Summary
Denne protokol viser analyse af mitokondriel respiratorisk kæde komplekser af blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese. Her er metoden anvendt til dyrkede humane celler beskrevet.
Abstract
Mitokondrie respiration er udført af oxidativ fosforylering (OXPHOS) komplekser i mitokondrierne. Interne og miljømæssige faktorer kan forurolige forsamling og stabiliteten af OXPHOS komplekser. Denne protokol beskriver analyse af mitokondriel respiratorisk kæde komplekser af blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) i ansøgningen til dyrkede humane celler. Første mitokondrier er udvundet fra celler ved hjælp af digitonin, så brug lauryl maltoside, de intakte OXPHOS komplekser er isoleret fra mitokondrie membraner. OXPHOS komplekser er så løst af gradient gelelektroforese under tilstedeværelse af den negativt ladede farvestof, Coomassie blå, som forhindrer protein sammenlægning og sikrer elektroforese mobilitet af proteinkomplekser mod katoden. Endelig er OXPHOS komplekser fundet af standard immunoblotting. Således er BN-side en praktisk og billig teknik, der kan bruges til at evaluere forsamlingen af hele OXPHOS komplekser, i modsætning til den grundlæggende SDS-PAGE giver mulighed for undersøgelse af kun enkelte OXPHOS komplekse underenheder.
Introduction
Mitokondrier er multifunktionelle organeller spiller en vigtig rolle i energiproduktionen, regulering af cellulære metabolisme, signalering apoptose, aldring, etc.1,2,3. Energiproduktion i mitokondrier er afhængig af funktionen oxidativ fosforylering, at par respiration med ATPsyntesen. I humane celler består mitokondrie oxidativ fosforylering system (OXPHOS) af fem komplekser. Komplekser I-IV opretter en elektrokemisk proton forløb i den mitokondrielle intermembrane plads, der bruges af komplekse V til at producere ATP. Hver OXPHOS komplekse er multimeriske og undtagen komplekse II, der består af underenheder kodet af nukleare og mitokondrie gener. Eventuelle fejl i de centrale komponenter i OXPHOS komplekser forårsaget af mutationer eller miljømæssige stress kan forurolige forsamling og funktionalitet af oxidativ fosforylering system. Derudover kræver ordentlig samling af funktionelle OXPHOS komplekser et stort antal forsamling faktorer4,5,6.
Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en grundlæggende teknik muliggør analyse af intakt proteinkomplekser og kan bruges til at studere forsamlingen af OXPHOS komplekser. Først, mitokondrier er isoleret fra cellerne af digitonin, som er et mildt rengøringsmiddel, der permeabilizes plasmamembran i cellerne. Derefter, ved hjælp af lauryl maltoside, OXPHOS komplekser er frigivet fra mitokondrie membraner. Ved hjælp af gradient gelelektroforese, er OXPHOS komplekser adskilt efter deres masse. Coomassie blå G-250 (ikke R-250) tilføjet til prøvebuffer og blå katode buffer dissocieres vaskemiddel-labil foreninger men bevarer individuelle respiratorisk kæde komplekser intakt8. Under elektroforese, er blå katode bufferen indeholder farvestof erstattet af katode buffer uden farvestof, som sikrer effektiv overførsel af OXPHOS komplekser til PVDF membran8. For at visualisere OXPHOS komplekser, inkuberes PVDF membran sekventielt med antistoffer svarende til de valgte underenheder af de fem OXPHOS komplekser.
Metoden beskrevet her med nogle ændringer kan anvendes på enhver kulturperler celler. Desuden, kan denne metode bruges til analyse af OXPHOS komplekser i mitokondrierne isoleres fra væv prøver9. BN-side kræver mindst 5-10 µg af mitochondrier for hver prøve pr. løb. Ved hjælp af metoden beskrevet her, 500.000 kulturperler celler såsom HEK293, SH-SY5Y eller 143B celler kan give ca 10 µg af mitokondrier. En tilstrækkelig mængde af celler til analysen af BN afhænger imidlertid bestemt celletype.
