Summary
هذا البروتوكول يوضح تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد زرقاء هلام polyacrylamide الأصلية. ويرد هنا طريقة تطبيقها على الخلايا البشرية المزروعة.
Abstract
ويقوم التنفس المتقدرية بالمجمعات الفسفرة (أوكسفوس) داخل الميتوكوندريا. يمكن التشويش العوامل الداخلية والبيئية في الجمعية واستقرار المجمعات أوكسفوس. يصف هذا البروتوكول تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد جل polyacrylamide الأصلي الأزرق (BN-الصفحة) في التطبيق على الخلايا البشرية المزروعة. أولاً، يتم استخراج الميتوكوندريا من الخلايا باستخدام ديجيتونين، ثم استخدام مالتوسيدي دوديسيل، مجمعات أوكسفوس سليمة يتم عزل من أغشية الميتوكوندريا. ثم يتم حل مجمعات أوكسفوس بالتفريد جل التدرج حضور صبغ مشحونة سلبا، أخذ الأزرق، الذي يمنع تجميع البروتين ويضمن التنقل الغرواني الكهربي للبروتين المجمعات نحو الكاثود. وأخيراً، يتم الكشف عن مجمعات أوكسفوس قبل إيمونوبلوتينج القياسية. وهكذا، هو BN-صفحة تقنية مريحة وغير مكلفة التي يمكن استخدامها لتقييم الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس كامل، على النقيض من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة الأساسية يتيح دراسة فقط الفردية أوكسفوس مفارز المعقدة.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات المتعددة الوظائف التي تلعب دوراً هاما في إنتاج الطاقة، وتنظيم الأيض الخلوية، إشارات، المبرمج، الشيخوخة، إلخ1،،من23. يعتمد إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا على الدالة الفسفرة الأزواج التنفس مع توليف ATP. في الخلايا البشرية، يتألف نظام الفسفرة المتقدرية (أوكسفوس) من المجمعات الخمسة. إنشاء مجمعات من الأول إلى الرابع تدرج بروتون الكهروكيميائية في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا التي تستخدمها الخامس مجمع لإنتاج ATP. كل أوكسفوس المعقدة مولتيميريك، وما عدا الثاني معقدة، تتألف من الوحدات الفرعية مرمزة بواسطة المورثات النووية سواء المتقدرية. أي عيوب في المكونات الأساسية لمجمعات أوكسفوس بسبب الطفرات أو الإجهاد البيئي يمكن التشويش على الجمعية ووظائف النظام الفسفرة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب الجمعية المناسب الوظيفي أوكسفوس مجمعات عددا كبيرا من الجمعية العوامل4،،من56.
هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) هو أسلوب أساسي تمكين تحليل البروتين سليمة المجمعات ويمكن استخدامها لدراسة الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس. أولاً، الميتوكوندريا معزولة من الخلايا التي ديجيتونين، وهو خفيف منظفات التي بيرميبيليزيس غشاء البلازما للخلايا. ثم، باستخدام مالتوسيدي سولفات، يتم إطلاق سراح مجمعات أوكسفوس من أغشية الميتوكوندريا. باستخدام التفريد جل التدرج، يتم فصل مجمعات أوكسفوس حسب كتلتها. أخذ G-250 الأزرق (لا R-250) إضافة إلى المخزن المؤقت عينة والمخزن المؤقت كاثود الأزرق تنأى بالجمعيات المنظفات مجا ولكن يحافظ على سلسلة التنفس فرادى مجمعات سليمة8. أثناء التفريد، يتم استبدال كاثود الأزرق المخزن المؤقت الذي يحتوي على صبغ الكاثود المخزن المؤقت دون صباغة، مما يضمن كفاءة نقل مجمعات أوكسفوس ل الغشاء PVDF8. تصور مجمعات أوكسفوس، هو الغشاء PVDF المحتضنة تسلسلياً مع الأجسام المضادة المقابلة للوحدات الفرعية المحددة من المجمعات أوكسفوس الخمسة.
يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا مع بعض التعديلات لأي الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحليل مجمعات أوكسفوس في الميتوكوندريا المعزولة من عينات الأنسجة9. BN-الصفحة يتطلب على الأقل 5-10 ميكروغرام من الميتوكوندريا لكل عينة في تشغيل. باستخدام الطريقة الموضحة هنا، 500,000 مثقف خلايا مثل HEK293، SH SY5Y أو يمكن أن تسفر عن الخلايا 143B حوالي 10 ميكروغرام من الميتوكوندريا. ومع ذلك، كمية كافية من الخلايا لتحليل BN يعتمد على نوع الخلية المحددة.
هو الأسلوب الأكثر شيوعاً لدراسة الميتوكوندريا أوكسفوس البروتينات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. بيد أن الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تتيح دراسة فقط مفارز أوكسفوس الفردية وخلافا لصفحة الجبهة الوطنية، لا يمكن استخدامها لتقييم الجمعية بأكملها أوكسفوس المجمعات. صفحة أصلي واضح يفصل البروتين المجمعات في الشروط الأصلية دون الوجود صبغ مشحونة سلبا وقد حل أقل بكثير بالمقارنة مع BN-الصفحة. بيد أن الصفحة الأصلية واضحة أكثر اعتدالا من BN-الصفحة حيث أنه يمكن الاحتفاظ بالجمعيات سوبراموليكولار مجا مجمعات البروتين مثل سوبيركومبليكسيس أوكسفوس التي يتم فصلها تحت ظروف BN-الصفحة10. في هذا البروتوكول، يتم استخدام هلام التدرج لفصل المجمعات؛ ومع ذلك، بدلاً من ذلك، فصل غير التدرج يمكن استخدامها إذا لم يكن صانع التدرج مكلفة نسبيا المتاحة11.
المهم، الأسلوب الموصوفة هنا يسمح تحليل الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس، في حين لا يتم تقييم الأداء الوظيفي للمجمعات. صفحة BN الاستبانة تليها في جل نشاط الإنزيم11 فضلا عن مقايسة النشاط الأنزيمي سبيكتروفوتوميتريك المجمعات المتقدرية12 تقنيات فعالة للتحليل الوظيفي من المجمعات أوكسفوس. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب لا الاعتداء الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس.
وهكذا، BN-الصفحة هو الأسلوب الأمثل للتحقيق في الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس الفردية. على سبيل المثال، بعض الاضطرابات الميتوكوندريا، مثل يبر وراثية الألياف البصرية الاعتلال العصبي (لون)، اعتلال الدماغ الميتوكوندريا مع الحماض اللبن والسكتة الدماغية مثل الحلقات (ميلس)، ترتبط مع الجمعية غيرت من مكون واحد أو أكثر من أوكسفوس 5من النظام. باستخدام الأسلوب BN-الصفحة الموصوفة هنا، يمكن دراسة الآليات الجزيئية لأمراض الميتوكوندريا.
Protocol
سبانوتي: هذا البروتوكول يستند منشور المقترنة بواسطة هيلاندير et al.13 .
1-إعداد المخازن المؤقتة والحلول
ملاحظة: جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في البروتوكول ويرد في الجدول 1. أحجام المخازن المؤقتة المعطاة تكفي لإعداد وتشغيل 10 عينات. ويمكن تخزين كافة المخازن المؤقتة عند + 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
- إعداد 20 مل 3 س جل المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض أمينوكابرويك 1.5 م، 150 مم مكررا-تريس في الماء المقطر (dH2س). ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
- إعداد 10 مل حمض أمينوكابرويك م 2 في dH2o.
- إعداد 1 مل المتقدرية المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين ما يلي: 0.5 مل 3 س جل المخزن المؤقت، 0.5 مل حمض أمينوكابرويك م 2 و 4 ميليلتر من 500 مم يدتا.
- إعداد 1,000 مل من الكاثود مخزن يحتوي على 15 مم من تريس مكررا و 50 مم من تريسيني في dH2O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
- إعداد 200 مل من كاثود الأزرق المخزن المؤقت عن طريق إضافة 0.04 غ G-250 أخذ الأزرق إلى 200 مل من الكاثود المخزن المؤقت.
