Summary
Ce protocole montre l’analyse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale par électrophorèse sur gel de polyacrylamide native bleu. La méthode appliquée aux cellules humaines cultivées est décrit ici.
Abstract
La respiration mitochondriale est effectuée par des complexes de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans les mitochondries. Facteurs internes et environnementaux peuvent perturber l’Assemblée et la stabilité des complexes OXPHOS. Ce protocole décrit l’analyse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale par électrophorèse sur gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) en application aux cellules humaines cultivées. Tout d’abord, les mitochondries sont extraites les cellules à l’aide de la digitonine, puis à l’aide de lauryl maltoside, les complexes OXPHOS intacts sont isolés les membranes mitochondriales. Les complexes OXPHOS sont ensuite résolus par électrophorèse sur gel en gradient en présence de la teinture chargée négativement, Coomassie bleu, qui empêche l’agrégation des protéines et assure une mobilité électrophorétique de complexes protéiques vers la cathode. Enfin, les complexes OXPHOS sont détectés par immunotransfert standard. BN-PAGE est donc une technique pratique et peu coûteuse qui peut être utilisée pour évaluer l’Assemblée entière complexes OXPHOS, contrairement à la base SDS-PAGE, ce qui permet l’étude des seuls OXPHOS complexes sous-unités individuelles.
Introduction
Les mitochondries sont des organites multifonctionnels joue un rôle important dans la production d’énergie, régulation du métabolisme cellulaire, la signalisation, l’apoptose, le vieillissement, etc.1,2,3. La production d’énergie dans les mitochondries s’appuie sur la fonction de la phosphorylation oxydative qui couple la respiration avec la synthèse d’ATP. Dans les cellules humaines, le système de la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) se compose de cinq complexes. Complexes des I-IV créer un gradient électrochimique de protons dans l’espace intermembranaire mitochondrial qui est utilisé par V complexe pour produire de l’ATP. Chaque OXPHOS complexe est multimériques et, sauf le complexe II, composé de sous-unités codées par des gènes nucléaires et mitochondriales. Tous les défauts dans les composants principaux des complexes OXPHOS causées par des mutations ou des stress environnementaux peuvent perturber l’Assemblée et la fonctionnalité du système de la phosphorylation oxydative. En outre, l’assemblage correct des fonctionnels complexes OXPHOS nécessite un grand nombre de facteurs de l’Assemblée pour4,5,6.
Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une technique fondamentale permettant ainsi des analyses complexes de protéine intacte et peut être utilisé pour étudier l’assemblage des complexes OXPHOS. Tout d’abord, les mitochondries sont isolés des cellules par la digitonine, qui est un détergent doux qui permeabilizes de la membrane plasmique des cellules. Puis, à l’aide de lauryl maltoside, complexes OXPHOS sont libérées par les membranes mitochondriales. Par électrophorèse sur gel en gradient, les complexes OXPHOS sont séparés selon leur masse. G-250 bleu (pas R-250) ajouté à la solution tampon et le tampon de cathode bleu de Coomassie dissocie des associations de détergent-labile mais préserve la chaîne respiratoire individuels complexes intacts8. Au cours de l’électrophorèse, le tampon de cathode bleu contenant un colorant est remplacé par le tampon de cathode sans colorant, ce qui garantit un transfert efficace des complexes OXPHOS au PVDF membrane8. Pour visualiser des complexes OXPHOS, la membrane PVDF est séquentiellement incubée avec l’anticorps correspondant aux sous-unités sélectionnées des cinq complexes OXPHOS.
La méthode décrite ici avec quelques modifications peut être appliquée à des cellules cultivées. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l’analyse des complexes OXPHOS mitochondries isolées d' échantillons de tissus9. BN-PAGE nécessite au moins 5 à 10 µg de mitochondries pour chaque échantillon par course. À l’aide de la méthode décrite ici, 500 000 cellules par exemple HEK293, SH-SY5Y cultivées ou cellules 143 ter peuvent produire environ 10 µg de mitochondries. Cependant, une quantité suffisante de cellules pour l’analyse de la BN a dépend du type de cellule spécifique.
