Summary
Этот протокол демонстрирует анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной полиакриламидный гель-электрофорез. Здесь описан метод, применяемый для культивируемых клеток человека.
Abstract
Митохондриальное дыхание осуществляется комплексы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в митохондриях. Внутренние и экологические факторы могут повлиять Ассамблеи и стабильность OXPHOS комплексов. Этот протокол описывает Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-страница) в приложении для культивируемых клеток человека. Во-первых митохондрии извлекаются из клетки, с помощью digitonin, а затем с помощью maltoside лаурилсульфат, нетронутыми OXPHOS комплексы изолированы от митохондриальной мембраны. OXPHOS комплексы, затем решаются градиента гель-электрофорез в присутствии отрицательно заряженных краситель, Кумасси синий, который препятствует агрегации белков и гарантирует электрофоретической подвижности белковых комплексов к катоду. Наконец OXPHOS комплексы определяются стандартные immunoblotting. Таким образом BN-страница является удобный и недорогой метод, который может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов, в отличие от основных SDS-PAGE, позволяя исследование только отдельные OXPHOS комплекс субъединиц.
Introduction
Митохондрии являются многофункциональными органеллы, играет важную роль в производстве энергии, регуляции клеточного метаболизма, сигнализаторы, апоптоз, старение,2,1,и т.д.3. Производство энергии в митохондриях полагается на функции окислительного фосфорилирования, пары дыхания с синтез АТФ. В клетках человека митохондриальных Оксидативное фосфорилирование системы (OXPHOS) состоит из пяти комплексов. Комплексы-IV создание электрохимических протонного градиента в пространстве митохондриальных межмембранное, который используется для производства АТФ, комплекс V. Каждый комплекс OXPHOS-multimeric и, за исключением комплекс II, состоящий из субъединиц, кодируется как ядерных, так и митохондриальных генов. Любые дефекты в основные компоненты OXPHOS комплексов, вызванные мутации или экологический стресс может повлиять Ассамблеи и функциональность системы окислительного фосфорилирования. Кроме того надлежащее Ассамблея функциональных комплексов OXPHOS требуется большое количество Ассамблеи факторы4,5,6.
Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является включение анализа нетронутыми белковых комплексов фундаментальных техника и могут быть использованы для изучения Ассамблея OXPHOS комплексов. Во-первых митохондрии изолированы от клеток, digitonin, который является мягким моющим средством, которое permeabilizes плазматической мембраны клеток. Затем используя maltoside лаурилсульфат, OXPHOS комплексы освобождаются от митохондриальной мембраны. С помощью градиента электрофорез, OXPHOS комплексы разделены согласно их массы. Кумасси синий G-250 (не R-250) добавлены в буфер образца и синий катод буфера разъединяет моющее средство лабильного ассоциаций, но сохраняет отдельные дыхательной цепи комплексы нетронутыми8. Во время электрофорез синий катод буфер, содержащий краситель заменяется на катод буфера без красителя, который обеспечивает эффективную передачу OXPHOS комплексов PVDF мембрану8. Чтобы визуализировать OXPHOS комплексов, PVDF мембрану последовательно инкубировали с антителами, соответствующие выбранной подразделений пяти OXPHOS комплексов.
Метод, описанный здесь, с некоторыми изменениями может применяться к любой культивируемых клеток. Кроме того этот метод может использоваться для анализа OXPHOS комплексов в митохондриях, изолированных от образцов ткани9. BN-страница требует по крайней мере 5-10 мкг митохондрий для каждого образца, в перспективе. Используя метод, описанный здесь, 500000 культивируемых клеток, таких как HEK293, SH-SY5Y или 143B клетки могут принести около 10 мкг митохондрий. Однако достаточное количество клеток для анализа млрд зависит от типа конкретные ячейки.
Наиболее распространенным способом для изучения белков митохондриальных OXPHOS, SDS-PAGE и Западный blotting. Однако SDS-PAGE позволяет изучать только отдельные подразделения OXPHOS и, в отличие от БН-страницы, не может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов. Ясно, родной страница отделяет белковых комплексов в родной условий отрицательно заряженных красителя без присутствия и имеет значительно более низкое разрешение по сравнению с БН-страницы. Однако ясно родной страница мягче, чем BN-страницы так, что он может сохранить лабильной супрамолекулярные сборки белковых комплексов, таких как OXPHOS supercomplexes, которые отделены под условия BN-страница10. В этом протоколе градиент гель используется для разделения комплексов; Однако в качестве альтернативы,-градиент разделения может использоваться если относительно дорогих градиента maker является не наличие11.