- إعداد 1,000 مل من اﻷنود مخزن يحتوي على 50 مم مكررا-تريس في dH2O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى الإصدار 7.0.
- إعداد 2.5 مل من العينة المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض أمينوكابرويك 750 ملم والأزرق أخذ 5% G-250 في dH2o.
2-إعداد ليساتيس الميتوكوندريا
- لوحة الخلايا قبل جمع اليوم. للخلايا HEK293 أو 143B، تعديل استخدام دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% ل الجلوتامين، البنسلين 100 مغ/مل وستربتوميسين 100 ملغ/مل. تنمو الخلايا في حاضنة ثقافة خلية في +37 درجة مئوية في جو هوميديفيد2 CO 5%. التأكد من أن هناك خلايا 500,000 على الأقل لكل عينة في يوم جمع.
- تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني المثلج بلطف. تجنب فصل الخلايا من اللوحة. تتخلص من الخلايا وبيليه لهم في 800 x غ لمدة 10 دقائق في + 4 درجة مئوية.
- أغسل بيليه خلية مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج، والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2، 2. قياس تركيز البروتين مع أسلوب برادفورد باستخدام مجموعة أدوات تجارية. بيليه الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق في + 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد جمع الخلايا والقيام بجميع الخطوات في + 4 درجة مئوية ودوامه لا تفعل. - إعداد 20 مل من برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز بإضافة 200 ميليلتر من مثبطات البروتياز x 100 مل 20 من برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الجليد. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز لتركيز بروتين نهائي من 5 ملغ/مل.
- لحساب حجم برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز بحاجة إلى ريسوسبيند الخلايا في 5 ملغ/مل، حساب كمية البروتين في كل عينة. لهذا الحساب، استخدم تركيز البروتين يقاس في الخطوة 2، 3، وحجم برنامج تلفزيوني المستخدمة في ريسوسبيند الخلايا بعد الغسيل في الخطوة 2، 3.
- إعداد 1 مل ديجيتونين 3.3 ملم في برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتياز. إضافة ديجيتونين مم 3.3 إلى تركيز نهائي من 1.65 مم. يخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- لتحضير 1 مل ديجيتونين 3.3 ملم في برنامج تلفزيوني مع مثبطات البروتياز، حل 4 مغ ديجيتونين في 1 مل من برنامج تلفزيوني في 100 درجة مئوية حتى لا متسرعا مرئية وباردة على الجليد فورا. إضافة 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز x 100 إلى 1 مل من محلول ديجيتونين.
ملاحظة: استخدم فقط حلاً جديدة من ديجيتونين.
تنبيه: ديجيتونين السامة! استخدام قناع لوجه وقفازات ومعطف معمل.
- لتحضير 1 مل ديجيتونين 3.3 ملم في برنامج تلفزيوني مع مثبطات البروتياز، حل 4 مغ ديجيتونين في 1 مل من برنامج تلفزيوني في 100 درجة مئوية حتى لا متسرعا مرئية وباردة على الجليد فورا. إضافة 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز x 100 إلى 1 مل من محلول ديجيتونين.
- إضافة برنامج تلفزيوني مع مثبط البروتيناز (إعدادها في الخطوة 2، 4) بحجم 1.5 مل النهائي. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في الساعة 10,000 x ز + 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية. في هذه الخطوة، يتم القريبون الميتوكوندريا.
- ريسوسبيند بيليه المتقدرية mitochondrial المخزن المؤقت. حجم المخزن المؤقت المتقدرية نصف حجم برنامج تلفزيوني في الخطوة 2، 4.
- إعداد 10% دوديسيل مالتوسيدي جديدة في برنامج تلفزيوني يحتوي على مثبط البروتياز (إعدادها في الخطوة 2، 4). 1 مل يكفي للعينات العشر. إضافة 10% دوديسيل مالتوسيدي بتركيز نهائي من 1%. احتضان بالثلج لمدة 15 دقيقة (هذه الخطوة يمكن أن تكون أطول تصل إلى بضع ساعات).
- أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في + 4 درجة مئوية. جمع المادة طافية في أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد باستخدام مجموعة أدوات. إضافة نموذج العازلة، وحدة تخزين نصف حجم مالتوسيدي دوديسيل المستخدمة في الخطوة 2.8. ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
3-إعداد التدرج جل BN-الصفحة
- صب جل التدرج لصفحة الجبهة الوطنية في درجة حرارة الغرفة. وضع صانع التدرج في لوحة ضجة وتوصيله مع أنابيب مرنة إلى مضخة تمعجية. إرفاق تسريب تعيين مع الإبرة للأنبوب. ضع محرض مغناطيسي في الدائرة الدانية صانع التدرج. أغسل الأنبوب مع dH2س في سرعة المضخة الحد الأقصى لمدة 10 دقائق.
- إفراغ الأنبوب وصانع التدرج. استخدام بيبيت لإزالة أي بقايا dH2س في القناة بين دوائر صانع التدرج. إغلاق القناة والأنابيب مع الصمام.
- استخدام الإطار الصب والمشابك تجميع ألواح الزجاج اثنين في حامل، الذي ثقب في الجزء السفلي، ووضعه على الوقوف. تأكد من أن أكثر أو أقل على سطح مستقيم مع توازن الماء. مكان الإبرة متصلة بالانبوب بين ألواح الزجاج.
- إعداد الحلول هلام 6 في المائة و 15 في المائة (الجدول 2). الحفاظ على الجليد. إضافة بيرسولفاتي الأمونيوم (الجزائرية) وتيتراميثيلينيدياميني (تيميد) (تبدأ البلمرة) آخر. فقاعات المزيج برفق تجنب الوقوع في الهواء.
- تحميل الدانية نهاية الدائرة أنابيب متدرجة-جل-خلاط مع هلام 6% ونهاية القاصي مع جل 15%. ينبغي أن يكون الحجم الإجمالي للجل مساوية لحجم هلام الفاصلة بين ألواح الزجاج. وبالتالي، استخدام 2.6 مل من هلام 6% و 2.1 مل من جل 15% إلى خلاط جل التدرج لجل واحد 8.3 × 7.3 سم الحجم.
- التبديل على محرض المغناطيسية، وفتح الأنبوب والقناة بين دوائر صانع التدرج. قم بالتبديل على مضخة تمعجية فورا إلى 5 مل/دقيقة ملء ألواح الزجاج، ولا تسمح لفقاعات لإدخال الهلام. إزالة الإبرة عندما يكون هناك لا جل في الأنبوب.
- تراكب الهلام مع إبقاء O. الهلام في درجة حرارة الغرفة على الأقل 1 ح البلمرة dH2بلطف.
- فورا بعد سكب الهلام، أغسل الأنبوب بملء الدوائر التدرج مع dH2س واستخدام مضخة تمعجية بالسرعة القصوى. عند إعداد المواد الهلامية اثنين وأكثر، دائماً تنظيف النظام بين بين.
- إعداد 1 س جل العازلة بخلط 3 مل 3 س جل المخزن المؤقت وإضافة 6 مل من dH2dH إزالة سين2س من سطح الجل مع ورق الترشيح بلطف. أغسل سطح الجل مع 1 س جل المخزن المؤقت. إزالة 1 س جل المخزن المؤقت مع ورق الترشيح بلطف.
- تجنب الألياف من ورق الترشيح على الهلام. ولضمان ذلك، قطع الورق إلى قطع صغيرة مع مقص، ولكن لا تمزق الورقة.
- ضع المشط بين ألواح الزجاج، ولكن لا تزج تماما ليتمكن من صب جل التراص تحت المشط. إعداد 4% التراص هلام (الجدول 2). إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وتيميد آخر أنها تبدأ البلمرة بسهولة. المزيج بلطف تجنب فقاعات الهواء.