La méthode la plus courante pour l’étude des protéines mitochondriales de OXPHOS est SDS-PAGE et transfert Western. Cependant, SDS-PAGE permet d’étudier uniquement les sous-unités OXPHOS individuelles et, contrairement à BN-PAGE, ne peut servir à évaluer l’Assemblée entière complexes OXPHOS. Claire natif-PAGE sépare complexes protéiques en conditions natives sans la présence de colorant chargé négativement et a une résolution nettement inférieure par rapport à BN-PAGE. Toutefois, claire natif-PAGE est plus doux que BN-PAGE, donc il peut conserver des assemblages supramoléculaires labiles de complexes protéiques tels que supercomplexes OXPHOS qui sont dissociées sous les conditions de BN-PAGE10. Dans ce protocole, le gradient gel est utilisé pour séparer des complexes ; Cependant, sinon, non-gradient de séparation peut être utilisée si le fabricant de gradient relativement coûteux n’est pas disponible11.
Important, la méthode décrite ici permet d’analyser l’assemblage des complexes OXPHOS, tandis que la fonctionnalité des complexes n’est pas évaluée. Une haute résolution BN-PAGE suivi d’activité en gel test11 comme dosage spectrophotométrique d’activité enzymatique des complexes mitochondriaux12 sont des techniques efficaces pour l’analyse fonctionnelle des complexes OXPHOS. Toutefois, ces deux méthodes ne pas doser l’assemblage des complexes OXPHOS.
BN-PAGE est donc la méthode optimale d’enquêter sur l’assemblage de différents complexes OXPHOS. Par exemple, certaines maladies mitochondriales, telles que la neuropathie optique héréditaire Leber (LHON), encéphalopathie mitochondriale avec acidose lactique et les accidents vasculaires cérébraux-comme les épisodes (MELAS), sont associés à Assemblée altérée d’un ou plusieurs composants de la OXPHOS système5. En utilisant la méthode de BN-PAGE décrite ici, les mécanismes moléculaires des maladies mitochondriales peuvent être étudiés.
Protocol
spaNOTE : ce protocole est basé sur une publication associée par Hilander Al.13 .
1. préparation des solutions et tampons
Remarque : Tous les tampons et les solutions utilisées dans le protocole sont résumées dans le tableau 1. Les volumes donnés des tampons sont suffisantes pour préparer et exécuter 10 échantillons. Tous les tampons peuvent être stockés à + 4 ° C pendant un an.
- Préparer 20 mL 3 x tampon de gel contenant de l’acide aminocaproïque 1,5 M, 150 mM Bis-tris dans l’eau distillée (dH2O). Ajuster le pH à 7.0.
- Préparer 10 mL d’acide aminocaproïque 2 M dH2O.
- Préparer 1 mL de tampon mitochondriale en combinant ce qui suit : 0,5 mL de 3 x tampon gel, 0,5 mL d’acide aminocaproïque 2 M et 4 µL de 500 mM EDTA.
- Préparer 1 000 mL de tampon de cathode contenant 15 mM de Bis-tris et 50 mM de tricine dH2O. ajuster le pH à 7.0.
- Préparer, 200 mL de tampon de cathode bleu en ajoutant 0,04 g de bleu de Coomassie G-250 dans 200 mL de tampon de la cathode.
- Préparer 1 000 mL de tampon d’anode contenant 50 mM tris-Bis en dH2O. ajuster le pH à 7.0.
- Préparer 2,5 mL de solution tampon contenant l’acide aminocaproïque 750 mM et 5 % bleu de Coomassie G-250 dH2O.
2. préparation des lysats mitochondriales
- Les cellules de la plaque la veille de la collection. Pour les cellules HEK293 ou 143 ter, l’utilisation Dulbecco aigle modifié (DMEM) avec sérum de veau fœtal 10 %, 1 % L-glutamine, 100 mg/mL de pénicilline et la streptomycine 100 mg/mL. Cultiver les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à + 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 5 % de CO2 . Veiller à ce qu’il y a au moins 500 000 cellules pour chaque échantillon sur le jour du prélèvement.
- Laver délicatement les cellules une fois avec du PBS glacée. Évitez de détachement des cellules de la plaque. Gratter les cellules et les granulés à 800 x g pendant 10 min à + 4 ° C.