Den mest almindelige metode til at studere mitokondrie OXPHOS proteiner er SDS-PAGE og western blotting. Men, SDS-PAGE giver mulighed for at studere kun enkelte OXPHOS underenheder, og i modsætning til mia-side, kan ikke bruges til at evaluere forsamlingen af hele OXPHOS komplekser. Klart native-side adskiller proteinkomplekser i native betingelser uden tilstedeværelse af negativt ladede farvestof og har en betydeligt lavere opløsning i forhold til mia-side. Dog er klart indfødte-side mildere end BN-side, så det kan bevare labile Supramolekylær forsamlinger af proteinkomplekser såsom OXPHOS supercomplexes, der dissocieres under BN-side betingelser10. I denne protokol bruges den gradient gel til at adskille komplekser; men alternativt, ikke-gradient adskillelse kan bruges hvis det relativt dyre gradient maker ikke er tilgængelige11.
Vigtigt, metoden beskrevet her kan analysere forsamlingen af OXPHOS komplekser, mens funktionaliteten af komplekser ikke er vurderet. En høj opløsning BN-side efterfulgt af i-gel aktivitet assay11 samt spektrofotometriske enzymatisk aktivitet assay af mitokondrie komplekser12 er effektive teknikker til funktionel analyse af OXPHOS komplekser. Begge disse metoder imidlertid ikke assay samling af OXPHOS komplekser.
BN-side er således den optimale metode til at undersøge forsamlingen af individuelle OXPHOS komplekser. For eksempel, er nogle Mitokondrie-sygdomme, såsom Leber arvelige optisk neuropati (LHON), mitokondrie encephalopati med mælkesyre acidose og slagtilfælde-lignende episoder (MELAS), forbundet med ændrede forsamling af en eller flere komponenter i OXPHOS system5. Ved hjælp af BN-side metoden beskrevet her, kan blive undersøgt de molekylære mekanismer af mitokondrie sygdomme.
Protocol
spaNOTE: denne protokol er baseret på en tilhørende offentliggørelse af Hilander et al.13 .
1. fremstilling af buffere og løsninger
Bemærk: Alle de buffere og løsninger, der anvendes i protokollen er sammenfattet i tabel 1. Given mængderne af bufferne er tilstrækkelig til at forberede og køre 10 prøver. Alle bufferne kan opbevares ved + 4 ° C i op til et år.
- Forberede 20 mL 3 x gel buffer indeholdende 1,5 M aminokapronsyre syre, 150 mM Bis-tris i destilleret vand (dH2O). Justere pH 7.0.
- Forberede 10 mL 2 M aminokapronsyre syre i dH2O.
- Forberede 1 mL af mitokondrie bufferen ved at kombinere følgende: 0,5 mL 3 x gel buffer, 0,5 mL 2 M aminokapronsyre syre og 4 µL af 500 mM EDTA.
- Forberede 1.000 mL katode buffer indeholdende 15 mM af Bis-tris og 50 mM af tricine i dH2O. Juster pH 7.0.
- Forbered 200 mL af blå katode buffer ved at tilføje 0,04 g Coomassie blå G-250 til 200 mL af katode buffer.
- Forberede 1.000 mL af anoden buffer indeholdende 50 mM Bis-tris i dH2O. Juster pH 7.0.
- Forberede 2,5 mL af prøvebuffer indeholdende 750 mM aminokapronsyre syre og 5% Coomassie blå G-250 i dH2O.
2. forberedelse af mitokondrie lysates
- Plade cellerne dagen før indsamlingen. For HEK293 eller 143B celler ændrede brug Dulbecco Eagle's medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum, 1% L-glutamin, 100 mg/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin. Vokse celler i en celle kultur inkubator ved +37 ° C i 5% CO2 befugtet atmosfære. Sikre, at der er mindst 500.000 celler for hver prøve på indsamlingsdagen.