Важно, в описанный здесь метод позволяет анализировать Ассамблея OXPHOS комплексов, в то время как функциональность комплексов не оценивается. Высоким разрешением BN-страница следуют в гель деятельности пробирного11 , а также пробирного спектрофотометрические ферментативной активности митохондриальных комплексов12 являются эффективные методы для функционального анализа OXPHOS комплексов. Однако оба этих методов не пробирного Ассамблея OXPHOS комплексов.
Таким образом BN-страница является оптимальный метод расследовать Ассамблея отдельных OXPHOS комплексов. Например некоторые митохондриальных расстройств, таких как Лебер наследственной оптической невропатии (LHON), митохондриальных энцефалопатия с молочно-кислый ацидоз и инсульта подобных эпизодов (MELAS), связаны с изменены Ассамблеей одного или более компонентов OXPHOS система5. С помощью BN-страницы метод, описанный здесь, могут быть изучены молекулярных механизмов митохондриальных болезней.
Protocol
spaNOTE: этот протокол основан на связанной публикации Hilander et al.13 .
1. Подготовка буферов и решения
Примечание: Все буферы и решения, используемые в протоколе кратко излагаются в таблице 1. Данного тома буферов достаточно для подготовки и запуска 10 образцов. Все буферы могут храниться при температуре + 4 ° C на срок до одного года.
- Подготовка 20 мл 3 x гель буфер, содержащий 1,5 М Аминокапроновая кислота, 150 мм бис трис в дистиллированной воде (dH2O). Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
- Подготовка 10 мл 2 М Аминокапроновая кислота в dH2O.
- Подготовка 1 мл митохондриальной буфера, объединяя следующие: 0,5 мл 3 x гель буфера, 0,5 мл 2 М Аминокапроновая кислота и 4 мкл 500 мм ЭДТА.
- Подготовка 1000 мл катод буфер, содержащий 15 мм бис-трис и 50 мм Трицин dH2O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
- Подготовка 200 мл синий катод буфера путем добавления 0,04 г G-250 Кумасси синий 200мл катод буфера.
- Подготовка 1000 мл Анодный буфер, содержащий 50 мм бис трис dH2O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
- Подготовить 2,5 мл буфера выборки, содержащий 750 мм Аминокапроновая кислота и 5% Кумасси синим G-250 в dH2O.
2. Подготовка митохондриальной лизатов
- Пластина клетки за день до коллекции. Для HEK293 или 143B клеток использование Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с плода бычьим сывороточным 10%, 1% L-глютамин, 100 мг/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Рост клеток в инкубатор культуры клеток при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные атмосфере. Убедитесь, что есть по крайней мере 500 000 клетки для каждого образца в день сбора.
- Осторожно промойте клетки один раз с ледяной PBS. Избегайте отключения клетки от плиты. Скрип клетки и Пелле их на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C.
- Помыть лепешка клетки дважды с ледяной PBS и центрифуги как в шаге 2.2. Измерьте концентрацию белка с методом Брэдфорд, с использованием коммерческих комплект. Пелле клетки на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C.
Примечание: После сбора клеток, выполните все шаги при + 4 ° C и делать не вихря. - Подготовка 20 мл PBS с ингибитором протеазы, добавив 200 мкл ингибитора протеазы 100 x 20 мл ФСБ. Держите на льду. Ресуспензируйте клетки в PBS с ингибитором протеазы окончательный белка концентрацию 5 мг/мл.
- Чтобы вычислить объем PBS с ингибитором протеазы, необходимых для Ресуспензируйте клетки на 5 мг/мл, Рассчитайте количество белка в каждом образце. Для этого расчета используйте концентрацию протеина измеряется в шаге 2.3 и объем PBS для Ресуспензируйте клетки после стирки на шаге 2.3.
- Готовим 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы. Добавьте digitonin 3,3 мм в конечной концентрации 1,65 мм. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду на 5 мин.
- Подготовить 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы, Растворите 4 мг, digitonin в 1 мл PBS на 100 ° C до тех пор, пока не осадок видимым и прохладный на льду немедленно. Добавьте 10 мкл ингибитора протеазы 100 x 1 мл digitonin раствора.