- Laver le culot cellulaire deux fois avec du PBS glacée et centrifuger comme au point 2.2. Mesurer la concentration de protéine avec la méthode de Bradford, à l’aide d’une trousse commerciale. Pellet les cellules à 800 x g pendant 10 min à + 4 ° C.
Remarque : Après le prélèvement de cellules, effectuez toutes les opérations à + 4 ° C et ne pas vortexer. - Préparer 20 mL de PBS avec inhibiteur de protéase en ajoutant 200 µL d’inhibiteur de protéase x 100 à 20 mL de PBS. Rester sur la glace. Remettre en suspension les cellules dans du PBS avec inhibiteur de protéase à une concentration de la protéine finale de 5 mg/mL.
- Pour calculer le volume de PBS avec inhibiteur de protéase nécessaire pour remettre en suspension les cellules à 5 mg/mL, calculer la quantité de protéine dans chaque échantillon. Pour ce calcul, utilisez la concentration de protéine mesurée à l’étape 2.3 et le volume de PBS utilisé pour remettre en suspension les cellules après le lavage à l’étape 2.3.
- Préparer 1 mL de 3,3 mM digitonine dans du PBS avec inhibiteur de protéase. Ajouter la digitonine 3,3 mM à une concentration finale de 1. 65 mM. Bien mélanger et laisser incuber sur glace pendant 5 min.
- Pour préparer 1 mL de 3,3 mM digitonine dans du PBS avec inhibiteur de protéase, dissoudre 4 mg de digitonine dans 1 mL de PBS à 100 ° C jusqu'à ce qu’aucun précipité n’est visible et laisser refroidir sur la glace immédiatement. Ajouter 10 µL d’inhibiteur de protéase 100 x à 1 mL de solution de la digitonine.
Remarque : Utilisez uniquement une solution fraîche de digitonine.
Attention : La digitonine est toxique ! Utilisez un masque facial, des gants et une blouse de laboratoire.
- Pour préparer 1 mL de 3,3 mM digitonine dans du PBS avec inhibiteur de protéase, dissoudre 4 mg de digitonine dans 1 mL de PBS à 100 ° C jusqu'à ce qu’aucun précipité n’est visible et laisser refroidir sur la glace immédiatement. Ajouter 10 µL d’inhibiteur de protéase 100 x à 1 mL de solution de la digitonine.
- Ajouter PBS avec inhibiteur de protéinase (préparé à l’étape 2.4) au volume final de 1,5 mL. Centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à + 4 ° C. Retirez le surnageant. Dans cette étape, les mitochondries sont granulées.
- Resuspendre le culot mitochondrial dans tampon mitochondriale. Le volume de tampon mitochondriale est la moitié du volume de PBS à l’étape 2.4.
- Préparer les frais maltoside de lauryl de 10 % dans du PBS contenant des inhibiteurs de la protéase (préparé à l’étape 2.4). 1 mL est suffisante pour 10 échantillons. Ajouter 10 % lauryl maltoside à la concentration finale de 1 %. Incuber sur glace pendant 15 min (cette étape peut être plus longue jusqu'à quelques heures).
- Centrifuger à 20 000 x g pendant 20 min à + 4 ° C. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube. Mesurer la concentration en protéines par la méthode de Bradford, à l’aide d’un kit. Ajouter le tampon de l’échantillon, un volume qui est la moitié du volume de lauryl maltoside utilisé à l’étape 2.8. Échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant 6 mois.
3. préparation du gel de gradient pour BN-PAGE
- Verser le gel de gradient pour BN-PAGE à température ambiante. Placez le gradient maker sur une assiette de remuer et branchez-le avec des tuyaux flexibles de la pompe péristaltique. Attacher une perfusion avec l’aiguille à la tubulure. Placez un agitateur magnétique dans la chambre proximale du fabricant dégradé. Laver le tube avec dH2O à vitesse maximale pendant 10 min.
- Vider le tube et le fabricant de gradient. Utiliser une pipette pour enlever les restes de dH2O dans le chenal entre les chambres de la machine à gradient. Fermer le canal et le tube avec la valve.