- Forsigtigt vaske cellerne en gang med iskold PBS. Undgå at fjerne celler fra pladen. Skrab cellerne og pellet dem ved 800 x g i 10 min. ved + 4 ° C.
- Vask celle pellet to gange med iskold PBS, og der centrifugeres som i trin 2.2. Måle proteinkoncentration med metoden Bradford ved hjælp af en kommerciel kit. Sammenpresse cellerne ved 800 x g i 10 min. ved + 4 ° C.
Bemærk: Efter samlingen celle udføre alle trinene ved + 4 ° C og lave ikke vortex. - Forbered 20 mL PBS med protease hæmmer ved at tilføje 200 µL af 100 x protease hæmmer til 20 mL PBS. Holde på is. Resuspend celler i PBS med protease hæmmer en endelige protein koncentration på 5 mg/mL.
- For at beregne omfanget af PBS med protease hæmmer skulle resuspend celler på 5 mg/mL, beregne den protein i hver prøve. Til denne beregning anvende proteinkoncentration målt i trin 2.3 og mængden af PBS bruges til resuspend cellerne efter vask i trin 2.3.
- Forberede 1 mL af 3,3 mM digitonin i PBS med protease inhibitor. Tilføje 3,3 mM digitonin til en endelig koncentration på 1,65 mM. Bland godt, og der inkuberes i isbad i 5 min.
- For at forberede 1 mL af 3,3 mM digitonin i PBS med protease inhibitor, opløses 4 mg af digitonin i 1 mL PBS ved 100 ° C indtil ingen bundfaldet er synlige og cool på is straks. Tilføje 10 µL af 100 x protease hæmmer til 1 mL af digitonin løsning.
Bemærk: Brug kun en frisk løsning af digitonin.
Forsigtig: Digitonin er giftigt! Bruge en ansigtsmaske, handsker og en lab coat.
- For at forberede 1 mL af 3,3 mM digitonin i PBS med protease inhibitor, opløses 4 mg af digitonin i 1 mL PBS ved 100 ° C indtil ingen bundfaldet er synlige og cool på is straks. Tilføje 10 µL af 100 x protease hæmmer til 1 mL af digitonin løsning.
- Tilføje PBS med proteinase inhibitor (udarbejdet i trin 2.4) til den endelige mængden af 1,5 mL. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. ved + 4 ° C. Fjern supernatanten. I dette trin, mitokondrier er pelleted.
- Mitokondrie resuspenderes i mitokondrie buffer. Mængden af mitokondrie buffer er halvdelen af mængden af PBS i trin 2.4.
- Forberede frisk 10% lauryl maltoside i PBS, som indeholder protease inhibitor (udarbejdet i trin 2.4). 1 mL er tilstrækkelig for 10 prøver. Tilføje 10% lauryl maltoside til den endelige koncentration på 1%. Der inkuberes i isbad i 15 min (dette trin kan være længere op til et par timer).
- Der centrifugeres ved 20.000 x g i 20 min. ved + 4 ° C. Indsamle supernatanten ind i et nyt rør. Måle proteinkoncentration af Bradford metode ved hjælp af et kit. Tilføje prøvebuffer, en diskenhed, der er halvdelen af mængden af lauryl maltoside bruges i trin 2.8. Prøver kan opbevares ved-80 ° C i op til 6 måneder.
3. forberedelse af gradient gel for BN-side
- Hæld den gradient gel for BN-side ved stuetemperatur. Placer den gradient maker på en røre pladen og forbinde det med fleksible slanger til den peristaltiske pumpe. Vedhæfte en infusion sæt med nålen til slangen. Placere en magnetomrører i den proksimale kammer i den gradient maker. Vask slanger med dH2O ved en maksimal pumpehastighed for 10 min.
