Summary
פרוטוקול זה מדגים הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג'ל. כאן מתוארת השיטה להחיל בתרבית תאים אנושיים.
Abstract
נשימה מיטוכונדריאלי מתבצע על ידי זרחון חמצוני (OXPHOS) מתחמי בתוך המיטוכונדריה. גורמים פנימיים וסביבתיים יכול perturb את מכלול והיציבות של מתחמי OXPHOS. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) ביישום בתרבית תאים אנושיים. ראשית, המיטוכונדריה מופקים מן התאים באמצעות digitonin, ולאחר מכן באמצעות לאוריל maltoside, מתחמי OXPHOS שלמים הם בודדו אותנו מהמתרחש הממברנות מיטוכונדריאלי. מתחמי OXPHOS ואז נפתרות על ידי אלקטרופורזה בג'ל הדרגתיות בנוכחות לצבוע טעונים שלילית, Coomassie כחול, אשר מונעת צבירת חלבון ומבטיחה ניידות electrophoretic של חלבון מתחמי לכיוון הקתודה. בסופו של דבר, מתחמי OXPHOS מזוהים לפי תקן immunoblotting. לפיכך, בסון-דף היא שיטה נוחה וזולה יכול לשמש כדי להעריך את מכלול של כל מתחמי OXPHOS, בניגוד בסיסי מרחביות-הדף המאפשר לימוד רק בודדים OXPHOS מורכבים subunits.
Introduction
המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles משחקת תפקיד חשוב בייצור אנרגיה, ויסות חילוף החומרים הסלולר, איתות, אפופטוזיס, הזדקנות,2,'1,וכו '3. ייצור האנרגיה בתוך המיטוכונדריה מסתמך על הפונקציה זרחון חמצוני זוגות נשימה עם סינתזת ATP. בתאי האדם, מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) מורכב חמישה מתחמי. מתחמי I-IV ליצור מעבר פרוטון אלקטרוכימי של החלל intermembrane מיטוכונדריאלי המשמש V מורכבים כדי לייצר ATP. כל OXPHOS מורכבים multimeric, למעט השני מורכב, המורכב subunits מקודד על ידי גרעיני והן מיטוכונדריאלי הגנים. פגמים במרכיבי הליבה של מתחמי OXPHOS נגרמת על ידי מוטציות או עקה יכול perturb את ההרכבה ואת הפונקציונליות של המערכת זרחון חמצוני. בנוסף, הרכבה נכונה של קומפלקסים OXPHOS תפקודית דורש מספר רב של מכלול גורמים4,5,6.
כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) היא טכניקה בסיסי המאפשר ניתוח של מתחמי חלבון שלם והוא יכול לשמש כדי ללמוד את מכלול של מתחמי OXPHOS. ראשית, המיטוכונדריה מבודדים את התאים על-ידי digitonin, שזה חומר ניקוי עדין זה permeabilizes קרום פלזמה של התאים. לאחר מכן, באמצעות לאוריל maltoside, מתחמי OXPHOS משתחררים מן מיטוכונדריאלי בקרום. על ידי שימוש בג'ל הדרגתי, מתחמי OXPHOS מופרדים לפי המסה שלהם. Coomassie כחול G-250 (לא R-250) נוספו למאגר דגימה, המאגר קטודית כחול dissociates אגודות דטרגנט-יציב אבל שומרת על שרשרת הנשימה בודדים קומפלקסים שלמים8. במהלך אלקטרופורזה, המאגר קטודית כחול המכיל צבע מוחלף על-ידי המאגר קטודית ללא צבע, אשר מבטיח העברה יעילה של מתחמי OXPHOS קרום PVDF8. כדי להמחיש OXPHOS תסביכים, קרום PVDF מודגרת ברצף עם נוגדנים המתאימים subunits הנבחר של מתחמי OXPHOS חמש.
ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן עם כמה שיפורים לתאים בתרבית. בנוסף, שיטה זו יכול לשמש לניתוח של מתחמי OXPHOS המיטוכונדריה מבודד דגימות רקמה9. בסון-דף דורש לפחות 5-10 µg של המיטוכונדריה עבור כל דגימה לכל הפעלה. באמצעות השיטה המתוארת כאן, 500,000 תרבותי תאים כגון HEK293, SH-SY5Y או 143B תאים המסוגלים להניב כ 10 µg של המיטוכונדריה. עם זאת, כמות מספקת של התאים לניתוח בסון תלוי בסוג תא ספציפי.
השיטה הנפוצה ביותר ללמוד חלבונים OXPHOS מיטוכונדריאלי הוא מרחביות-דף סופג המערבי. עם זאת, למען חברה דמוקרטית-דף מאפשר ללמוד רק בודדים subunits OXPHOS, בניגוד בסון-דף, לא ניתן להשתמש כדי להעריך את מכלול של כל מתחמי OXPHOS. יליד ברורה-דף מפריד חלבון מתחמי בתנאים מקורי ללא הנוכחות של צבע טעונים שלילית, יש ברזולוציה נמוכה יותר באופן משמעותי בהשוואה בסון-דף. עם זאת, ברור מקורי-דף הוא מתון יותר מאשר בסון-דף כך שיוכל לשמור יציב מכלולים סופרא מולקולרית של מתחמי חלבון כגון supercomplexes OXPHOS כי הם חלופה מועדפת תחת תנאים בסון-דף10. פרוטוקול זה, הג'ל מעבר צבע משמש כדי להפריד בין מתחמי; אולם, לחלופין, הפרדת צבע שאינו יכול לשמש אם הבורא הדרגתיות יקרה יחסית אינה זמינה11.
חשוב, השיטה המתוארת כאן המאפשר לנתח את מכלול של מתחמי OXPHOS, בעוד הפונקציונליות של מתחמי לא מוערך. ברזולוציה גבוהה בסון-עמוד ולאחריו פעילות בג'ל assay11 , כמו גם פעילות אנזימטי spectrophotometric assay מתחמי מיטוכונדריאלי12 הם יעילים טכניקות לניתוח פונקציונלי של מתחמי OXPHOS. עם זאת, שתי השיטות הללו לא assay ההרכבה של קומפלקסים OXPHOS.
לפיכך, בסון-דף היא השיטה האופטימלית כדי לחקור את מכלול של מתחמי OXPHOS בודדים. לדוגמה, כמה הפרעות מיטוכונדריות, כגון לבר תורשתי אופטיים נוירופתיה (LHON), אנצפלופתיה מיטוכונדריאלי עם חמצת לקטית, מיטוכונדרית (מילס), קשורים עם הרכבה מסולף של רכיב אחד או יותר של OXPHOS מערכת5. באמצעות השיטה בסון-דף המתוארת כאן, המנגנונים המולקולריים של מחלות מיטוכונדריאלי יכול להילמד.
Protocol
spaNOTE: פרוטוקול זה המבוסס על פרסום המשויכת על-ידי Hilander et al.13 .
1. הכנת מאגרי ופתרונות
הערה: כל מאגרי ואת פתרונות שימוש בפרוטוקול מסוכמים בטבלה1. אמצעי האחסון הנתון של מאגרי מספיקים להכין ולהפעיל 10 דוגמאות. ניתן לאחסן כל המאגרים ב +4 ° C עד שנה אחת.
- להכין 20 מ של 3 x מאגר ג'ל המכיל חומצת אמינו קפרון 1.5 M, 150 מ מ Bis-טריס במים מזוקקים (dH2O). להתאים את ה-pH אל 7.0.
- הכינו 10 מ"ל של 2 מ' חומצת אמינו קפרון dH2O.
- להכין 1 מ"ל של המאגר מיטוכונדריאלי על-ידי שילוב הבאות: 0.5 מ של 3 x מאגר ג'ל, 0.5 mL של חומצת אמינו קפרון 2 מ' ו- 4 µL של 500 מ מ EDTA.
- להכין 1,000 מיליליטר קטודית מאגר המכיל 15 מ מ של Bis-טריס ו-50 מ"מ של tricine dH2O. התאם pH אל 7.0.