- À l’aide de pinces et cadre de moulage assembler deux plaques de verre dans la porte, qui a un trou sur le fond, et placez-le sur le stand. Assurez-vous qu’il est plus ou moins sur une surface droite avec un équilibre de l’eau. Place l’aiguille reliée au tuyau entre les plaques de verre.
- Préparer des solutions de gel de 6 % et 15 % (tableau 2). Rester sur la glace. Ajouter le persulfate d’ammonium (APS) et tetramethylenediamine (TEMED) (ils commencent à polymérisation) dernier. Mélanger doucement pour éviter de prendre l’air des bulles.
- Charger l’extrémité proximale de la chambre de gradient-gel-mélangeur tubes avec gel de 6 % et l’extrémité distale avec gel de 15 %. Le volume total du gel doit être égal au volume de la gel de séparation entre les plaques de verre. Par conséquent, utiliser 2,6 mL de gel de 6 % et 2,1 mL de gel de 15 % au batteur sur gel en gradient pour le gel d’un 8,3 cm x 7,3 cm de taille.
- Basculez sur l’agitateur magnétique et ouvrez le tube et le canal entre chambres de la machine à gradient. Immédiatement mettre en marche la pompe péristaltique à 5 mL/min. Remplissez les plaques de verre et ne permettent pas de bulles d’entrer dans le gel. Retirez l’aiguille quand il n’y a aucun gel dans le tube.
- Doucement le gel avec dH2O. garder le gel à température ambiante pendant au moins 1 h pour la polymérisation de superposition.
- Immédiatement après la coulée du gel, laver le tube de remplissage dégradés chambres avec dH2O et à l’aide de la pompe péristaltique à vitesse maximale. Lors de la préparation des gels deux et plus, nettoyez toujours le système dans l’intervalle.
- Préparer 1 tampon de gel x en mélangeant 3 mL 3 x tampon gel et ajouter 6 mL de dH2O. Remove dH2O de la surface du gel avec le papier filtre doucement. Laver la surface du gel avec 1 x tampon de gel. Retirez doucement 1 x tampon de gel avec du papier filtre.
- Évitez les fibres du papier filtre sur le gel. Pour ce faire, couper le papier en petits morceaux avec des ciseaux, mais ne pas déchirer le papier.
- Placez le peigne entre les plaques de verre, mais ne pas immerger complètement pour être en mesure de verser le gel de concentration sous le peigne. Préparer les 4 % stacking gel (tableau 2). Ajouter APS et TEMED dernière qu’ils commencent la polymérisation facilement. Mélanger délicatement en évitant de bulles d’air.
- Le gel de concentration, en évitant les bulles sous le peigne, de superposition et plonger le peigne entièrement. Laisser le gel de concentration se polymériser au moins 30 min. retirer le peigne et laver les puits avec 1 x tampon de gel à l’aide d’une pipette.
- Après polymérisation, le gel peut être stocké à + 4 ° C pendant quelques jours. Pour stocker le gel, enveloppez le gel dans du papier imbibé de dH2O et plastique film afin d’éviter le séchage du gel.
4. bleu natif de l’électrophorèse
Remarque : Pour empêcher la dégradation du OXPHOS complexes exécutent électrophorèse à + 4 ° C. Utiliser des tampons préalablement réfrigérées.
- Charger la cassette de gel avec le tampon de cathode bleu jusqu’au fond des puits. Chargement des échantillons est plus facile lorsque la cassette n’est pas remplie jusqu’au sommet. Laver les puits avec le tampon de cathode bleu et ensuite remplir les puits avec le tampon de cathode bleu à l’aide de la pipette.
- Charger les échantillons (5 à 30 µg de protéines) dans le puits. Remplir doucement la cassette de gel vers le haut avec le tampon bleu cathode et le réservoir avec du tampon de l’anode.
- Exécutez le gel pendant 15 min à une tension constante de 40 V. Puis augmentez la tension de 80 V (ou utilisez un courant constant de 6 mA), ne dépassez pas 10 mA. Exécutez le gel colorant jusqu'à 2/3 de la longueur du gel.