- Tømme slangen og den gradient maker. Bruge en pipette til at fjerne enhver sidesten dH2O i den engelske kanal mellem kamre i den gradient maker. Lukke kanalen og slange med ventil.
- Ved hjælp af støbning ramme og klemmer samle to glasplader i indehaveren, som har et hul i bunden, og placere den i stativet. Sørg for at det er mere eller mindre på en glat overflade med en vandbalance. Sted nålen forbundet til rør mellem glasplader.
- Forbered 6% og 15% gel løsninger (tabel 2). Holde på is. Tilføje ammonium persulphate (APS) og tetramethylenediamine (TEMED) (de starter polymerisering) sidste. Bland forsigtigt at undgå luft bobler.
- Indlæse den proksimale ende af gradient-gel-mixer slanger kammer med 6% gel og den distale ende med 15% gel. Den samlede mængde af gel bør svare til mængden af de adskillende gel mellem glasplader. Således bruge 2,6 mL 6% gel og 2,1 mL 15% gel til gradient gel mixer til én 8.3 cm x 7,3 cm størrelse gel.
- Skift på magnetomrørerpladen, og åbne slanger og kanal mellem kamre i den gradient maker. Straks skifte på den peristaltiske pumpe til 5 mL/min. Fyld glasplader, og tillader ikke bobler til at indtaste gel. Fjern nålen, når der er noget gel i slangen.
- Forsigtigt overlay gel med dH2O. holde gel ved stuetemperatur i mindst 1 time til polymerisering.
- Straks efter at hælde gel, vaske slangen ved at udfylde de gradient kamre med dH2O og bruger den peristaltiske pumpe med maksimal hastighed. Ved udarbejdelsen af to og flere geler, altid rene systemet i mellem.
- Laves 1 x gel buffer ved blanding 3 mL 3 x gel buffer og tilføje 6 mL af dH2O. Fjern dH2O fra overfladen af gel med filtrerpapir forsigtigt. Vask overfladen af gel med 1 x gel buffer. Fjerne 1 x gel buffer med filtrerpapir forsigtigt.
- Undgå fibre fra filtrerpapir på gelen. For at sikre dette klip papiret i små stykker med saks, men ikke rive papiret.
- Placere kam mellem glasplader, men ikke fordybe det fuldt ud for at være i stand til at hælde den stabling gel under kammen. Forbered 4% stabling gel (tabel 2). Tilføje APS og TEMED vare som de starter polymerisering nemt. Bland forsigtigt undgå luftbobler.
- Overlay stabling gel, undgå bobler under kam, og Fordyb kammen fuldt ud. Lad den stabling gel polymerisere for mindst 30 min. Fjern kammen og brøndene vaskes med 1 x gel buffer ved hjælp af en pipette.
- Efter polymerisering, kan gelen opbevares ved + 4 ° C for et par dage. For at gemme gel, wrap gel i papir vædet med dH2O og plast film til at forhindre udtørring af gelen.
4. blå indfødte gelelektroforese
Bemærk: For at forhindre forringelse af OXPHOS komplekser køre elektroforese ved + 4 ° C. Bruge pre kølet buffere.
- Indlæse gel kassette med blå katode buffer indtil bunden af brøndene. Indlæsning af prøverne er lettere, når kassetten ikke er fyldt til toppen. Brøndene vaskes med blå katode buffer og derefter fylde brøndene med blå katode buffer med pipette.
- Indlæse prøver (5-30 µg af protein) i brønde. Forsigtigt fylde gel kassette til toppen med blå katode buffer og tank med anode buffer.
- Køre gel for 15 min på en konstant spænding på 40 V. Derefter øge spændingen til 80 V (eller bruge en konstant strøm af 6 mA), ikke overstiger 10 mA. Kør gelen, indtil farvefronten når 2/3 af gel længde.
- Erstatte den blå katode buffer med katode buffer og fortsætte elektroforese indtil farvestof front har kørt. I alt tager elektroforese omkring 3 timer.
