküller sinyal koruma, C. elegans korunmuş davranışları nöral temeli eğitimi için bir model olarak kullanmanın yararları vurgulayın.
C. elegans hermafrodit sekiz dopaminerjik nöron içerir; Bunlara ek olarak, altı ilave çiftlerini amaçlar çiftleşme için erkek içerir. Memeliler, olduğu gibi bu nöronlar DA sentez ve DA ışınlama (DAT-1), hangi DA sinaptik yarık geri dopaminerjik nöron serbest nakliye sadece dopaminerjik nöronlarda bulunan bir membran protein ifade eder. Ayrıca, çoğu protein sentezi, paketleme ve serbest bırakmak-in DA her adımda dahil solucanlar ve insanlar arasında son derece korunmuş ve gibi memelilerde DA beslenme davranışları ve hareket C. elegans2modüle.
C. elegans düz yüzeylerde tarar ve karakteristik dayak davranış suda yüzüyor. İlginçtir, DAT-1 (dat-1) ifadesi eksik mutantlar normalde katı yüzey üzerinde tarama ama suya dalmış zaman Yüzme ayakta tutmak başarısız. Bu davranış indüklenen Yüzme felç veya SWIP olarak adlandırdığı oldu. Önceki deneyler SWIP, kısmen DA sonuçta D2-benzeri postsinaptik reseptörler (DOP-3) overstimulates sinaptik yarık içinde aşırı kaynaklanır gösterdi. Her ne kadar başlangıçta dat-1 nakavt hayvanlar3' te tanımlanan, SWIP da o blok faaliyet DAT (örneğin, imipramine4) ilaçlar ile tedavi vahşi-türü hayvanlarda gözlenen ve/veya DA yayın (örneğin, amfetamin5) ikna etmek. Öte yandan, sentez ve serbest bırakmak-in DA önlenmesi ve engelleme DOP-3 reseptör fonksiyonu farmakolojik veya genetik manipülasyon SWIP6önlemek. Birlikte ele alındığında, bu zaten yayımlanmış veri SWIP mutasyona uğramış proteinlerin dopaminerjik sinapslarda3,4,7 içinde neden davranışsal etkileri çalışmaya ve için istihdam için güvenilir bir araç olarak kurduk kimliği roman yasal yolları7,8,9,10,11,12sinyal DA dahil ileri genetik ekranlar. Buna ek olarak, uyuşturucu kaynaklı davranış yaşayan hayvanlarda kolayca ölçülebilir bir okuma sağlayarak, SWIP mekanizmaları eylem amfetamin (AMPH) gibi ilaçlar aydınlatma sağlar ve azaperone dopaminerjik,5, synapses 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP deneyleri yerine getirmek için kullanılan protokolleri16daha önce anlatmıştık. Metodoloji ve etkili bir şekilde SWIP gerçekleştirmek C. elegans toplum için görsel bir kılavuz sağlamak amacı ile tahlil yapmak için Kur'u burada, biz ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık çözümler ve medya
- KH2PO4 3.0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42,2 mM), çözülerek M9 arabellek hazırlamak ve NaCl 5.0 g (85.5 mM) autoclaved deiyonize su 1 litre. 1 M MgSO4 (100 mL autoclaved deiyonize su son hacmi 12 g) 1.0 mL ısıyla sonra ekleyin. Elde edilen 10 x Mix 100 mL su 1 x çözüm yapmak M9 ile autoclaved 900 mL deiyonize.
- Yumurta tampon yapmak, HEPES autoclaved deiyonize su 1 litre, 6.896 g NaCl (118 mM), KCl (48 mM), CaCl2-2 H2O (2 mM), MgCl2-6 H2O (2 mM) 0.406 g 0,294 g 3.578 g ve 5.958 g (25 mM) geçiyoruz. PH NaOH kullanarak 7,3 için ayarlayın.
- Taze sodyum hipoklorit/NaOH çözüm 1 mL % 5-6 sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) ve 10 N NaOH 180 µL 3.8 mL deiyonize su ekleyerek hazırlayın.
- 60 g Sükroz tartmak ve autoclaved deiyonize su 100 mL % 60 Sükroz çözüm yapmak için son bir birime dağıtılması.