Примечание: Используйте только свежий раствор digitonin.
Предупреждение: Digitonin токсичных! Используйте маски, перчатки и халате.
- Подготовить 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы, Растворите 4 мг, digitonin в 1 мл PBS на 100 ° C до тех пор, пока не осадок видимым и прохладный на льду немедленно. Добавьте 10 мкл ингибитора протеазы 100 x 1 мл digitonin раствора.
- Добавьте PBS с ингибитора протеиназы (подготовленных на шаге 2.4) окончательный объем 1,5 мл. Центрифуга на 10000 x g 10 мин на + 4 ° C. Удалите супернатант. В этом шаге гранулированных митохондрий.
- Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в митохондриальной буфера. Объем митохондриальной буфера составляет половину объема PBS на шаге 2.4.
- Подготовьте свежие maltoside лаурил 10% в PBS, содержащий ингибитор протеазы (подготовленных на шаге 2.4). 1 мл достаточно для 10 образцов. Добавьте 10% лаурил maltoside в конечной концентрации 1%. Инкубируйте на льду 15 мин (этот шаг может быть дольше, вплоть до нескольких часов).
- Центрифуга на 20000 x g 20 мин на + 4 ° C. Соберите супернатант в новую трубу. Измерьте концентрацию протеина Брадфорд методом с использованием комплекта. Добавьте буфер образца, половина объема лаурил maltoside, используемые на шаге 2.8 тома. Образцы можно хранить при температуре-80 ° C на срок до 6 месяцев.
3. Подготовка градиентного гель BN-страницы
- Залейте градиент гель для БН-страница при комнатной температуре. Место градиента чайник на плите перемешать и подключить его с гибкие шланги перистальтического насоса. Прикрепите инфузионный набор с иглой для труб. Место магнитной мешалкой в проксимальном палаты создатель градиента. Вымойте трубки с dH2O на скорость максимальная насоса за 10 мин.
- Очистите трубку и создатель градиента. Использование пипетки для удаления любых оставшихся dH2O в канале между палатами создатель градиента. Закройте канал и труб с клапаном.
- С помощью литья кадра и зажимы собрать две стеклянные пластины в держатель, который имеет отверстие на дне, и поместите его на стенде. Убедитесь, что это более или менее на прямой поверхности с водного баланса. Место иглы подключен к трубе между пластинами стекла.
- Подготовка решения гелем 6% и 15% (Таблица 2). Держите на льду. Добавить Аммония персульфат (APS) и tetramethylenediamine (TEMED) (они начинают полимеризации) последний. Смесь осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Загрузите проксимальный конец градиента гель смеситель трубки камеры с 6% гель и дистального конца 15% гелем. Общий объем геля должен быть равен объем отделяя гель между пластинами стекла. Таким образом используйте 2,6 мл 6% геля и 2.1 мл 15% гель для градиента гель смеситель для одной 8.3 x 7,3 см размеру геля.
- Перейдите на магнитную мешалку и откройте труб и каналов между палатами создатель градиента. Сразу же включите насос перистальтический до 5 мл/мин заполнить стеклянные пластины и не позволяют пузыри, чтобы ввести гель. Удалите иглу, когда есть не гель в трубке.
- Аккуратно наложение гель с dH2O. держать при комнатной температуре по крайней мере 1 час для полимеризации геля.
- Сразу же после заливки геля, промойте трубы, заполнив градиента камер с dH2O и с использованием перистальтического насоса на максимальной скорости. При подготовке двух и более гели, всегда чистые системы между ними.
- Подготовка 1 x гель буфера путем смешивания 3 мл 3 x гель буфера и добавить 6 мл dH2O. Remove dH2O от поверхности геля с фильтровальную бумагу осторожно. Промойте поверхность геля с 1 x гель буфера. Осторожно извлеките 1 x гель буфер с фильтровальной бумаги.
- Избегайте волокон из фильтровальной бумаги на геле. Для обеспечения этого, разрежьте бумагу на мелкие кусочки с ножницами, но не Оторвите бумагу.
- Поместите гребенку между пластинами стекла, но не погружайте его полностью, чтобы иметь возможность залить штабелируя гель под гребенку. Подготовка 4%, укладка гель (Таблица 2). Добавить APS и TEMED последний как они начинают полимеризации легко. Смесь осторожно избегая пузырьков воздуха.