- Hente glasplader og overføre proteinerne til polyvinylidene fluorid (PVDF) membran af halvtør blotting. Bruge en konstant spænding på 25 V og en aktuel begrænset til 1,0 en i 30 min.
- Alternativt, brug våde blotting for at overføre OXPHOS komplekser til en PVDF membran.
- Fortsætte med blokering af membran og antistof inkubationen efter standard immunoblotting protokol. Brug de primære antistoffer mod underenheder af OXPHOS komplekser sekventielt.
Bemærk: For eksempel bruge anti-NDUFA9 antistof (1: 2000) til komplekse jeg, anti-SDHA antistof (1: 2000) til komplekse II, anti-UQCRC2 antistof (1:1000) til komplekse III, anti-COX1 antistof (1: 2000) for komplekse IV og anti-ATP5A antistoffer (1: 2000) til komplekse V. Listen over antistofferne er præsenteret i Tabel af materialer.
Representative Results
Brug BN-side, kan mangler i samlingen af mitokondrie OXPHOS komplekser undersøges. Figur 1a viser samling af respiratorisk kæde komplekser i humane neuroblastoma celler (SH-SY5Y) behandlet med chloramphenicol, som specifikt hæmmer oversættelse af mtDNA-kodet OXPHOS underenheder. Chloramphenicol forarmet OXPHOS komplekser, der indeholdt mitochondrially kodet underenheder (komplekse I, III, IV; Figur 1A), mens komplekse II, som udelukkende er kodet af nukleare gener, var compensatorily upregulated. Kompleks V var ikke immunoblotted her.
Flere fryse-tø cykler ødelægge OXPHOS komplekser. Figur 1b viser nedbrydningen af OXPHOS komplekser af fryse-tø cykler. Mitokondrie respiratorisk komplekser i prøve 3, der har undergået flere fryse-tø cykler har en lavere band intensitet og er flyttet i forhold til de samme prøver, som var frosset kun én gang. En ukuperede vestlige skamplet billede af figur 1B er vist i tillægs figur 1.
Kvaliteten af gelen er vigtigt for skarpe og klare bands. Figur 1 C viser en immunblot fra en gel, der ikke polymerisere godt. Stripning af membranen kan også påvirke påvisning af OXPHOS komplekser. I figur 1 D, komplekse jeg var registreret før eller efter stripning. Signal-støj-forholdet er meget lavere efter tømte.
Figur 1. BN-side immunoblots fra succesfulde og sub-optimale eksperimenter. (A) udtømning af OXPHOS komplekser af inhibitor af mitokondrie oversættelse. Human neuroblastoma celler (SH-SY5Y) blev behandlet med chloramphenicol (CAP) i 48 timer. CTRL, kontrol celler uden chloramphenicol behandling. Nederste panel viser en kvantificering af immunblot. Værdien i kontrolelementet er taget som 1 (vises som en stiplet linje). Data præsenteres som betyder ± SD, n = 3, * P < 0,0001 sammenlignet med kontrol bruge uparrede Student's t-test. (B) afbrydelse af OXPHOS komplekser af flere fryse-tø cykler. Prøver 1-3 blev udarbejdet fra menneskelige osteosarkom celler (143B) i de samme betingelser. Prøver nummer 1 og 2 var frosset og smeltet kun én gang, mens prøvenummer 3 gennemgik fire fryse-tø cykler. (C) BN-side immunoblots af OXPHOS komplekser isoleret fra HEK293 celler. Den udtværing af bandene er forårsaget af lav kvalitet af gelen. (D) virkning af stripping på påvisning af OXPHOS komplekser. Påvisning af kompleks I humane neuroblastoma celler (SH-SY5Y) før og efter stripning af den samme membran. OXPHOS komplekser blev fundet ved hjælp af anti-NDUFA9 antistof (komplekse jeg), anti-SDHA antistof (komplekse II), anti-UQCRC2 antistof (komplekse III) og anti-COX1 antistof (komplekse IV). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer eller løsning | Sammensætning | Opskrift |