- 0,684 g autoclaved deiyonize su 200 mM Sükroz yapmak 10 ml sukroz geçiyoruz. Kontrol edin ve sizin için osmometer kullanarak bir Osmolarite ayarlayın. 1 mL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler yapmak ve -20 ° C'de dondurmak
- AMPH (Moleküler ağırlığı 184.75 g/mol) 0,184 g tartmak ve 10 mL deiyonize su 100 mM hisse senedi çözüm yapmak geçiyoruz. 0,5 mM çalışma çözüm yapmak için su 400 µL hisse senedi çözüm mix 2 µL.
-
Besin büyüme medya (NGM) tabak hazırlamak
- Mix 3 gr NaCl (52.65 mM), pepton, 25 g bacto-agar ve 975 mL deiyonize suyla bir 2 L Erlenmeyer şişesi 20 g. Bir manyetik heyecan bar ve otoklav (121 ° C, 15 PSI) sıvı döngüsü kullanılarak 1 saattir bulunmaktadır.
- Serin ve karıştırma sırasında bir ısıtıcı şişeye koyarak yaklaşık 50 ° C sıcaklıkta korumak. Kolesterol (5 mg/mL etanol), 0,5 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 ve 1 M potasyum fosfat tampon, pH 7,4 (KH2PO4108.3 g, K2HPO4 35,6 g 25 mL ekleyin deiyonize su için 1 L).
- 25 mL 100 mm x 15 mm Petri kalıplara pipet ve kuvvetlendirmek ortam sağlar. Baş aşağı 4 ° C'de plakaları 4 hafta için bir kutu içinde saklayın.
-
Lysogeny suyu (LB) suyu hazırlanması
- Bir Erlenmeyer flask deiyonize suyla 200 ml LB toz karışımı 5 g geçiyoruz. Otoklav 30 dakika kullanan sıvı sterilizasyon döngüsü. Suyu soğumasını sağlar. Oda sıcaklığında 1-2 hafta için saklayın.
-
NA22 bakteriyel plakaları hazırlanması
- Steril pipet ucu veya steril bir bakteriyel döngü NA22 E. coli bakteri küçük bir hacim ile bir LB plaka gliserol stoktan çizgi ve plaka baş aşağı 37 ° C kuluçka makinesine gecede izole kolonileri büyümeye kuluçkaya için kullanın. Pick ve 1.8 adımda hazırlanan LB suyu 200 mL içine bir koloni tanıtmak ve gecede 37 ° C'de titreyen bir platform üzerinde büyümeye izin.
- Tabakları temel için 1.7. adımda hazırlanan ve steril cam Hokey sopası ile yayıldı NGM plakalar üzerine bakteriyel kültürünün 200 µL dağıtmak. Gece veya daha uzun bir başlık altında kuru ve baş aşağı 4 ° C'de bir hava geçirmez kutusunda saklamak plakaları izin
- Solucanlar almaya kirpik/Platin araç yapmak için bir kalın kirpik veya Platin filaman Pasteur pipet süper yapıştırıcı kullanarak bir cam içine yapıştırın. Kirpik ucu bir jilet kullanarak bir açıyla kesilmiş. Alternatif olarak, Bunsen burner Platin filaman çevresinde cam pipet ucu eritmek için kullanılabilir.
2. C. elegans yetiştiriciliği
Not: Kültür vahşi tipli N2C. elegans Escherichia coli NA22 plakaları üzerinde yük. Detaylı kültür yöntemleri aşağıda açıklanmıştır.
-
Solucan kültür hazırlanması
- Starter kültür Worms yapmak için iyi beslenmiş hayvanlar içeren bir plaka agar küçük bir parça kesti ve steril bir spatula kullanarak 1.9 adımda hazırlanan NA22 E. coli bakteri plaka üzerine aktarın. Tabak 20 ° C'de 3-4 gün kuluçkaya. Stereo mikroskop altında görsel olarak gravid yetişkin varlığını doğrulamak.
-
Worms eşitlenmiş nüfus hazırlanması
- Gravid yetişkin autoclaved deiyonize suyla arası tüm fışkırmak şişe kullanarak plaka dağıtımı tarafından en az 2 tabak toplamak. Yavaşça solucan çıkarmak ve solucanlar bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bir 15 mL polistren konik tüp toplamak için plaka girdap.