- Remplacer le tampon de cathode bleu avec le tampon de la cathode et continuer l’électrophorèse jusqu'à ce que le front de colorant est épuisé. Au total, électrophorèse prend environ 3 heures.
- Récupérer les plaques de verre, puis transférer les protéines à la membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) en semi sèche en tamponnant. Utiliser une tension constante de 25 V et un courant limité à 1,0 A pendant 30 min.
- Également utiliser un buvard humide pour les complexes OXPHOS de transfert sur une membrane de PVDF.
- Continuer avec le blocage de l’incubation de membrane et anticorps selon le protocole standard immunoblotting. Utiliser les anticorps primaires contre les sous-unités des complexes OXPHOS séquentiellement.
NOTE : par exemple, utiliser des anticorps anti-NDUFA9 (1 : 2000) pour le complexe I, anticorps anti-SDHA (1 : 2000) pour le complexe II, anticorps anti-UQCRC2 (1 : 1000) pour le complexe III, anticorps anti-COX1 (1 : 2000) pour les complexes anticorps IV et anti-ATP5A (1 : 2000) pour V complexe. La liste des anticorps est présentée dans la Table des matières.
Representative Results
À l’aide de BN-PAGE, défauts dans l’assemblage des complexes OXPHOS mitochondriales peuvent être étudiées. Figure 1 a décrit l’assemblage des complexes de la chaîne respiratoire des cellules de neuroblastome humain (SH-SY5Y) traitées avec chloramphénicol, qui inhibe spécifiquement la traduction d’ADNmt codé des sous-unités OXPHOS. Chloramphénicol appauvri les complexes OXPHOS contenant les sous-unités codées mitochondries (complexes I, III, IV ; Figure 1 a), tandis que le complexe II, qui est exclusivement codée par des gènes nucléaires, a été de pénalisation surexprimés. Complexe V n’était pas immunoblotted ici.
Plusieurs cycles de gel-dégel détruisent complexes OXPHOS. Figure 1 b montre la dégradation des complexes OXPHOS par les cycles de gel-dégel. Des complexes de respiratoires mitochondriales en échantillon 3 ayant subi plusieurs cycles de gel-dégel ont une intensité plus faible de la bande et sont décalés par rapport aux mêmes échantillons, qui ont été gelés en une seule fois. Une image de la tache occidentale sous couverture végétale de la Figure 1 b est montrée supplémentaire Figure 1.
La qualité du gel est importante pour les bandes de claires et nettes. Figure 1C montre un immunoblot d’un gel qui ne pas bien polymériser. Décapage de la membrane peut également affecter la détection de OXPHOS complexes. Figure 1D, complexe j’ai ai été détecté avant ou après le décapage. Le rapport signal sur bruit est beaucoup plus faible après le décapage.
Figure 1. immunoblots BN-PAGE des expériences réussies et sous-optimal. (A) les complexes de l’appauvrissement des OXPHOS par inhibiteur de traduction mitochondriale. Cellules de neuroblastome humain (SH-SY5Y) ont été traités avec le chloramphénicol (CAP) pendant 48 heures. CTRL, cellules témoins sans traitement de chloramphénicol. Le panneau inférieur affiche la quantification de l’immunoblot. La valeur du contrôle est prise comme 1 (représenté par une ligne en pointillés). Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type, n = 3, * P < 0,0001 par rapport à l’aide de la commande non appariés test t de Student. Complexes de perturbation de OXPHOS (B) par plusieurs cycles de gel-dégel. Échantillons 1-3 ont été préparés à partir de cellules humaines ostéosarcome (143 b) dans les mêmes conditions. Nombre d’échantillons 1 et 2 ont été gelés et fondues en une seule fois, tandis que le nombre d’échantillon 3 a subi quatre cycles de gel-dégel. (C) BN-PAGE immunobuvardages de complexes OXPHOS isolés des cellules HEK293. Les bavures des bandes est causée par la mauvaise qualité du gel. (D) effet d’exhib sur la détection de OXPHOS complexes. Détection du complexe I dans les cellules de neuroblastome humain (SH-SY5Y) avant et après le décapage de la même membrane. Complexes de OXPHOS ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-NDUFA9 (complexe I), anticorps anti-SDHA (complexe II), les anticorps anti-UQCRC2 (complexe III) et les anticorps anti-COX1 (complexe IV). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Solution tampon ou solution | Composition | Recette |