| 3 x gel buffer | 1,5 M aminokapronsyre syre | 3,94 g aminokapronsyre syre |
| 150 mM Bis-tris | 0.63 g af Bis-tris | |
| dH2O | Tilføje dH2O til 20 mL | |
| pH 7,0 | Justere pH 7.0 | |
| Katode buffer | 15 mM Bis-tris | 3.14 g af Bis-tris |
| 50 mM tricine | 8,96 g af tricine | |
| dH2O | Tilføje dH2O til 1000 mL | |
| pH 7,0 | Justere pH 7.0 | |
| Blå katode buffer | 0,02% coomassie blå G | 0,04 g Serva blå g |
| 15 mM Bis-tris | 200 mL af katode buffer | |
| 50 mM tricine | ||
| dH2O | ||
| pH 7,0 | ||
| Anode buffer | 50 mM Bis-tris | 20.93 g |
| dH2O | Tilføje dH2O til 2000 mL | |
| pH 7,0 | Justere pH 7.0 | |
| Mitokondrie buffer | 1,75 M aminokapronsyre syre | 0,5 mL 3 x gel buffer |
| 75 mM Bis-tris | 0,5 mL 2 M aminokapronsyre syre | |
| 2 mM EDTA | 4 µL af 500 mM EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7,0 | - | |
| Prøvebuffer | 750 mM aminokapronsyre syre | 0,94 mL 2 M aminokapronsyre syre |
| 5% comassie blå G | 0,125 g Serva blå g | |
| dH2O | Tilføje dH2O til 2,5 mL | |
| 2M aminokapronsyre syre | 2 M aminokapronsyre syre | 2.62 g aminokapronsyre syre |
| dH2O | Tilføje dH2O til 10 mL |
Tabel 1. Buffere og løsninger, der anvendes for BN-side.
| Blå indfødte geler | Adskille 6% gel | Adskille 15% gel | Stabling 4% gel |
| 3 x gel buffer | 3.3 mL | 3.3 mL | 1,64 mL |
| 40% acrylamid/Bis 37.5:1 | 1,5 mL | 3,75 mL | 0,5 mL |
| dH2O | 5.14 mL | 0,93 mL | 2.77 mL |
| Glycerol | 0 | 2 mL | 0 |
| 10% ammonium persulfat * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| Samlede volumen | 10 mL | 10 mL | 5 mL |
| * Sørg altid frisk 10% ammonium persulfat i dH2O | |||
Tabel 2. Opskrifter af gel for BN-side.
Supplerende Figur 1. ukuperede vestlige skamplet billede af figur 1B. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Discussion
En af de mest kritiske dele af protokollen er at bevare intakt OXPHOS komplekser under prøveforberedelse, opbevaring og gel elektroforese. Således skal holdes isoleret ved + 4 ° C, mitokondrier og prøverne underkastes ikke fryse-tø cykler. OXPHOS komplekser kan kun tåle en fryse-tø cyklus under hele proceduren. Flere fryse-tø cykler ødelægge OXPHOS komplekser (figur 1B). Kontrol og eksperimentelle prøver, der skal sammenlignes skal udarbejdes sideløbende at undgå eventuelle forskelle i vilkårene for opbevaring, som kan give misvisende resultater. Hvis det ikke er muligt at udføre alle trinene i protokollen parallelt med alle prøverne, anbefaler vi at fryse vasket celle pellets ved-80 ° C (trin 1.4 i denne protokol) og senere udføre resten af protokollen til alle prøver sammen i det mindste indtil gel elec trophoresis. Særlig opmærksomhed bør betales til renholdelse af elektroforese apparater (tank, kassette). Hvis samme apparat bruges til SDS-PAGE, vaske det meget godt før BN-side. Eventuelle resterende SDS kan forårsage dissociation af OXPHOS komplekser under elektroforese.