- Spin aşağı vasıl 140 x g solucanlar cips, sonra bir vakum pompası süpernatant kullanarak Aspire edin 2 dk santrifüj tüpü veya laboratuvar vakum inşa.
- Adım iki veya daha fazla kez solucanlar (su zaman karışık net görünür bakterilerden berraklaşana kadar resuspend ve autoclaved deiyonize su ve karışımı ve 2 dakika süreyle 140 x g , santrifüj tüpü doldurarak solucanlar süpernatant Aspire edin ve bu son tekrar yıkama Kurtlarla).
- 5 mL taze yapılmış sodyum hipoklorit/NaOH çözeltisi (Adım 1.3) solucan Pelet ve bir girdap kullanarak hızla karıştırın. Bir rocker için yaklaşık 4-8 dk metroyla kuluçkaya. Sodyum hipoklorit/NaOH çözüm ile kuluçka süresi 4-8 hisse senedi sodyum hipoklorit çözüm (çamaşır suyu) kalitesinebakarak dakika arasında değişir.
- Bir damla (2-50 µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki solucan içeren çözüm koymak ve her 2 dk solucan lizis için mikroskop altında kontrol edin. Solucanların % 70'i lysed ve yumurta serbest bırakılır, dolgu ile yumurta tampon tüp 1.2 adımda hazırlanan ve hemen 140 x g embriyo cips ve leşleri solucan için de 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve Pelet 3 tüp her zaman yumurta arabellek ile doldurarak daha fazla kere yıkayın. Spin aşağı vasıl 140 x g 1 dk. için ve süpernatant her zaman kaldırmak. Pelet yıkar sonunda beyaza döner.
- Son yıkama sonra embriyo % 30 Sükroz çözümde ölü leşleri ayırmak. Pelet için 5 mL autoclaved deiyonize su ekleyin, resuspend ve 5 mL % 60 Sükroz 1.4 adımda hazırlanan de ekleyin. İyice karıştırın ve 160 x g 6 dk, santrifüj kapasitesi.
- Bir cam Pasteur pipet üst Menisküs taze 15 mL konik tüp içine yüzen embriyo aktarmak için kullanın. 3-4 mL den fazla almayın. Kalan herhangi bir Sükroz kaldırmak için embriyo yıkama 3 kez 140 x g 3 dk de centrifuging tarafından autoclaved su ile süpernatant kaldırma ve Pelet resuspending (ve tüp doldurma) her zaman.
- Yıkama 1 x M9 arabellek ile yineleyin. Son yıkama sonra Pelet M9 10 mL resuspend. Tüpler L1 larvalar yumurtadan yumurta üzerinde bir shaker gecede (en fazla 14 h) bırakın. Solucanlar gıda yetersizliği L1 larva aşamasında kalacaktır.
- 140 x g 2 dakika süreyle de centrifuging tarafından larva tarafından yayımlanan herhangi bir feromonlar kaldırmak için 3 kez autoclaved su ile yıkama L1 larva larvalar 1 mL su Resuspend. 1:10 yapmak seyreltme solucanların su, cam slayt üzerindeki bir 10 µL damla pipette, bir coverslip giy ve solucanlar bir stereoscope altında saymak. Bunu iki kez tekrarlayın ve sonuçları ortalama.
- Pipet (yani daha önce oda sıcaklığına kadar getirildi) bir NA22 plaka üzerine yaklaşık 1000 solucanlar küçük yerleştirerek karşılık gelen solucan hacmi plaka üzerinde bırakır. Damla kurur kadar plaka yarı-açık bırakın. Sonra plaka kapak ve baş aşağı 20 ° C kuluçka yaklaşık 44-48 h veya solucanlar bir stereomicroscope altında görsel olarak teyit olarak geç L4 sahne ulaşmak kadar kuluçkaya. Solucanlar SWIP için test edilmesi hazırsınız.