- להכין 200 מ ל מאגר קטודית כחול על-ידי הוספת 0.04 גר' Coomassie כחול G-250 200 מ ל מאגר הקתודה.
- להכין 1,000 מיליליטר אנודת מאגר המכיל 50 מ"מ Bis-טריס dH2O. התאם pH אל 7.0.
- להכין 2.5 מ של דגימה מאגר המכיל חומצת אמינו קפרון 750 מ"מ וכחול Coomassie 5% G-250 ב dH2O.
2. הכנת lysates מיטוכונדריאלי
- צלחת התאים יום לפני איסוף. עבור תאים HEK293 או 143B, של שימוש Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם סרום שור עוברית 10%, 1%-גלוטמין, 100 מ"ג/מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל. לצמוח התאים חממה התרבות התא ב +37 ° C באווירה 5% CO2 humidified. ודא כי ישנם ביום של אוסף תאים לפחות 500,000 עבור כל דגימה.
- יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת עם PBS קר כקרח. הימנע ניתוק התאים מהצלחת. לגרד את התאים ואת הצניפה אותם ב 800 x גר' 10 דקות ב +4 º C.
- לשטוף את צניפה תא פעמיים עם PBS קר כקרח, צנטריפוגה כמו שלב 2.2. מודדים את ריכוז חלבון באמצעות שיטת ברדפורד באמצעות ערכת מסחרי. גלולה התאים ב x 800 גר' 10 דקות ב +4 º C.
הערה: לאחר אוסף תאים, לבצע את כל השלבים ב +4 ° C, לא מערבולת. - להכין 20 מ של PBS עם מעכב פרוטאז על-ידי הוספת µL 200 של מעכב פרוטאז x 100 מ ל 20 ל- PBS. לשמור על הקרח. Resuspend התאים PBS עם מעכב פרוטאז ריכוז החלבון הסופי של 5 מ"ג/מ"ל.
- כדי לחשב את עוצמת הקול של PBS עם מעכב פרוטאז צריך resuspend את התאים ב- 5 מ"ג/מ"ל, לחשב את כמות חלבון בכל מדגם. לחישוב זה, השתמש ריכוז חלבון נמדד שלב 2.3 והנפח של PBS נהגה resuspend התאים לאחר כביסה בשלב 2.3.
- להכין 1 מ"ל של digitonin 3.3 מ מ ב- PBS עם מעכב פרוטאז. להוסיף 3.3 מ מ digitonin ריכוז סופי של 1.65 מ מ. מערבבים היטב, דגירה על קרח למשך 5 דקות.
- כדי להכין 1 מ"ל של digitonin 3.3 מ מ ב- PBS עם מעכב פרוטאז, להמיס 4 מ ג של digitonin ב 1 מ"ל של PBS ב 100 מעלות צלזיוס עד התמיסה לא גלויים ולא מגניב על הקרח מיד. להוסיף 10 µL של מעכב פרוטאז x 100 מ של פתרון digitonin.
הערה: השתמש רק פתרון טריים של digitonin.
התראה: Digitonin הוא רעיל! השתמש מסיכת פנים, כפפות, מעיל המעבדה.
- כדי להכין 1 מ"ל של digitonin 3.3 מ מ ב- PBS עם מעכב פרוטאז, להמיס 4 מ ג של digitonin ב 1 מ"ל של PBS ב 100 מעלות צלזיוס עד התמיסה לא גלויים ולא מגניב על הקרח מיד. להוסיף 10 µL של מעכב פרוטאז x 100 מ של פתרון digitonin.
- להוסיף PBS עם מעכבי proteinase (להכין בשלב 2.4) הנפח הסופי של 1.5 mL. צנטריפוגה ב 10,000 x g 10 דקות ב + 4 ° C. הסר את תגובת שיקוע. בשלב זה, המיטוכונדריה הם מגורען.
- Resuspend בגדר מיטוכונדריאלי במאגר מיטוכונדריאלי. אמצעי האחסון של מאגר מיטוכונדריאלי נמצא חצי נפח של PBS בשלב 2.4.