- تراكب هلام التراص، تجنب فقاعات تحت المشط، وتزج المشط تماما. اسمحوا التراص هلام بلمرة لإزالة المشط على الأقل 30 دقيقة ويغسل الآبار مع 1 س جل المخزن المؤقت باستخدام بيبيت.
- بعد البلمرة، يمكن تخزين الجل عند + 4 درجة مئوية لبضعة أيام. لتخزين الهلام، التفاف الهلام في ورقة غارقة مع dH2س والبلاستيك فيلم لمنع تجفيف جل.
4-التفريد جل الأصلية أزرق
ملاحظة: لمنع تدهور أوكسفوس المجمعات تشغيل التفريد عند + 4 درجة مئوية. تستخدم مخازن مبردة مسبقاً.
- تحميل الكاسيت هلام مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق حتى الجزء السفلي من الآبار. تحميل عينات من الأسهل عندما لم يتم ملء الكاسيت إلى الأعلى. غسل الآبار مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق ثم قم بملء الآبار مع الكاثود الأزرق المخزن المؤقت باستخدام بيبيت.
- تحميل العينات (5-30 ميكروغرام من البروتين) في الآبار. بلطف ملء كاسيت جل إلى الأعلى مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق والخزان مع اﻷنود المخزن المؤقت.
- تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في جهد مستمر من 40 الخامس. ثم زيادة الجهد إلى 80 الخامس (أو استخدام تيار مستمر من 6 mA)، لا تتجاوز 10 mA. تشغيل الهلام حتى الصبغ يصل إلى 2/3 طول هلام.
- يستعاض عن المخزن المؤقت كاثود الأزرق مع المخزن المؤقت الكاثود ويستمر التفريد الجبهة صبغ قد نفد. وفي المجموع، يأخذ التفريد حوالي 3 ساعات.
- استرداد ألواح الزجاج ونقل البروتينات إلى غشاء الفلوريد (PVDF) الفينيليدن بشبه الجاف النشاف. استخدام جهد مستمر من 25 الخامس والحالي يقتصر على 1.0 A لمدة 30 دقيقة.
- وبدلاً من ذلك، استخدم النشاف الرطب لنقل مجمعات أوكسفوس لغشاء PVDF.
- تواصل مع حجب الحضانة الأغشية والأجسام المضادة وفقا لبروتوكول إيمونوبلوتينج القياسية. استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد مفارز مجمعات أوكسفوس تسلسلياً.
ملاحظة: على سبيل المثال، استخدام الأجسام المضادة--NDUFA9 (1:2000) للمجمع الأول، جسم مكافحة--سدهى (1:2000) لمجمع الثاني، جسم المضادة-UQCRC2 (1: 1000) لمعقدة ثالثا، مكافحة COX1 الأجسام المضادة (1:2000) لمجمع جسم رابعا ومكافحة--ATP5A (1:2000) للخامس المعقدة. وترد قائمة الأجسام المضادة في الجدول للمواد.
Representative Results
استخدام صفحة الجبهة الوطنية، يمكن أن تحقق العيوب في جمعية الميتوكوندريا أوكسفوس المجمعات. الرقم 1A يظهر جمعية مجمعات سلسلة التنفس في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) تعامل مع الكلورامفينيكول، الذي يمنع على وجه التحديد ترجمة ترميز متدنا مفارز أوكسفوس. الكلورامفينيكول المستنفد مجمعات أوكسفوس يحتوي على ترميز ميتوتشوندريالي مفارز (مجمع الأول والثالث، الرابع؛ الرقم 1A)، بينما كان الثاني المعقدة، التي يتم ترميز حصرا بالمورثات النووية، كومبينساتوريلي أوبريجولاتيد. المجمع الخامس لم يكن إيمونوبلوتيد هنا.