3. SWIP
Not: Biz vahşi tipi solucan AMPH ile tedavi SWIP değerlendirilmesi elle yapılan yöntem açıklanmaktadır. Biz de kısaca solucanlar izleme ve solucan Kinetik bir otomatik solucan izci ve Hardaway vd.10tarafından daha önce tarif edildi bir izleme yazılımı kullanarak daha iyi inceleyebilmemiz tartışıyorlar.
-
SWIP için test etmek için elle yapılan yöntem
- Aliquot 40 µL 200 mOsm/L Sükroz çözüm ile veya olmadan bir cam spot levha içine 0,5 mM AMPH. Stereoscope altında bir kirpik ya da Platin ile 8-10 L4 geç sahne solucanlar pick pick ve solucanlar çekme taşımak ve çözüm içine yüzmek kadar solüsyon içeren plaka çekmede daldırın. Kuyunun içine aldı solucanlar sayısını not edin, sayacı başlatmak, gözlemlemek ve SWIP her dakika işareti olarak sergilenmesi solucanlar kaydedin.
- Ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp her dakikada felç solucanlar solucan tahlil test toplam sayısı tarafından sayısı bölerek felç solucanlar yüzdesini hesaplamak ve 100 ile çarpmak. Herhangi bir grafik içine yüzde değerleri kopyalamak ve istatistiksel yazılım ve arsa Y ekseni üzerindeki yüzde değerler ve zamanında X ekseni XY grafiğini kullanarak verileri biçimlendirebilir.
- Denetim, AMPH grupları ve zaman tedavi arasında istatistiksel anlamlılık için test etmek için Post-hoc analizi (örneğin, Bonferroni sonrası test) tarafından takip iki yönlü ANOVA gerçekleştirir.
-
SWIP otomatik analizi
- Bir kerede tek bir solucan otomatik çözümlemesi. İletişim kuralı ayarlamak için kamera yukarıya belgili tanımlık solucan tracker yazılım ve izleme yazılımı çalıştırmak için komut dosyası analiz Hardaway vd.16ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Kısaca, bir tek geç L4 sahne hermafrodit kirpik kıracağı elle yapılan yöntem 3.1.2 bölümünde açıklandığı gibi kullanan bir cam spot tabak yerleştirin. O zaman bir solucan Yüzme videoları kaydedin ve solucan tracker yazılım vücut kıvrımları frekansını hesaplamak için kullanın.
- Solucan dayak frekans elde etmek için izleme yazılımı ile birlikte sağlanan komut dosyasını izleyin ve ısı üretmek için solucan dayak verilerden eşler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz SWIP tahlil AMPH tedavi tarafından indüklenen örneği mevcut. Şekil 1 yukarıda açıklandığı gibi tahlil kurulumunun şematik gösterim gösterir. İçin el ile tahlil, eşitlenmiş geç L4 sahne solucanlar bir kirpik ya da Platin ile toplanan yaklaşık 8-10 yaş almak ve 40 µL 200 mOsm/L sukroz (kontrol çözümü) veya sukroz 0,5 mM AMPH ile dolu ve SWIP için test edilmiş bir cam spot levha içine yerleştirilir.
Ne zaman hayvanlar sona Yüzme (yani, SWIP sergi), hızlı bir şekilde ve lavabo kuyunun için hareket etmiyor. Bu nedenle, hala Kuyunun dibinde sabit olanlar karşı su yüzeyi yüzmek hayvanlar arasında ayrımcılık çok basittir. AMPH tedavi altında SWIP aşamalı olarak sergilenmesi hayvan sayısını artırır, ancak bu solucanların en denetim çözüm yüzmeye sürekli olarak en az 10 dakika, test. Maksimal SWIP sergilenmesi hayvanlar kullanılan AMPH1,5,13konsantrasyon için orantılı yüzdesidir. DAT-1 nakavt (dat-1) solucanlar kontrol çözümü test edilirken, % 40-70 kurt içinde 10 dakika4,13SWIP sergi. Bu sonucu felç hayvanlar vahşi-türü hayvanlarda 0,5 mM AMPH (Şekil 2) ile tedavi ölçülen yüzdesi karşılaştırılabilir.