- להכין טרי maltoside לאוריל 10% ב- PBS המכיל מעכבי פרוטאז (להכין בשלב 2.4). 1 מ"ל מספיקה עבור 10 דגימות. להוסיף 10% לאוריל maltoside הריכוז הסופי של 1%. דגירה על קרח למשך 15 דקות (שלב זה יכול להיות זמן רב יותר עד כמה שעות).
- צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 20 דקות ב + 4 ° C. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינור חדש. מודדים את ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד באמצעות ערכת. להוסיף דוגמת המאגר, אמצעי אחסון הוא חצי נפח של maltoside לאוריל בשימוש בשלב 2.8. דוגמאות ניתן לאחסן ב- 80 ° C עד 6 חודשים.
3. הכנה של ג'ל הדרגתיות בסון-דף
- יוצקים את הג'ל הדרגתיות בסון-לעמוד בטמפרטורת החדר. במקום הבורא מעבר צבע על צלחת מערבבים וחבר אותו עם צנור גמיש משאבת סחרור. צרף עירוי מוגדר עם המחט הצנרת. המקום פגים החדרה הפרוקסימלית של הבורא הדרגתיות. לשטוף את הצנרור עם dH2O במהירות המרבית משאבת למשך 10 דקות.
- רוקן את הצנרור ומכונת צבע. השתמש pipet כדי להסיר את כל שאריות dH2O בערוץ בין לשכות הבורא הדרגתיות. לסגור את ערוץ ואת צינורות עם השסתום.
- באמצעות מסגרת הליהוק, תופסנים, להרכיב שתי צלחות זכוכית בעל, אשר יש חור בתחתית, ומניחים אותו על דוכן העדים. ודא כי זה פחות או יותר על משטח ישר עם מאזן מים. המקום המחט מחוברת הצנרת בין הזכוכיות.
- להכין 6% 15% ג'ל ופתרונות (טבלה 2). לשמור על הקרח. הוספת אמוניום persulphate (APS) ו- tetramethylenediamine (TEMED) (הם מתחילים הפילמור) האחרון. מערבבים בעדינות כדי להימנע מביצוע אוויר בועות.
- לטעון סוף תא אבובים הדרגתי-ג'ל-מיקסר עם 6% ג'ל הפרוקסימלית ואת הקצה הדיסטלי עם 15% ג'ל. הנפח הכולל של הג'ל צריך להיות שווה לנפח של הג'ל הפרדת בין הזכוכיות. לכן, השתמש 2.6 מ של 6% ג'ל ו- mL 2.1 של 15% ג'ל למסיבה ג'ל הדרגתיות עבור אחד 8.3 ס מ x 7.3 ס מ בגודל ג'ל.
- . הפעילי את פגים, לפתוח את צינורות ואת ערוץ בין לשכות הבורא הדרגתיות. החלף מיד את משאבת סחרור ל מ ל לדקה מילוי הזכוכיות, ולא מאפשרים בועות להזין את הג'ל. הסר את המחט כאשר אין ג'ל הצנרת.
- כיסוי בעדינות את הג'ל עם dH2O. לשמור הג'ל בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה עבור הפילמור.
- מיד לאחר מזיגת הג'ל, לשטוף את הצנרת על ידי מילוי מעבר צבע התאים עם dH2O באמצעות משאבת סחרור במהירות מירבית. בעת הכנת ג'ל שני ויותר, תמיד מנקה את המערכת בין.
- הכנת מאגר ג'ל x 1 על ידי ערבוב 3 מ"ל של 3 x ג'ל מאגר ולהוסיף 6 מ של dH2O. הסר dH2O מפני השטח של הג'ל עם נייר סינון בעדינות. לשטוף את פני השטח של הג'ל עם 1 x מאגר ג'ל. הסר 1 x מאגר ג'ל עם נייר סינון בעדינות.
- הימנע סיבי נייר הסינון על הג'ל. כדי להבטיח זאת, לחתוך את הנייר לחתיכות קטנות עם מספריים, אך לא קורע את הנייר.