| 3 x gel tampon | 5 l’acide aminocaproïque 1. M | 3,94 g d’acide aminocaproïque |
| 150 mM Bis-tris | 0,63 g de Bis-tris | |
| dH2O | Ajouter dH2O à 20 mL | |
| pH 7,0 | Ajuster le pH à 7.0 | |
| Tampon de cathode | 15 mM Bis-tris | 3,14 g de Bis-tris |
| 50 mM tricine | 8,96 g de tricine | |
| dH2O | Ajouter dH2O à 1000 mL | |
| pH 7,0 | Ajuster le pH à 7.0 | |
| Tampon bleu cathode | bleu de coomassie 0,02 % G | 0,04 g de Serva bleu G |
| 15 mM Bis-tris | 200 mL de tampon de Cathode | |
| 50 mM tricine | ||
| dH2O | ||
| pH 7,0 | ||
| Tampon de l’anode | 50 mM tris-Bis | 20,93 g |
| dH2O | Ajouter dH2O à 2000 mL | |
| pH 7,0 | Ajuster le pH à 7.0 | |
| Tampon mitochondriale | 1,75 l’acide aminocaproïque M | 0,5 mL de 3 x tampon gel |
| 75 mM Bis-tris | 0,5 mL d’acide aminocaproïque 2 M | |
| 2 mM EDTA | 4 µL de 500 mM EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7,0 | - | |
| Solution tampon | acide aminocaproïque 750 mM | 0,94 mL d’acide aminocaproïque 2 M |
| 5 % comassie bleu G | 0,125 g de Serva bleu G | |
| dH2O | Ajouter dH2O à 2,5 mL | |
| Acide aminocaproïque 2M | Acide aminocaproïque 2 M | 2.62 g d’acide aminocaproïque |
| dH2O | Ajouter dH2O à 10 mL |
Le tableau 1. Tampons et solutions utilisées pour BN-PAGE.
| Gels natifs bleus | Gel de séparation 6 % | Gel de séparation 15 % | Gel de 4 % de concentration |
| 3 x gel tampon | 3,3 mL | 3,3 mL | 1,64 mL |
| 40 % d’Acrylamide/Bis 37.5:1 | 1,5 mL | 3,75 mL | 0,5 mL |
| dH2O | 5,14 mL | 0,93 mL | 2,77 mL |
| Glycérol | 0 | 2 mL | 0 |
| Le persulfate d’ammonium 10 % * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| Volume total | 10 mL | 10 mL | 5 mL |
| * Faire le persulfate d’ammonium 10 % toujours fraîche en dH2O | |||
Le tableau 2. Recettes de gel pour BN-PAGE.
Complémentaire Figure 1. image incultes tache occidentale de Figure 1 b. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Discussion
Une des parties plus critiques du protocole est de préserver intacts complexes OXPHOS au cours de la préparation de l’échantillon, stockage et électrophorèse sur gel. Ainsi, les mitochondries doivent être isolés à + 4 ° C et les échantillons ne devraient pas subir cycles gel-dégel. Complexes de OXPHOS peuvent tolérer seulement un cycle de gel-dégel durant toute la procédure. Plusieurs cycles de gel-dégel détruisent complexes OXPHOS (Figure 1 b). Contrôle et échantillons expérimentaux qui doivent être comparés doivent être préparés en parallèle afin d’éviter toute différence dans les conditions de stockage, qui pourraient donner des résultats trompeurs. S’il n’est pas possible d’effectuer toutes les étapes du protocole en parallèle avec tous les échantillons, nous recommandons de congeler des boulettes de cellules lavées à-80 ° C (étape 1.4 du présent protocole) et plus tard effectuer le reste du protocole pour tous les échantillons ensemble au moins jusqu’au gel elec trophoresis. Devrait être une attention particulière à la propreté de l’appareil d’électrophorèse (réservoir, cassette). Si le même appareil est utilisé pour SDS-PAGE, lavez-le bien avant BN-PAGE. Toute SDS résiduel peut provoquer la dissociation des complexes OXPHOS pendant l’électrophorèse.