Solucanlar Sükroz veya AMPH içeren Sükroz maruz SWIP gözlem (Şekil 2) ilk dakika içinde görünmüyor. 10 dakika boyunca yüzmeyi Sükroz ile tedavi solucanlar devam ederken, ancak, sergi SWIP tedavi 2 dakika sonra ve 10 dakika sonra SWIP (Şekil 2) 66 ± % 3 hayvanlar göstermek solucanlar AMPH ile tedavi başlar.
Otomatik analiz için videolar Worms denetim veya AMPH tedavi altında kaydedilir bir video kayıt yazılımı kullanarak bir defada bir solucan. İzleme yazılımı bir bilgisayar solucanı dayak izlemek için kullanılır ve sonuçta elde edilen veriler içe aktarılmış ve yazılım takım elbise ile analiz. Isı haritaları denetim veya AMPH maruz hayvan örnekleri, görüntüleme aktif yeşil, kırmızı ve felçli solucanlar hayvanlar hareket are göstermek şekil 3' te.
Resim 1 : Tahlil SWIP için kurmak. Gravid yetişkin yaban tipi (N2) solucanlar embriyo serbest bırakmak için sodyum hipoklorit/NaOH tedaviyle lysed. Embriyo yumurtadan ve senkronize L1 larvaları bir shaker 14 h için M9 arabellekte içine geliştirmek için izin ve NA22 bakteri ile seribaşı bir NGM plaka üzerinde kaplama. 42-48 h sonra geç L4 sahne larva görsel olarak stereoscope altında tespit ve kirpik kıracağıyla spot bir tabak ya da amfetamin denetim Sükroz çözüm olmadan içine aldı ve SWIP için el ile veya otomatik analizi ile attı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : El ile tahlil kullanarak amfetamin kaynaklı SWIP. Solucanlar Sükroz veya sukroz 0,5 mM amfetamin (AMPH) ile görsel olarak bir stereoscope kullanarak her dakika için SWIP davranış skorlanmıştır. Hayvanlar sergileri SWIP sayısına bölünmesi ile hesaplanır yüzde solucanlar için her zaman noktası denetlesinler ve sonucu 100 ile çarpımı solucanlar toplam sayısı tarafından felç. Tedavi edilmemiş solucanlar (kırmızı daireler) 10 dakika pencere sırasında Yüzme devam ederken SWIP artar fazla mesai, gösterilen AMPH (mavi kareler) maruz solucanlar yüzdesi. N her grupta test hayvan sayısını temsil eder. Hata çubukları anlamına gelir (SEM) standart hatasını gösterir. İstatistiksel anlamlılık birden fazla karşılaştırma testi (p < 0.0001) Bonferroni ile iki yönlü ANOVA gerçekleştirerek değerlendirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Otomatik analizi yoluyla amfetamin kaynaklı SWIP. Videolar Worms Sükroz veya sukroz 0,5 mM AMPH ile bir stereoscope üzerinde monte edilmiş bir kamera ile kaydedildi. Bir izleme yazılımı ile izleniyor ve kullanılarak analiz bireysel solucanlar Yüzme videoları izleme yazılım takım elbise. Isı haritaları nerede kırmızı bölgeler aktif hareket ediyor solucanlar gösterir ve yeşil alanlarda felç solucanlar belirtmek verilerinden oluşturulan. Her deney grubu 6 hayvanların temsilcisidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bir davranış yöntemi, SWIP, C. elegansiçinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı bu tahlil çok kullanıcı dostu yapmak hiçbir büyük teknik engel ile basit ve anlaşılır. Yine de, etkili bir şekilde tahlil gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken bazı önemli yönleri vardır.
Diyet kısıtlama SWIP17etkiler bu yana tahlil için kullanılan solucanlar iyi beslenmiş olması için özen gösterilmelidir. İyi zamanlanmış sodyum hipoklorit/NaOH tedavi lizis sırasında olduğu gibi kritik adımlar, Worms malzeme çekme sırasında travma sırasında malzeme çekme (Platin bir çekme kullanırken daha yaygın) veya genişletilmiş embriyo maruz sodyum hipoklorit/NaOH çözüm mümkün olduğunca işleme nazik solucanlar18 kalıcı zarar ve böylece yeteneklerini yüzmek için uzlaşma.
