Summary
Detta protokoll visar analys av mitokondrie respiratoriska kedja komplex med blå infödda polyakrylamid gelelektrofores. Här beskrivs metoden tillämpas på odlade mänskliga celler.
Abstract
Mitokondriell respiration utförs av oxidativ fosforylering (OXPHOS) komplex inom mitokondrier. Inre och miljöfaktorer kan störa församlingen och stabilitet av OXPHOS komplex. Det här protokollet beskriver analys av mitokondrie respiratoriska kedja komplex med blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) i ansökan till odlade mänskliga celler. Först mitokondrier extraheras från cellerna använder digitonin, sedan använda lauryl maltoside, intakt OXPHOS komplexen är isolerade från de mitokondriella membran. De OXPHOS komplex matchas sedan av gradient gelelektrofores i närvaro av negativt laddade färgämnet, Coomassie blå, som förhindrar protein aggregation och garanterar elektroforetiska mobilitet av proteinkomplex mot katoden. Slutligen upptäcks de OXPHOS komplex av standard immunoblotting. BN-sida är alltså en bekväm och billig teknik som kan användas för att utvärdera montering av hela OXPHOS komplex, i motsats till den grundläggande SDS-PAGE möjliggör studiet av endast enskilda OXPHOS komplexa subenheter.
Introduction
Mitokondrierna är multifunktionella organeller spelar en viktig roll i energiproduktionen, reglering av cellulär metabolism, signalering, apoptos, åldrande, etc.1,2,3. Energiproduktionen i mitokondrierna är beroende av funktionen oxidativ fosforylering att par andning med ATP-syntes. I mänskliga celler består mitokondriell oxidativ fosforylering systemet (OXPHOS) av fem komplexen. Komplex I-IV skapa en elektrokemisk Protonlutning i det mitokondriella intermembrane utrymme som används av komplex V för att producera ATP. Varje OXPHOS komplex är multimeric och utom komplex II, som består av subunitsna kodas av både nukleära och mitokondrie gener. Defekter i de centrala delarna av OXPHOS komplex orsakade av mutationer eller miljömässig stress kan störa församlingen och oxidativ fosforylering funktionalitet. Korrekt montering av funktionella OXPHOS komplex kräver dessutom ett stort antal församlingen faktorer4,5,6.
Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en grundläggande teknik som möjliggör analys av intakt proteinkomplex och kan användas för att studera montering av OXPHOS komplex. Först är mitokondrier isolerade från cellerna av digitonin, som är ett milt rengöringsmedel som permeabilizes plasmamembranet av cellerna. Sedan, genom att använda lauryl maltoside, OXPHOS komplex frigörs från de mitokondriella membran. Med hjälp av gradient gel-elektrofores, separeras de OXPHOS komplex enligt deras massa. Coomassie blå G-250 (inte R-250) tillsätts provet bufferten och blå katoden bufferten dissocierar tvättmedel-labila föreningar men bevarar enskilda respiratoriska kedja komplex intakt8. Under elektrofores ersätts blå katoden bufferten som innehåller färgämnet av katoden bufferten utan färgämne, vilket säkerställer effektiv överföring av OXPHOS komplex till den PVDF membran8. För att visualisera OXPHOS komplex, inkuberas PVDF membranet sekventiellt med antikroppar som motsvarar de valda subenheter av de fem OXPHOS-komplex.
Den metod som beskrivs här med några ändringar kan tillämpas på alla odlade celler. Dessutom kan denna metod användas för analys av OXPHOS komplex i mitokondrierna som isolerats från vävnad prover9. BN-sidan kräver minst 5-10 µg av mitokondrier för varje prov per körning. 500.000 med metoden som beskrivs här, och odlade celler såsom HEK293, SH-SY5Y och 143B celler kan ge ca 10 µg av mitokondrier. En tillräcklig mängd celler för BN analys beror dock på vilken specifik cell.