عدة دورات تجميد أذاب تدمير المجمعات أوكسفوس. الرقم 1B يوضح تدهور مجمعات أوكسفوس بدورات تجميد أذاب. المجمعات التنفسية المتقدرية في عينة 3 التي خضعت لعدة دورات تجميد أذاب خفض كثافة فرقة وهي تحول بالمقارنة مع نفس العينات، التي تم تجميدها مرة واحدة فقط. صورة uncropped لطخة غربية الشكل 1B يرد في الملحق رقم 1.
المهم نوعية الجل العصابات حادة وواضحة. الرقم ج 1 يدل إيمونوبلوت من جل أن لا بلمرة جيدا. تجريد من الغشاء يمكن أن تؤثر أيضا الكشف عن مجمعات أوكسفوس. في الشكل 1 د، المعقدة قد اكتشفت قبل أو بعد تجريد. إشارة إلى نسبة الضوضاء أقل بكثير بعد تجريد.
الرقم 1-إيمونوبلوتس BN-صفحة من التجارب الناجحة ودون المستوى الأمثل. (أ) "استنفاد أوكسفوس" المجمعات مثبط للترجمة المتقدرية. وعولج الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) مع الكلورامفينيكول (CAP) لمدة 48 ساعة. CTRL، خلايا المراقبة دون العلاج الكلورامفينيكول. لوحة السفلي يظهر التحديد الكمي إيمونوبلوت. قيمة عنصر التحكم هو اعتبار 1 (يظهر كخط متقطع). وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة، n = 3، * ف مزاوج < 0.0001 بالمقارنة مع التحكم باستخدام t-اختبارات الطالب. (ب) دورات تعطيل لمجمعات أوكسفوس بتجميد أذاب متعددة. وتم إعداد العينات 1-3 من الخلايا البشرية osteosarcoma (143B) في نفس الظروف. عدد العينات 1 و 2 كانت مجمدة وذاب مرة واحدة فقط، بينما عدد العينة 3 خضع لأربع دورات لتجميد أذاب. (ج) BN-الصفحة إيمونوبلوتس من مجمعات أوكسفوس المعزولة من الخلايا HEK293. تلطيخ العصابات بسبب تدني نوعية الجل. (د) أثر تجريد في الكشف عن مجمعات أوكسفوس. كشف المجمع الأول في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما (ش-SY5Y) قبل وبعد تجريد من الغشاء نفسه. مجمعات أوكسفوس تم الكشف عن استخدام الأجسام المضادة NDUFA9 (مجمع أنا)، جسم المضادة-سدهى (مجمع الثاني) ومكافحة UQCRC2 جسم (مجمع الثالث) ومكافحة COX1 جسم (مجمع الرابع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المخزن المؤقت أو الحل | تكوين | وصفه |
| 3 x جل المخزن المؤقت | 1.5 حمض أمينوكابرويك M | ز 3.94 من حمض أمينوكابرويك |
| 150 مم مكررا-تريس | ز 0.63 في تريس مكررا | |
| dH2س | إضافة dH2س إلى 20 مل | |
| درجة الحموضة 7.0 | ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0 | |
| المخزن المؤقت الكاثود | مم 15 مكررا-تريس | ز 3.14 في تريس مكررا |
| تريسيني 50 مم | ز 8.96 من تريسيني | |
| dH2س | إضافة dH2س إلى 1000 مل | |
| درجة الحموضة 7.0 | ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0 | |
| المخزن المؤقت كاثود الأزرق | أخذ 0.02% أزرق ز | ز 0.04 جرام Serva الأزرق |
| مم 15 مكررا-تريس | 200 مل من المخزن المؤقت الكاثود | |
| تريسيني 50 مم | ||
| dH2س | ||
| درجة الحموضة 7.0 | ||
| المخزن المؤقت اﻷنود | 50 مم مكررا-تريس | ز 20.93 |
| dH2س | إضافة dH2س إلى 2000 مل | |
| درجة الحموضة 7.0 | ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0 | |
| المخزن المؤقت المتقدرية | 1.75 حمض أمينوكابرويك م | 0.5 مل 3 س جل المخزن المؤقت |
| 75 مم مكررا-تريس | 0.5 مل حمض أمينوكابرويك م 2 | |
| 2 مم يدتا | 4 ميليلتر من 500 مم يدتا | |
| dH2س | - | |
| درجة الحموضة 7.0 | - | |
| المخزن المؤقت للعينة | حمض أمينوكابرويك 750 مم | 0.94 مل حمض أمينوكابرويك م 2 |
| الزرقاء كوماسي 5% G | ز 0.125 غ Serva الأزرق | |
| dH2س | إضافة س dH2إلى 2.5 مل | |
| حمض أمينوكابرويك م 2 | حمض أمينوكابرويك م 2 | ز 2.62 حمض أمينوكابرويك |
| dH2س | إضافة dH2س إلى 10 مل |
الجدول 1. المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة لصفحة الجبهة الوطنية.