Steril teknikleri kirlenmesini önlemek için takip edilmelidir. Ağar kaplamalar bulaşma hayvanların sağlık ödün vermez ve böylece yeteneklerini yüzmek için değiştirir. Hayvanlar SWIP sergilenmesi yüzdesi olarak hafif fark Ağar kaplamalar kullanarak E. coli bakteri (NA22, OP50, vb) farklı suşları ile seribaşı görülebilmektedir. Bizim iletişim kuralında, solucanlar, çok sayıda verim için NA22 kullanın.
Cam-spot Kaplamalar, SWIP tahlil sırasında kullanılan plastik Tabaklar için tercih çünkü onlar iyice, autoclaved yıkanabilir ve uyuşturucu farklı türde test edilirken yeniden kullanılır.
SWIP assay olarak dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktör hayvanlar test19olan sıvı medya Osmolarite var. Bizim iletişim kuralında, hangi daha önce hayvanlar (Blakely RD. kişisel iletişim) için en iyi bir koşul olduğu gösterilmiştir 200 mOsm/L kadar su Osmolarite getirmek için Sükroz kullanın. Birden çok testleri farklı gün, hafta veya ay'nın sahne üzerinde olası su kalite farklılıkları ortadan kaldırdığından su kontrollü bir osmolarite ile tercih edilir. Tuzlu Çözümleri (örneğin, M9 çözüm) kontrol ortamı olarak kullanılırsa özellikle, dat-1 ve AMPH ile tedavi vahşi-türü hayvanlar SWIP gösteren değil.
SWIP sergilemek için en-in belgili tanımlık hayvan gereken süreyi biraz farklı solucan aşamaları (L1-L4) arasında değiştirebilirsiniz. Örneğin, Masoudi et al. (2014) 5 dk %80 dat-1 L1 hayvanların hâlâ yüzüyor sonra böylece hayvanlar sadece % 20 SWIP koordinatının olduğunu bildirdi. Öte yandan, L4 dat-1 hayvanlar sadece % 50'si 5 dk20sonra hâlâ yüzüyor. Bu nedenle, SWIP için test hayvanlar aynı yaşta denetlesinler önemlidir. Biz her zaman geç sahnelenen L4 hayvanlar kullanarak bizim tahlil optimize. Geç L4 larvaları çünkü bu aşamada hayvanlar yetişkin boyutlarına ulaşmış ve karakteristik ince bir çizgi daha sonra onların beden ortasına beyaz nokta bölme sergi, larva diğer aşamalar arasında kolayca tanınabilir olmanın avantajı var Olgun bir vulva ayırt etmek. Testin zaman aralığı da önemlidir. Örneğin, 15 dakika sonra L4 dat-1 mutantlar yüzde 90'ını SWIP sergi ama sonradan (30 dk), bunların sadece % 60 SWIP20sergilemek.
Otomatik SWIP tahlil insan hatalarını ortadan kaldırır ve el ile testleri ile ilgili olarak yüksek üretilen iş tarama yükseltir. Ancak, izleme yazılımı sadece bir defada tek bir solucan izleyebilirsiniz bu yana zaman alıcı programlardır.
Diğer C. elegans DA bağımlı davranışları ile ilgili SWIP tahlil daha az zaman alıcı bir türüdür. Örneğin, Bazal yavaş yanıt2 tahlil bir acil-türü değil. Aslında, solucanlar kronik uyuşturucu ile beslenmeleri gerekir ve bu penetrant ve hedef kapalı etkileri neden olabilir. Böylece, bu uyuşturucu için ekran kadar etkili olmayabilir.
SWIP büyük uygulamalar için çeşitli ilaçlar hedefleyen dopaminerjik yolu ekran için biridir. Suda çözünür (örneğin, sonucunda) uyuşturucu nerede değil durumda, uygun dilutions konsantrasyonları elde etmek için taşıyıcı çözüm solucanlar için toksik olmadığı yapılmalıdır. Aynı uyuşturucu farklı konsantrasyonlarda kullanılan5,13,14varsa, Ayrıca, doz-yanıt eğrileri da analiz edilebilir. Örneğin, ilerleme (yamaç eğrisi Şekil 2dakikada hayvanların) oranını konsantrasyonu fonksiyonu olarak bildirilen ve farklı ilaçlar (örneğin, AMPH vs kokain) etkileri karşılaştırmak için kullanılan.