Den vanligaste metoden att studera mitokondriella OXPHOS proteiner är SDS-PAGE och western blotting. Men, SDS-PAGE kan studera endast enskilda OXPHOS subenheter och, i motsats till BN-sidan kan inte användas för att utvärdera montering av hela OXPHOS komplex. Tydlig native-sida separerar proteinkomplex i inhemska förhållanden utan närvaro av negativt laddade färgämne och har en betydligt lägre upplösning jämfört med BN-sida. Tydlig native-sida är dock mildare än BN-sida så att det kan behålla labila supramolekylär sammansättningar av proteinkomplex som OXPHOS supercomplexes som dissocieras under de BN-sida villkor10. I detta protokoll används gradient gel för att separera komplex; dock alternativt kan icke-gradient separation användas om den relativt dyra gradient maker inte är tillgängligt11.
Viktigt, den metod som beskrivs här kan analysera montering av OXPHOS komplex, medan funktionaliteten i komplexen inte bedöms. En högupplöst BN-sida följt av i-gel aktivitet assay11 samt spektrofotometrisk enzymatisk aktivitet haltbestämning av de mitokondriella komplex12 finns effektiva tekniker för den funktionella analysen av OXPHOS komplex. Båda metoderna dock inte assay montering av OXPHOS komplex.
Således, BN-sidan är den optimala metoden att undersöka sammansättningen av enskilda OXPHOS komplex. Till exempel är vissa mitokondriella sjukdomar, såsom Leber hereditära optikusneuropati (LHON), mitokondriell encefalopati med laktacidos och stroke-liknande episoder (MELAS), associerade med förändrad sammansättning av en eller flera komponenter i OXPHOS system5. Med hjälp av BN-sida-metoden som beskrivs här, kan man studera molekylära mekanismer för mitokondriella sjukdomar.
Protocol
spaNOTE: detta protokoll är baserad på en associerad publikation av Hilander et al.13 .
1. beredning av buffrar och lösningar
Obs: Alla buffertar och lösningar används i protokollet sammanfattas i tabell 1. De angivna volymerna av buffertar är tillräckliga för att förbereda och kör 10 prover. Alla buffertar kan förvaras vid + 4 ° C i upp till ett år.
- Förbereda 20 mL 3 x gel buffert innehållande 1,5 M aminokapronsyra, 150 mM Bis-tris i destillerat vatten (dH2O). Justera pH till 7,0.
- Förbereda 10 mL 2 M aminokapronsyra i dH2O.
- Förbereda 1 mL av den mitokondriella bufferten genom att kombinera följande: 0,5 mL 3 x gel buffert, 0,5 mL 2 M aminokapronsyra och 4 µL 500 mM EDTA.
- Bereda 1000 mL katod buffert innehållande 15 mM av Bis-tris och 50 mM av tricine i dH2O. Justera pH till 7,0.
- Förbereda 200 mL blå katoden buffert genom att lägga till 0,04 g Coomassie blå G-250 200 mL katod buffert.
- Bereda 1000 mL anod buffert innehållande 50 mM Bis-tris i dH2O. Justera pH till 7,0.
- Förbereda 2,5 mL av provet buffert som innehåller aminokapronsyra 750 mM och 5% Coomassie blå G-250 i dH2O.
2. beredning av mitokondriell lysates
- Platta celler dagen innan samlingen. För HEK293 eller 143B celler modifierad användning Dulbecco's Eagle's medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum, 1% L-glutamin, 100 mg/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin. Växa cellerna i en cell kultur inkubator vid + 37 ° C i en 5% CO2 fuktad atmosfär. Se till att det finns minst 500 000 celler för varje prov på samma dag som uppsamlingen.
- Försiktigt tvätta cellerna en gång med iskall PBS. Undvik lossa cellerna från plattan. Skrapa cellerna och pellet dem vid 800 x g under 10 minuter vid + 4 ° C.