- Наложение штабелируя гель, избегая пузыри под расческу и полностью погрузите насадку. Пусть штабелируя гель полимеризоваться, по крайней мере 30 минут снимите гребень и Промыть лунки с 1 x гель буфер с помощью пипетки.
- После полимеризации гель может храниться при температуре + 4 ° C на пару дней. Чтобы хранить гель, оберните геля в бумаги, пропитанной с dH2O и пластиковые пленки для предотвращения высыхания геля.
4. синий родной гель-электрофорез
Примечание: Для предотвращения деградации OXPHOS комплексов запустить электрофореза при + 4 ° C. Используйте предварительно охлажденные буферов.
- Загрузите гель кассету с буфером синий катода до нижней части скважины. Загрузка образцов легче, когда кассета заполнена не в верхней. Промыть скважин с голубой катод буфера, а затем заполнить скважин с голубой катод буфер с помощью пипетки.
- Загрузите образцы (5-30 мкг белка) в скважинах. Аккуратно заполните гель кассету в верхней голубой катод буфер и бак с анодном буфере.
- Побегите гель 15 мин при постоянном напряжении 40 V. Затем увеличить напряжение до 80 V (или использовать постоянный ток 6 мА), не превышает 10 мА. Побегите гель до тех пор, пока краска достигает 2/3 длины геля.
- Замените синий катод буфер буфера катода и продолжить электрофореза, до тех пор, пока краска фронт истекло. В общей сложности электрофорез занимает около 3 часов.
- Извлечение стеклянные пластины и передать белки винилидена фторида (PVDF) мембраны полусухим промокательной. Используйте постоянное напряжение 25 вольт и ток ограничивается 1,0 A за 30 мин.
- Кроме того используйте мокрый промокательной передать PVDF мембрану OXPHOS комплексов.
- Продолжите блокирование мембраны и Антитело инкубации согласно стандартным immunoblotting протокол. Использование основного антитела против подразделений OXPHOS комплексов последовательно.
Примечание: К примеру, используйте антитела анти NDUFA9 (1: 2000) для комплекса I, антитела анти SDHA (1: 2000) для сложных II, антитела анти UQCRC2 (1: 1000) для сложных III, антитела (1: 2000) анти-COX1, так для сложных IV и анти ATP5A антитела (1: 2000) для комплекса V. Список антител представлена в Таблице материалов.
Representative Results
BN-странице, могут быть исследованы дефекты в Ассамблее митохондриальной OXPHOS комплексов. Рисунок 1A показывает Ассамблея дыхательной цепи комплексов в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом, который конкретно запрещает преобразование митохондриальной ДНК кодировке OXPHOS подразделений. Хлорамфеникол обедненного OXPHOS комплексов, которые содержали mitochondrially кодировке субблоков (комплекс I, III, IV; Рисунок 1A), в то время как комплекс II, который кодируется исключительно ядерных генов, беспрепятственно был upregulated. Комплекс V был не immunoblotted здесь.
Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов. Рисунок 1B демонстрирует деградации OXPHOS комплексов циклов замораживания оттаивания. Митохондриальной дыхательных комплексов в примере 3, которые подверглись несколько циклов замораживания оттаивания имеют снижение интенсивности группы и сдвинуты по сравнению с же образцы, которые были заморожены только один раз. Невозделываемых иммуноблоттинга изображение Рисунок 1B приводится в дополнительных Рисунок 1.
Качество гель имеет важное значение для четкого и полос. Рисунок 1 C показывает immunoblot от гель, который не сделал хорошо полимеризоваться. Также зачистки мембраны может повлиять на определение OXPHOS комплексов. На рисунке 1 Dсложные я был обнаружен до или после зачистки. Соотношение сигнал-шум намного ниже после зачистки.