Les gels gradients de haute qualité sont un autre élément essentiel du protocole. Les gels préfabriqués pour bleue PAGE native sont disponibles dans le commerce ; Toutefois, il est déconseillé de les utiliser, étant donné que les tampons utilisés pour les gels commerciaux pourraient avoir une composition qui diffère les tampons de l’échantillon. Le gradient du gel utilisé ici (6-15 %) est optimal pour la séparation des différents complexes OXPHOS. Pour détecter l’ordre supérieur des structures supramoléculaires de OXPHOS, chaîne respiratoire également connu sous le nom supercomplexes14, certaine optimisation est requis11.
Pour la visualisation de OXPHOS complexes utilisent les anticorps spécifiques dans l’ordre, selon leurs propriétés. Par exemple, utilisez d’abord l’anticorps qui donne le signal plus faible et un anticorps avec le signal le plus fort modifié. Ceci est important car le décapage affaiblit la détection (Figure 1). La composition des complexes de la chaîne respiratoire peut être étudiée si après BN-PAGE, le gel est soumis à la deuxième dimension SDS-PAGE15.
Le protocole décrit ici suggère d’utiliser des anticorps dirigés contre des complexes individuels OXPHOS séquentiellement. Toutefois, l’anticorps disponibles dans le commerce de OXPHOS cocktail peut servir à détecter tous les cinq complexes OXPHOS simultanément. Néanmoins, pour pouvoir déceler les incomplètement assemblé OXPHOS complexes et de définir leur identité, anticorps dirigés contre des complexes OXPHOS individuels doivent être utilisés dans l’ordre. Cette étape prend du temps ; Toutefois, il peut être essentiel pour les essais de modèles et nouvelles conditions expérimentales.
La concentration de la digitonine utilisée pour isoler les mitochondries doit être optimisée pour le type de cellule spécifique. Comme un détergent, digitonine permeabilizes des membranes cellulaires. La concentration optimale de la digitonine permeabilizes efficacement la membrane plasmique des cellules laissant les membranes mitochondriales intact. Trop faible concentration de digitonine provoque une contamination élevée des extraits mitochondriales alors qu’une concentration trop élevée endommage les membranes mitochondriales et réduit le rendement total mitochondrial. Le ratio optimal digitonine/protéines (g/g) varie de 0,3 à 1. Analyse par Western blot des protéines extraites des granulés et des surnageants peut servir à tester la concentration optimale de digitonine16.
Ce protocole n’inclut pas la protéine chargement contrôle sur l’immunoblot ; par conséquent, la concentration de protéine des extraits complexes devrait être soigneusement mesurée au moins dans réanalysés pour assurer le chargement égal. En outre, les échantillons peuvent être exécutées dans BN-PAGE en répétitions. Si l’Assemblée de sélectives complexes OXPHOS est médiocres, complexes ne peuvent servir de chargement de contrôles.
Il est difficile l’estimation de la masse moléculaire des complexes protéiques de la BN-PAGE18. Le protocole actuel ne comprend pas le marqueur de poids moléculaire ; par conséquent, pour estimer l’assemblage des complexes OXPHOS, les échantillons de contrôle contenant des complexes pas affectées doivent toujours être inclus dans l’analyse. Les échantillons de contrôle pour BN-PAGE sont généralement des cellules de type sauvage ou non.
La méthode présentée ici est optimisée pour la détection des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale ; Toutefois, elle peut également être appliquée pour l’évaluation d’oligomérisation des protéines mitochondriales19. En outre, le taux de l’assemblage des complexes OXPHOS peut être étudié par premiers complexes contenant appauvrissant la sous-unité mitochondriales codées de chloramphénicol et puis après leur récupération après l’enlèvement de chloramphénicol10. Ainsi, BN-PAGE peut servir à évaluer les niveaux de l’équilibre et l’assemblage de OXPHOS pour différentes applications de diagnostic moléculaire des maladies mitochondriales humaines9,11.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Helsinki University Library est remercié pour le soutien financier dans l’édition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
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