- Tvätta cellpelleten två gånger med iskall PBS och centrifugera som i steg 2.2. Mätning av protein koncentrationen med Bradford metoden använder ett kommersiella kit. Pellet cellerna vid 800 x g under 10 minuter vid + 4 ° C.
Obs: Efter samlingen cell, utföra alla steg vid + 4 ° C och inte snurra. - Förbereda 20 mL PBS med proteashämmare genom att lägga till 200 µL 100 x proteashämmare 20 mL PBS. Hålla på is. Att resuspendera cellerna i PBS med proteashämmare till en slutlig proteinkoncentration 5 mg/ml.
- För att beräkna volymen av PBS med proteashämmare som behövs för att resuspendera cellerna vid 5 mg/mL, beräkna mängden protein i varje prov. För denna beräkning Använd proteinkoncentration mäts i steg 2,3 och volymen av PBS som används för att resuspendera cellerna efter tvätt i steg 2,3.
- Laga 1 mL 3,3 mM digitonin i PBS med proteashämmare. Lägg till 3,3 mM digitonin till en slutlig koncentration på 1.65 mM. Blanda väl och inkubera på is för 5 min.
- För att förbereda 1 mL 3,3 mM digitonin i PBS med proteashämmare, lös 4 mg digitonin i 1 mL PBS vid 100 ° C tills ingen fällning är synliga och cool på is omedelbart. Tillsätt 10 µL av 100 x proteashämmare 1 ml av digitonin lösning.
Obs: Använd endast en färsk lösning av digitonin.
Varning: Digitonin är giftiga! Använd en ansiktsmask, handskar och en labbrock.
- För att förbereda 1 mL 3,3 mM digitonin i PBS med proteashämmare, lös 4 mg digitonin i 1 mL PBS vid 100 ° C tills ingen fällning är synliga och cool på is omedelbart. Tillsätt 10 µL av 100 x proteashämmare 1 ml av digitonin lösning.
- Lägga till PBS med proteinas hämmare (bereddes i steg 2,4) till den avslutande volymen i 1,5 mL. Centrifugera vid 10 000 x g under 10 minuter vid + 4 ° C. Ta bort supernatanten. I det här steget är mitokondrier pelleterat.
- Återsuspendera mitokondriell pelleten i mitokondriell buffert. Volymen av mitokondriell buffert är hälften av volymen av PBS i steg 2,4.
- Förbereda färska 10% lauryl maltoside i PBS innehållande proteashämmare (bereddes i steg 2,4). 1 mL räcker för 10 prover. Lägga till 10% lauryl maltoside slutliga koncentration av 1%. Inkubera i ice för 15 min (detta steg kan vara längre upp till ett par timmar).
- Centrifugera vid 20 000 x g under 20 minuter vid + 4 ° C. Samla in supernatanten i en ny tub. Mätning av protein koncentrationen av Bradford metoden använda ett kit. Lägg provet buffert, en volym som är hälften av volymen av lauryl maltoside använde i steg 2,8. Prover kan lagras vid-80 ° C i upp till 6 månader.
3. förberedelse av gradient gel för BN-sida
- Häll den gradient gel för BN-sida vid rumstemperatur. Placera den lutning maker på en uppståndelse tallrik och Anslut den med slangar till den peristaltiska pumpen. Bifoga ett infusionsset med nålen till slangen. Placera en magnetomrörare i proximala kammaren av gradient maker. Tvätta slangen med dH2O maximal pump hastighet i ca 10 min.
- Töm slangen och gradient maker. Använd en Pipettera för att avlägsna eventuella överblivna dH2O i kanalen mellan avdelningar med gradient maker. Stäng kanal och slangar med ventilen.
- Med Ingjutningsram och klämmor montera två glasskivor i hållaren, som har ett hål på undersidan, och placera den på stativet. Kontrollera att det är mer eller mindre på en rak yta med en vattenbalans. Plats nålen ansluten till slangen mellan glasplattorna.