SWIP dopaminerjik sinapslarda adlı ilaçların etki mekanizmaları araştırmak için kullanıldığında, sonuçları diğer hayvanlar için genişletilmiş Eğer dikkat edilmeli. Örneğin, imipramine, memeli norepinefrin ışınlama (NET) belirli bir önleyici DA aracılık SWIP N2 hayvanlar4ikna etmek için kullanılmıştır. C. elegans synthetize norepinefrin yapar ve sonuç olarak NET ifade değil. Ancak, C. elegans DA ışınlama homoloji memeli NET21ile paylaşır. Bu nedenle, memeli net belirli inhibitörleri ve memeli DAT (örneğin, imipramine) üzerinde etkileri sınırlı uyuşturucu yüksek seçicilik C. elegans için çevreci göster Böylece, türler seçicilik C. elegans bulgular insanlara ulaşmak için yeteneğimizi sınırlayabilir.
En önemli faktör SWIP dopaminerjik sistem tarafından aracılık ettiği kanıtlayan deneyler dahil olduğunda SWIP deneyleri tasarımı dikkate. Aslında, Engelli Yüzme DA sistemi (örneğin, genel kusurları kas kasılma) ile ilgili genleri dışında etkenler tarafından oluşturulabilir. SWIP gerçekten DA aracılık ettiği emin olmak için iletişim kuralları DA tükenmiştir hayvanlarla yapılan deneyler içermelidir. Bu tarafından elde edilebilir nakavt hayvan kedi-2, DA sentezi için veya reserpine ile önceden tedavi vahşi-türü hayvanlar tarafından hızı sınırlaması enzim olan tirozin hidroksilaz C. elegans homologue ifadesi eksik kullanarak bir uyuşturucu DA tükenmesi veziküller3neden olur. Örneğin, McDonald et al.3 bu hayvanların reserpine ile önceden tedavi yaşındayken Bazal SWIP dat-1 mutantlar gözlenen kurtarıldı gösterdi. Bu sonuç SWIP DA aracılı olduğunu göstermektedir. Öte yandan, kedi-2, dat-1 ve ifade her birinin dopaminerjik reseptörleri eksik mutantlar kullanarak, Safratowich ve ark. (2014) izleme Amin β-feniletilamin (βPEA) tedavi 1 dakika içinde SWIP indükler gösterdi bağımsız olarak da ama yanında ligand Kapılı iyon doğrudan harekete geçirmek LGC-5514kanal. Yazarlar βPEA ve DA-kaynaklı SWIP mechanistically farklıdır ve onlar kolayca deneysel olarak ayrımcılık gösterdi. Aslında, βPEA kaynaklı SWIP DA - ve dop-3iken-bağımsız, 1 dk içinde maksimal değerlere ulaşır ve hızla düşüyor sonra 2 dk14, DA-aracılı SWIP kedi-2 ve dop-3 bağımlı ve esasen sıfır 1 sonra dakika (Şekil 2). Böylece, maksimal etkileri ulaşmak için gereken süreyi büyük bir fark yoktur ve bu hızlı bir şekilde iki fenomen arasında ayırımcılık yapmasını sağlar: 1) hızlı βPEA kaynaklı SWIP 1 dakika içinde LGC-55 kanalları doğrudan etkinleştirme tarafından elde edilen ve 2) yavaş Zaman içinde (10-15 dk) hücre dışı DA bir fazlalık kurar ve DA reseptörleri DOP-3 ortaya çıkar DA aracılı SWIP3uyarılmış.
Sonuç olarak, dopaminerjik sistemin (kedi-2, dat-1, dop-3) önemli oyuncu genler ve tüketen DA depolar (reserpine) ilaçların kullanımı için nakavt hayvanlar kullanımını içeren deneyler, sağ kümesi ile SWIP oldu başarılı bir şekilde AMPH5,13gibi ilaçların etki mekanizmaları aydınlatmak için kullanılan βPEA14,15 ve azaperone6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Osama Refai Dr Randy Blakely'nın Lab SWIP otomatik analizi ile rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser NIH R01 DA042156 LC için fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