- מקם את המסרק בין הזכוכיות, אך אין לטבול את המכשיר באופן מלא כדי שתוכל לשפוך את הג'ל הערימה תחת המסרק. להכין ארבעה אחוזים לערום ג'ל (טבלה 2). הוסף APS TEMED אחרונה כשהם מתחילים הפילמור בקלות. מערבבים בעדינות הימנעות בועות אוויר.
- כיסוי הג'ל הערמה, הימנעות בועות תחת המסרק, לטבול את המסרק מלא. תן הג'ל הערימה פולימריזציה במשך לפחות 30 דקות להסיר את המסרק ולשטוף את הבארות עם 1 x מאגר ג'ל באמצעות pipet.
- לאחר הפילמור, ניתן לאחסן את הג'ל ב +4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. כדי לאחסן את הג'ל, עטפי את הג'ל בנייר ספוגה dH2O ופלסטיק הסרט כדי למנוע התייבשות של הג'ל.
4. כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל
הערה: כדי למנוע השפלה של OXPHOS מתחמי הפעל אלקטרופורזה ב +4 º C. השתמש מאגרי מראש צוננת.
- לטעון את הקלטת ג'ל עם המאגר קטודית כחול עד לתחתית הבארות. טעינה של הדגימות קל כאשר בקלטת הוא לא מלא עד למעלה. לשטוף את הבארות עם המאגר קטודית כחול ולמלא ואז הבארות המאגר קטודית כחול באמצעות pipet.
- לטעון את הדגימות (5-30 µg של חלבון) לתוך בארות. בעדינות למלא את הקלטת ג'ל לפסגה עם המאגר קטודית כחול, הטנק באמצעות מאגר אנודת.
- הפעל את ג'ל למשך 15 דקות על מתח קבוע של 40 V. אז תגביר את המתח ל-80 V (או להשתמש זרם קבוע של 6 מא), לא יעלה על 10 תואר שני. הפעל את הג'ל עד 2/3 של אורך ג'ל מגיע לצבוע.
- להחליף את המאגר קטודית כחול עם קטודה מאגר ולהמשיך אלקטרופורזה עד לחזית לצבוע אזל. בסך הכל, אלקטרופורזה אורכת כ-3 שעות.
- אחזר את צלחות זכוכית ולהעביר את החלבונים קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene על ידי חצי יבש סופג. השתמש מתח קבוע של 25 V וזרם מוגבל ל- 1.0 A למשך 30 דקות.
- לחלופין, השתמש סופג רטוב כדי להעביר את מתחמי OXPHOS קרום PVDF.
- להמשיך עם חסימה של הממברנה, נוגדן הדגירה לפי הפרוטוקול הסטנדרטי immunoblotting. השתמש העיקרי נוגדנים נגד subunits של מתחמי OXPHOS ברצף.
הערה: לדוגמה, השתמש נוגדן anti-NDUFA9 (1:2000) עבור מתחם אני, נוגדן anti-SDHA (1:2000) עבור השני מורכבים, נוגדן anti-UQCRC2 (1:1000) עבור השלישי מורכב, נוגדן anti-COX1 (1:2000) עבור מתחם הרביעי ו anti-ATP5A נוגדנים (1:2000) עבור V מורכבים. הרשימה של הנוגדנים מוצגת טבלה של חומרים.
Representative Results
באמצעות דף בסון, פגמים ההרכבה של קומפלקסים OXPHOS מיטוכונדריאלי יכול ייחקרו. איור 1A מציג ההרכבה של קומפלקסי שרשרת הנשימה בתאים אנושיים נוירובלסטומה (SH-SY5Y) שטופלו כלורמפניקול, אשר במפורש מעכב תרגום של מקודד mtDNA subunits OXPHOS. כלורמפניקול מרוקן את מתחמי OXPHOS שהכילו מקודד mitochondrially subunits (מתחם הראשון, השלישי, הרביעי; איור 1A), בעוד השנייה מורכבת, אשר מקודד באופן בלעדי על ידי הגנים גרעינית, היה compensatorily upregulated. מתחם V היה לא immunoblotted כאן.
מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה להשמיד את מתחמי OXPHOS. איור 1B מדגים ההשפלה של מתחמי OXPHOS על ידי מחזורי ההקפאה-הפשרה. מתחמי הנשימה מיטוכונדריאלי מדגם 3 שעברו מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה יש בעוצמה נמוכה יותר של הלהקה, יוזזו לעומת הדגימות באותו, אשר היו קפואים פעם אחת בלבד. תמונה uncropped תספיג של איור 1B מוצג Supplementary באיור 1.
האיכות של הג'ל חשוב עבור להקות חדה וברורה. איור 1 C מראה של immunoblot של ג ' ל פולימריזציה לא טוב. חסינותו של הקרום גם יכול להשפיע על הגילוי של קומפלקסים OXPHOS. איור 1 י, מורכבים אני זוהה לפני או אחרי ששללו. האות לרעש יחס הוא נמוך בהרבה אחרי ששללו.
איור 1-בסון-דף immunoblots של ניסויים תת אופטימלית ומצליח. מתחמי דלדול של OXPHOS (א) על ידי מעכב מיטוכונדריאלי התרגום. תאים אנושיים נוירובלסטומה (SH-SY5Y) טופלו כלורמפניקול (CAP) למשך 48 שעות. CTRL, תאים שליטה ללא טיפול כלורמפניקול. החלונית התחתונה מציגה את כימות של immunoblot. הערך של הפקד נלקח כ- 1 (מוצג כקו מקווקו). הנתונים מוצגים אומר ± SD, n = 3, * P אינטראקצית < 0.0001 לעומת שליטה באמצעות בדיקות t של סטודנט. (B) שיבוש OXPHOS תסביכים באמצעות הקפאת מרובים-הפשרה מחזורים. דוגמאות 1-3 הוכנו מתאי אוסטאוסרקומה אנושי (143B) באותם התנאים. דוגמאות מספר 1 ו- 2 היו קפואים, נמס פעם אחת בלבד, בעוד המספר לדוגמה 3 עברו ארבעה מחזורים ההקפאה-הפשרה. (ג) immunoblots בסון-דף של מתחמי OXPHOS מבודדים מתאי HEK293. מורחת על להקות נגרמת על ידי איכות נמוכה של הג'ל. (ד) השפעת להפשיט את זיהוי של מתחמי OXPHOS. זיהוי של קומפלקס אני בתאים אנושיים נוירובלסטומה (SH-SY5Y) לפני ואחרי חסינותו של קרום זהה. OXPHOS מתחמי אותרו באמצעות נוגדן anti-NDUFA9 (מורכב. אני), נוגדן anti-SDHA (קומפלקס II), נוגדן anti-UQCRC2 (מתחם III) ונוגדן anti-COX1 (IV מורכבים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאגר או פתרון | קומפוזיציה | מתכון |
| 3 x מאגר ג'ל | 1.5 חומצת אמינו קפרון מ | 3.94 גר' חומצת אמינו קפרון |
| 150 מ מ Bis-טריס | 0.63 g של Bis-טריס | |
| dH2O | להוסיף dH2O 20 מ | |
| pH 7.0 | להתאים את ה-pH אל 7.0 | |
| מאגר קטודה | 15 מ מ Bis-טריס | 3.14 אינצ גר' Bis-טריס |
| tricine 50 מ מ | 8.96 גר' tricine | |
| dH2O | להוסיף dH2O 1000 מ | |
| pH 7.0 | להתאים את ה-pH אל 7.0 | |
| מאגר קטודית כחול | coomassie 0.02% כחול G | 0.04 גרם של G Serva כחול |
| 15 מ מ Bis-טריס | 200 מ ל מאגר קטודה | |
| tricine 50 מ מ | ||
| dH2O | ||
| pH 7.0 | ||
| אנודת מאגר | 50 מ מ Bis-טריס | 20.93 g |
| dH2O | להוסיף dH2O 2000 מ | |
| pH 7.0 | להתאים את ה-pH אל 7.0 | |
| מאגר מיטוכונדריאלי | 1.75 חומצת אמינו קפרון מ' | 0.5 מ של 3 x מאגר ג'ל |
| 75 מ מ Bis-טריס | 0.5 מ של חומצת אמינו קפרון 2 מ' | |
| 2 מ מ EDTA | 4 µL של 500 מ מ EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7.0 | - | |
| מאגר דוגמאות | חומצת אמינו קפרון 750 מ"מ | mL 0.94 של חומצת אמינו קפרון 2 מ' |
| comassie 5% כחול G | g 0.125 של G Serva כחול | |
| dH2O | להוסיף dH2O 2.5 מ | |
| חומצת אמינו קפרון 2 מ' | חומצת אמינו קפרון 2 מ' | 2.62 גר' חומצת אמינו קפרון |
| dH2O | להוסיף 10 מ ל dH2O |
טבלה 1. מאגרי ופתרונות המשמש בסון-דף.