Høj kvalitet gradient geler er en anden vigtig del af protokollen. Færdigstøbte gel til blå indfødte side er kommercielt tilgængelige; Det anbefales dog ikke at bruge dem, da de buffere anvendes til kommercielle geler kan have en sammensætning, der er forskellig fra prøve buffere. Graduering af gel bruges her (6-15%) er optimal for adskillelse af enkelte OXPHOS komplekser. For at registrere højere-ordens Supramolekylær strukturer af OXPHOS, også kendt som respiratorisk kæde supercomplexes14, er nogle optimering nødvendig11.
For visualisering af OXPHOS brug komplekser af specifikke antistoffer sekventielt, baseret på deres egenskaber. For eksempel Brug først det antistof, der giver de svageste signal og antistof med det stærkeste signal sidst. Det er vigtigt, eftersom den stripping svækker påvisning (fig. 1 d). Sammensætningen af respiratorisk kæde komplekser kan undersøges, hvis efter BN-side gelen er udsat for den anden dimension SDS-PAGE15.
Protokollen beskrevet her foreslår at bruge antistoffer mod individuelle OXPHOS komplekser sekventielt. Men de kommercielt tilgængelige OXPHOS antistof cocktail kan bruges til at registrere alle fem OXPHOS komplekser samtidigt. Ikke desto mindre, for at være i stand til at opdage ufuldstændigt forsamlede OXPHOS komplekser og definere deres identitet, antistoffer mod individuelle OXPHOS komplekser bør anvendes sekventielt. Dette trin er tidskrævende; Det kan imidlertid være afgørende for afprøvning af nye eksperimentelle betingelser og modeller.
Koncentrationen af digitonin anvendes til mitokondrie isolation skal optimeres til specifikke celletype. Som et vaskemiddel permeabilizes digitonin celle membraner. Den optimale koncentration af digitonin permeabilizes effektivt plasmamembran i cellerne forlader mitokondrie membraner intakt. For lav koncentration af digitonin forårsager høj forurening af mitokondrie uddrag, mens alt for høj koncentration til skade mitokondrie membraner og reducerer de samlede mitokondrie udbytte. Optimal digitonin/protein-forhold (g/g) varierer fra 0,3 til 1. Western blot analyse af proteiner udvundet fra pellets og analysere kan bruges til at teste den optimale koncentration af digitonin16.
Denne protokol omfatter ikke protein lastning kontrol på immunblot; Derfor bør proteinkoncentration af uddraget komplekser omhyggeligt måles mindst i tre sikre lige lastning. Derudover kan prøver køres i mia-side i replikater. Hvis samling af selektiv OXPHOS komplekser er nedsat, upåvirket komplekser kan tjene som lastning kontrol.
Estimering af proteinkomplekser i siden BN molekylvægt er udfordrende18. Den nuværende protokol omfatter ikke molekylvægt markør; Derfor, for at anslå forsamlingen af OXPHOS komplekser, kontrolprøver indeholdende upåvirket komplekser bør altid indgå i analysen. Kontrolprøver for BN-side er normalt ubehandlet eller vilde type celler.
Den metode, der præsenteres her er optimeret til påvisning af mitokondrie respiratorisk kæde komplekser; Det kan imidlertid også anvendes til evaluering af oligomerisering af mitokondrielle proteiner19. Derudover kan forsamling satsen for OXPHOS komplekser studeres ved første ozonnedbrydende mitokondrie-kodet subunit indeholdende komplekser af chloramphenicol og derefter efter deres bedring efter fjernelse af chloramphenicol10. BN-side kan således bruges til at evaluere steady state niveauer og montering af OXPHOS til forskellige anvendelser, herunder Molekylær diagnostik af menneskelige Mitokondrie-sygdomme9,11.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Helsinki University Library er takkede for den finansielle støtte i udgivelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T.
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y.
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