| المواد الهلامية الأصلية الزرقاء | فصل 6% هلام | فصل 15% هلام | التراص هلام 4% |
| 3 x جل المخزن المؤقت | 3.3 مل | 3.3 مل | مل 1.64 |
| 37.5:1 الاكريلاميد/مكررا 40% | 1.5 مل | مل 3.75 | 0.5 مل |
| dH2س | مل 5.14 | مل 0.93 | مل 2.77 |
| الجلسرين | 0 | 2 مل | 0 |
| فوق كبريتات الأمونيوم 10% * | 60 ميليلتر | 10 ميليلتر | 60 ميليلتر |
| تيميد | 4 ميليلتر | 2 ميليلتر | ميليلتر 6 |
| الحجم الإجمالي | 10 مل | 10 مل | 5 مل |
| * جعل طازجة دائماً فوق كبريتات الأمونيوم 10% في dH2س | |||
الجدول 2. وصفات لجل لصفحة الجبهة الوطنية.
التكميلية الرقم 1-صورة uncropped لطخة غربية الشكل 1B. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
Discussion
واحدة من أهم أجزاء من البروتوكول هو الحفاظ على مجمعات أوكسفوس سليمة أثناء إعداد عينة، التخزين وهلام التفريد. وهكذا، ينبغي أن الميتوكوندريا المعزولة في + 4 درجة مئوية والعينات يجب أن لا تخضع لدورات تجميد أذاب. يمكن أن تتسامح مجمعات أوكسفوس سوى دورة واحدة من دورات تجميد أذاب أثناء الإجراء بأكمله. عدة دورات تجميد أذاب تدمير مجمعات أوكسفوس (الشكل 1B). وينبغي إعداد التحكم والعينات التجريبية التي يمكن مقارنتها بالتوازي لتجنب أي خلافات في ظروف التخزين، والتي قد تعطي نتائج مضللة. إذا كان من غير الممكن القيام بجميع الخطوات للبروتوكول بالتوازي مع جميع العينات، نوصي بتجميد الكريات خلية غسلها في-80 درجة مئوية (الخطوة 1، 4 في هذا البروتوكول)، وبعد القيام ببقية البروتوكول لجميع العينات معا على الأقل حتى انتخابات هلام تروفوريسيس. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لنظافة جهاز التفريد (الدبابات، كاسيت). إذا تم استخدام نفس الجهاز للحزب الديمقراطي الصربي صفحة، تغسل جيدا قبل BN-الصفحة. يمكن أن يسبب أي المخزونات المتبقية الانفصال المجمعات أوكسفوس أثناء التفريد.
المواد الهلامية المتدرجة عالية الجودة جزء أساسي آخر من البروتوكول. المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة للصفحة الأصلية الزرقاء متوفرة تجارياً؛ ومع ذلك، لا ينصح للاستفادة منها، ونظرا للمخازن المؤقتة المستخدمة للمواد الهلامية التجارية قد يكون تكوين، الذي يختلف عن نموذج المخازن المؤقتة. تدرج جل المستخدمة هنا (6-15 ٪) الأمثل للفصل بين الفردية أوكسفوس المجمعات. للكشف عن هياكل supramolecular مرتبة أعلى من أوكسفوس، سلسلة التنفس المعروف أيضا سوبيركومبليكسيس14، هو بعض التحسين المطلوب11.