| ג'לים מקורי כחול | הפרדת 6% ג'ל | הפרדת 15% ג'ל | ג'ל 4% הערימה |
| 3 x מאגר ג'ל | 3.3 מ | 3.3 מ | 1.64 mL |
| 40% אקרילאמיד/Bis 37.5:1 | 1.5 mL | 3.75 מ | 0.5 mL |
| dH2O | 5.14 mL | 0.93 mL | 2.77 mL |
| גליצרול | 0 | 2 מ | 0 |
| 10% אמוניום persulfate * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| הנפח הכולל | 10 מ | 10 מ | 5 מ |
| להפוך תמיד טריים קירור 10% ב- dH2O | |||
בטבלה 2. מתכונים של ג'ל בסון-דף.
משלים איור 1. תספיג uncropped התמונה של איור 1B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
Discussion
אחד החלקים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול היא לשמר את שלמות מכלולי OXPHOS במהלך הכנת הדוגמא, אחסון ג'ל אלקטרופורזה. לפיכך, המיטוכונדריה הנשאים ב +4 ° C, הדגימות לא צריך לעבור מחזורים ההקפאה-הפשרה. OXPHOS מתחמי יכול לסבול רק מחזור אחד הפשרת ההקפאה במהלך כל התהליך. מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה להשמיד את מתחמי OXPHOS (איור 1B). שליטה ודוגמאות ניסיוני כי הם להיות מושווה כדאי להיערך במקביל כדי למנוע כל ההבדלים בתנאי אחסון, אשר עשוי לתת תוצאות מטעות. אם זה לא אפשרי לבצע את כל השלבים של הפרוטוקול במקביל עם כל הדגימות, מומלץ להקפיא תא שטף כדורי ב-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.4 ב פרוטוקול זה) ולבצע לאחר מכן שאר הפרוטוקול עבור כל הדגימות ביחד לפחות עד gel רצועות, זרוע צולבות trophoresis. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם את ניקיון המנגנון אלקטרופורזה (טנק, קלטות). אם המנגנון זהה עבור מרחביות-דף, לשטוף אותו היטב לפני בסון-דף. כל מרחביות שיורית יכול לגרום דיסוציאציה של מתחמי OXPHOS במהלך אלקטרופורזה.
ג'לים מעבר צבע באיכות גבוהה הם חלק קריטי נוסף של הפרוטוקול. ג'לים precast עבור דף מקורי כחול הם זמינים מסחרית; עם זאת, לא מומלץ להשתמש בהם, מאז המאגרים המשמש ג'לים מסחרי יכול להיות בהרכב, אשר שונה מן המאגרים הדגימה. מעבר הצבע של הג'ל המשמש כאן (6-15%) הוא אופטימלי ההפרדה של מתחמי OXPHOS בודדים. כדי לזהות מבנים סופרא מולקולרית מסדר גבוה של OXPHOS, שרשרת הנשימה הידוע גם supercomplexes14, קצת אופטימיזציה הוא נדרש11.