Рисунок 1. BN-страница иммуноблотов от успешных и субоптимальных экспериментов. (A) истощение OXPHOS комплексов ингибиторов митохондриальных перевода. Человеческой нейробластомы клетки (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом (CAP) на 48 часов. CTRL, клетки управления без лечения хлорамфеникола. Нижней панели показывает количественная оценка immunoblot. Значение элемента управления берется как 1 (отображается как пунктирная линия). Данные представлены как означает ± SD, n = 3, * P < 0,0001 по сравнению с использованием управления непарные студента t тесты. (B) нарушение OXPHOS комплексы на несколько циклов замораживания оттаивания. Образцы 1-3 были подготовлены от человека остеосаркома клеток (143B) в тех же условиях. Образцы номер 1 и 2 были заморожены и плавится только один раз, в то время как пример №3 прошли четыре циклов замораживания оттаивания. (C) BN-страница иммуноблотов OXPHOS комплексов, изолированный от HEK293 клеток. Смазывание полос обусловлено низкое качество геля. (D) эффект зачистки на обнаружении OXPHOS комплексов. Определение комплекса в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) до и после зачистки же мембраны. OXPHOS комплексы были обнаружены с помощью антител анти NDUFA9 (комплекс я), антитела анти SDHA (комплекс II), антитела анти UQCRC2 (комплекс III) и антитела анти-COX1, так (комплекс IV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Буфер или раствор | Состав | Рецепт |
| 3 x гель буфера | 1.5 Аминокапроновая кислота М | расположена в 3.94 g Аминокапроновая кислота |
| 150 мм бис трис | 0,63 g бис-трис | |
| dH2O | Добавить dH2O 20 мл | |
| pH 7.0 | Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 | |
| Катод буфер | 15 мм бис трис | 3.14 g бис-трис |
| Трицин 50 мм | 8.96 g Трицин | |
| dH2O | Добавить dH2O до 1000 мл | |
| pH 7.0 | Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 | |
| Синий катод буфера | 0,02% Кумасси синий G | 0,04 г Serva синий G |
| 15 мм бис трис | 200 мл буфера катода | |
| Трицин 50 мм | ||
| dH2O | ||
| pH 7.0 | ||
| Анодный буфер | 50 мм бис трис | 20.93 g |
| dH2O | Добавить dH2O до 2000 мл | |
| pH 7.0 | Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 | |
| Митохондриальные буфер | 1,75 Аминокапроновая кислота М | 0,5 мл 3 x гель буфера |
| 75 мм бис трис | 0,5 мл 2 М Аминокапроновая кислота | |
| 2 мм ЭДТА | 4 мкл 500 мм ЭДТА | |
| dH2O | - | |
| pH 7.0 | - | |
| Буфер образца | 750 мм Аминокапроновая кислота | 0.94 мл 2 М Аминокапроновая кислота |
| 5% comassie синий G | 0,125 г Serva синий G | |
| dH2O | Добавить dH2O 2,5 мл | |
| Аминокапроновая кислота 2 М | Аминокапроновая кислота 2 М | 2.62 g Аминокапроновая кислота |
| dH2O | Добавить dH2O 10 мл |
Таблица 1. Буферы и решения, используемые для БН-страницы.
| Синий родной гели | Отделяя гель 6% | Отделяя гель 15% | Штабелируя гель 4% |
| 3 x гель буфера | 3,3 мл | 3,3 мл | 1.64 мл |
| 40% акриламида/Bis 37.5:1 | 1,5 мл | 3,75 мл | 0,5 мл |
| dH2O | 5.14 мл | 0.93 мл | 2.77 мл |
| Глицерин | 0 | 2 мл | 0 |
| Персульфат аммония 10% * | 60 МКЛ | 10 МКЛ | 60 МКЛ |
| TEMED | 4 МКЛ | 2 МКЛ | 6 МКЛ |
| Общий объем | 10 мл | 10 мл | 5 мл |
| * DH2O сделать всегда свежие 10% Аммония персульфат | |||
Таблица 2. Рецепты гель для БН-страницы.
Дополнительные Рисунок 1. невозделываемых иммуноблоттинга образ Рисунок 1B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Discussion
Одним из наиболее важных частей протокола является сохранить нетронутыми OXPHOS комплексов во время подготовки проб, хранения и электрофорез геля. Таким образом митохондрии, должен быть изолирован на + 4 ° C и образцов не должен пройти циклов замораживания оттаивания. OXPHOS комплексы допускает только один цикл замораживания оттаивания в течение всей процедуры. Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов (рис. 1B). Управления и экспериментальных образцов, которые необходимо сравнить должны быть готовы параллельно избежать каких-либо различий в условиях хранения, которые могут дать результаты заблуждение. Если это не возможно для выполнения всех шагов протокола параллельно с всех образцов, мы рекомендуем заморозить промывают клеток окатышей на-80 ° C (шаг 1.4 в этом протоколе) и позднее выполнять остальные протокола для всех образцов вместе по крайней мере до elec гель trophoresis. Особое внимание должно уделяться чистоты электрофорез аппарата (танк, кассета). Если же аппарат используется для SDS-PAGE, очень хорошо Вымойте перед BN-страницы. Любые остаточные ИКБ может привести к диссоциации OXPHOS комплексов во время электрофореза.