لتصور أوكسفوس المجمعات استخدام أجسام مضادة محددة التتابع، استناداً إلى خصائصها. على سبيل المثال، استخدم أولاً جسم يعطي إشارة أضعف والجسم مع أقوى إشارة آخر. وهذا أمر مهم حيث تعرية يضعف في الكشف عن (الشكل 1). يمكن أن يحقق تكوين مجمعات سلسلة التنفس إذا بعد BN-صفحة تعرض الهلام للبعد الثاني الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة15.
البروتوكول هو موضح هنا تشير إلى استخدام الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية تسلسلياً. ومع ذلك، يمكن استخدامها جسم أوكسفوس المتاحة تجارياً كوكتيل للكشف عن جميع مجمعات أوكسفوس خمسة في وقت واحد. ومع ذلك، لتكون قادرة على كشف مجمع بشكل كامل أوكسفوس المجمعات وتحديد هويتهم، الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية ينبغي أن تستخدم تسلسلياً. هذه الخطوة مضيعة للوقت؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون ضرورية لاختبار شروط تجريبية جديدة ونماذج.
ينبغي أن يكون الأمثل تركيز ديجيتونين المستخدمة لعزل المتقدرية لنوع الخلية المحددة. كمطهر، بيرميبيليزيس ديجيتونين أغشية الخلية. كفاءة بيرميبيليزيس تركيز الأمثل ديجيتونين غشاء البلازما الخلايا المساس باغشية الميتوكوندريا. تركيز منخفض جداً من ديجيتونين يسبب التلوث عالية مقتطفات mitochondrial بينما التركيز العالي جداً الأضرار أغشية الميتوكوندريا ويقلل من إجمالي العائد المتقدرية. نسبة الأمثل ديجيتونين/البروتين (g/g) يختلف من 0.3 إلى 1. يمكن استخدام تحليل لطخة غربية للبروتينات المستخرجة من الكريات وسوبيرناتانتس لاختبار تركيز الأمثل ديجيتونين16.
هذا البروتوكول لا يشمل البروتين تحميل عنصر التحكم في إيمونوبلوت؛ ولذلك، تركيز البروتين المستخرج من المجمعات يجب بعناية تقاس على الأقل في تريبليكاتيس لضمان تحميل متساوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تشغيل العينات في صفحة الجبهة الوطنية في replicates. وإذا كانت الجمعية انتقائية أوكسفوس مجمعات البصر، يمكن أن تكون مجمعات لا تتأثر تحميل عناصر التحكم.
تحدي تقدير الكتلة الجزيئية للبروتين المجمعات في الجبهة الوطنية-الصفحة18. ولا يشمل البروتوكول الحالي علامة الوزن الجزيئي؛ ولذلك، لتقدير الجمعية لمجمعات أوكسفوس، عينات التحكم تحتوي على مجمعات لا تتأثر ينبغي دائماً إدراج في التحليل. عادة ما تكون عينات مراقبة BN-صفحة الخلايا غير المعالجة أو البرية من نوع.
الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل للكشف عن سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات؛ ومع ذلك، يمكن تطبيقها لتقييم أوليجوميريزيشن للبروتينات المتقدرية19أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة معدل الجمعية مجمعات أوكسفوس بأول المستنفدة لطبقة فرعية المتقدرية ترميز المجمعات التي تحتوي على الكلورامفينيكول وثم بعد شفائهم بعد إزالة الكلورامفينيكول10. وهكذا، يمكن استخدام BN-صفحة لتقييم مستويات مستقرة وجمعية أوكسفوس لمختلف التطبيقات بما في ذلك التشخيص الجزيئي لاضطرابات المتقدرية البشرية9،11.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
مكتبة جامعة هلسنكي هو عن شكره للدعم المالي في مجال النشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T. The role of mitochondria in aging. The Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3662-3670 (2018).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y. ARF in the mitochondria: the last frontier? Cell Cycle (Georgetown, Tex). 7 (23), 3641-3646 (2008).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