החזיית OXPHOS מתחמי לשימוש נוגדנים ספציפיים ברצף, על בסיס המאפיינים שלהם. לדוגמה, השתמש תחילה נוגדן זה נותן את האות החלש ביותר של הנוגדן עם האות החזק ביותר לאחרונה. זה חשוב מאז פירוק מחליש את הזיהוי (איור 1D). ההרכב של קומפלקסי שרשרת הנשימה יכול ייחקרו אם אחרי בסון-עמוד הג'ל הוא נתון את המימד השני מרחביות-עמוד15.
הפרוטוקול המתואר כאן מרמז באמצעות נוגדנים נגד קומפלקסים OXPHOS בודדים ברצף. עם זאת, הנוגדן OXPHOS זמינים מסחרית קוקטייל יכול לשמש כדי לזהות כל מכלולי OXPHOS חמש בו זמנית. ובכל זאת, כדי שתוכל לזהות שהיישום שהורכב קומפלקסים OXPHOS ולהגדיר את זהותם, נוגדנים נגד קומפלקסים OXPHOS בודדים יש להשתמש ברצף. השלב זה זמן רב; עם זאת, זה יכול להיות חיוני לבדיקה תנאים חדשים ניסויית ומודלים.
הריכוז של digitonin המשמש לבידוד מיטוכונדריאלי צריך אופטימיזציה עבור סוג תאים מסוים. כמו חומר ניקוי, digitonin permeabilizes קרום התא. ריכוז אופטימלי של digitonin permeabilizes ביעילות קרום פלזמה של התאים עוזב את הקרומים מיטוכונדריאלי ללא פגע. ריכוז נמוך מדי של digitonin גורם זיהום גבוה של תמציות מיטוכונדריאלי בזמן ריכוז גבוה מדי נזק מיטוכונדריאלי בקרום ומפחית את התשואה מיטוכונדריאלי הכולל. היחס האופטימלי digitonin/חלבון (g/g) משתנה בין 0.3 ל- 1. תספיג חלבון ניתוח של חלבונים מופק כדורי, supernatants יכול לשמש כדי לבדוק את ריכוז אופטימלי digitonin16.
פרוטוקול זה אינו כולל חלבון טעינת פקד immunoblot; לכן, ריכוז חלבון של מתחמי שחולצו יש בקפידה למדוד לפחות triplicates כדי להבטיח הטעינה שווה. בנוסף, ניתן להפעיל את הדגימות בדף-בסון ב משכפל. אם ההרכבה של קומפלקסים OXPHOS סלקטיבי הוא לקוי, מתחמי לא מושפע יכול לשמש טעינת פקדים.
ההערכה של המסה המולקולרית של מתחמי חלבון בסון-בדף הוא מאתגר18. בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל את סמן משקל מולקולרי; לכן, כדי להעריך את מכלול של מתחמי OXPHOS, הדגימות פקד המכיל מתחמי לא מושפע תמיד להיכלל הניתוח. הדגימות הבקרה עבור בסון-דף בדרך כלל אינו מטופל או פראי סוג התאים.
השיטה המוצגת כאן ממוטב עבור הגילוי של קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי; עם זאת, ניתן גם להחיל אותה על ההערכה של oligomerization של חלבונים מיטוכונדריאלי19. בנוסף, שיעור הרכבה של קומפלקסים OXPHOS ניתן יהיה ללמוד על ידי הראשון depleting מיטוכונדריאלי מקודד יחידת משנה המכיל מתחמי כלורמפניקול, ואז בעקבות התאוששות שלהם לאחר הסרת כלורמפניקול10. לפיכך, בסון-דף יכול לשמש כדי להעריך את מצב יציב רמות והרכבה של OXPHOS עבור יישומים שונים כולל אבחון מולקולרי של הפרעות מיטוכונדריות האנושי9,11.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ספריית אוניברסיטת הלסינקי הוא הודה על התמיכה הכלכלית בהוצאה לאור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T. The role of mitochondria in aging. The Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3662-3670 (2018).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y. ARF in the mitochondria: the last frontier? Cell Cycle (Georgetown, Tex). 7 (23), 3641-3646 (2008).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