Высокое качество градиента гели являются другой важной частью протокола. Сборный гели для голубой родной страницы являются коммерчески доступными; Однако это не рекомендуется использовать их, поскольку буферов, используемых для коммерческих гели могут иметь состав, который отличается от образца буферов. Градиент геля использованы здесь (6-15%) является оптимальным для разделения отдельных OXPHOS комплексов. Чтобы обнаружить более высокого порядка супрамолекулярные структуры OXPHOS, также известный как дыхательной цепи supercomplexes14, некоторые оптимизации является требуется11.
Для визуализации OXPHOS комплексы используют специфические антитела последовательно, на основе их свойств. Например используйте сначала антител, что последний дает слабый сигнал и антитела с наиболее сильным сигналом. Это важно, поскольку зачистки ослабляет обнаружения (рис. 1 d). Состав комплексов дыхательной цепи могут быть исследованы, если после BN-страница геля подвергается второго измерения SDS-PAGE15.
Протокол, описанные здесь предполагает последовательно с использованием антител против отдельных OXPHOS комплексов. Однако коммерчески доступных OXPHOS антитела коктейль может использоваться для обнаружения всех пяти OXPHOS комплексы одновременно. Тем не менее чтобы иметь возможность обнаружить неполно собрал OXPHOS комплексов и определить их самобытности, антитела против отдельных комплексов OXPHOS должен использоваться последовательно. Этот шаг является длительным; Однако это может быть важно для тестирования новых экспериментальных условий и моделей.
Концентрация digitonin, используемых для митохондриального изоляции должна быть оптимизирована для конкретной ячейки типа. Как моющее средство digitonin permeabilizes клеточной мембраны. Оптимальная концентрация digitonin эффективно permeabilizes плазматической мембраны клеток, оставляя нетронутыми митохондриальной мембраны. Слишком низкая концентрация digitonin вызывает высокое загрязнение митохондриальной экстрактов, пока слишком высокая концентрация повреждения митохондриальных мембран и уменьшает общее митохондриальной доходность. Оптимальное digitonin/белков соотношение (g/g) колеблется от 0,3 до 1. Западный анализ помаркой белков, извлеченные из окатышей и supernatants может использоваться для тестирования оптимальная концентрация digitonin16.
Этот протокол не содержит белка загрузки элемента управления на immunoblot; Таким образом концентрация белка извлеченные комплексов следует тщательно оценивать по крайней мере в triplicates для обеспечения равных загрузки. Кроме того образцы можно запустить в БН-страницы в реплицирует. Если Ассамблея селективного OXPHOS комплексов нарушается, неизменным комплексов может служить в качестве управления загрузки.
Оценка молекулярной массы белковых комплексов в БН-страница является сложной задачей,18. Текущий протокол не включают в себя маркер молекулярного веса; Таким образом чтобы оценить Ассамблея OXPHOS комплексов, контрольные образцы, содержащие не влияет комплексов должен всегда быть включен в анализ. Контрольные образцы для БН-страницы, как правило, неочищенные или дикого типа клеток.
Метод, представленный здесь оптимизирован для обнаружения дыхательной цепи митохондрий комплексов; Однако он также может применяться для оценки олигомеризации митохондриальных протеинов19. Кроме того Ассамблея ставка OXPHOS комплексов могут быть изучены первый озоноразрушающие митохондриальной кодировке Субблок содержащие комплексы, хлорамфеникола и затем после их восстановления после удаления хлорамфеникола10. Таким образом BN-страница может использоваться для оценки уровня устойчивого состояния и Ассамблеи OXPHOS для различных приложений, включая молекулярной диагностики человека митохондриальных нарушений9,11.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Библиотека университета Хельсинки поблагодарил за финансовую поддержку в публикации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T.
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y.
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