- Laga 6% och 15% gel lösningar (tabell 2). Hålla på is. Lägga till ammonium persulfat (APS) och tetramethylenediamine (TEMED) (de börjar polymerisation) sista. Blanda försiktigt för att undvika att göra luft bubblor.
- Ladda den proximala änden av toning-gel-mixer slangar kammaren med 6% gel och den distala änden med 15% gel. Den totala volymen av gelen bör vara lika med volymen av separerande gel mellan glasplattorna. Således använda 2,6 mL 6% gel och 2,1 mL 15% gel till gradient gel mixern för en 8,3 x 7,3 cm storlek gel.
- Växla på magnetomröraren och öppna slangar och kanal mellan avdelningar med gradient maker. Omedelbart byta på den peristaltiska pumpen till 5 mL/min. Fyll glasplattorna och Tillåt inte bubblor att ange gelen. Ta bort nålen när det finns ingen gel i slangen.
- Försiktigt overlay gelen med dH2O. hålla gelen vid rumstemperatur i minst 1 h för polymerisation.
- Omedelbart efter hälla gelen, tvätta slangen genom att fylla lutning kamrarna med dH2O och använda den peristaltiska pumpen på maximal hastighet. När du förbereder två och fler geler, alltid rengöra systemet i mellan.
- Bered 1 x gel buffert genom att blanda 3 mL 3 x gel buffert och tillsätt 6 mL dH2O. ta bort dH2O från ytan av gelen med filterpapper försiktigt. Tvätta ytan av gelen med 1 x gel buffert. Ta försiktigt bort 1 x gel buffert med filterpapper.
- Undvika fibrer från filterpappret på gelen. För att säkerställa detta klipp pappret i små bitar med en sax, men inte riva papperet.
- Placera kammen mellan glasplattorna, men sänk inte ner den helt för att kunna hälla stapling gelen under kammen. Förbereda de 4% stapling gel (tabell 2). Lägga till APS och TEMED sista som de börjar polymerisation enkelt. Blanda försiktigt att undvika luftbubblor.
- Overlay stapling gelen, undvika bubblor under kammen, och fördjupa kammen fullständigt. Låt stapling gelen polymerisera för minst 30 min. ta bort kammen och Tvätta brunnarna med 1 x gel buffert med en Pipettera.
- Efter polymerisation, kan gelen lagras vid + 4 ° C för ett par dagar. För att lagra gelen, Linda in gelen i papper indränkt med dH2O och plast film för att förhindra uttorkning av gelen.
4. blå infödda gelelektrofores
Obs: För att förhindra nedbrytning av OXPHOS komplex köra elektrofores vid + 4 ° C. Använd före kylda buffertar.
- Ladda gel kassett med blå katoden bufferten tills botten av brunnarna. Lastning av proverna är lättare när kassetten inte är fylld till toppen. Tvätta brunnarna med blå katoden bufferten och sedan fylla brunnarna med det blå katoden buffert med Pipettera.
- Läsa in proverna (5-30 µg av protein) i brunnar. Fyll försiktigt gel kassetten till toppen med blå katoden bufferten och tanken med anod buffert.
- Kör gelen för 15 min vid en konstant spänning på 40 V. Sedan öka spänningen till 80 V (eller använda en konstant ström av 6 mA), inte överstiger 10 mA. Kör gelen tills färgen når 2/3 av längden gel.
- Ersätta den blå katod buffert med katod buffert och fortsätt elektrofores tills dye framsidan har tagit slut. Totalt tar elektrofores ca 3 timmar.
- Hämta glasplattorna och överföra proteinerna till polyvinylidene fluor (PVDF) membranet av halvtorr blotting. Använd en konstant spänning på 25 V och en ström som begränsat till 1.0 A i 30 min.
- Alternativt använda våta blotting överföra OXPHOS komplexen till ett PVDF membran.
- Fortsätta med blockering av membran och antikropp ruvning enligt protokollet standard immunoblotting. Använda de primära antikropparna mot subenheter av OXPHOS komplex sekventiellt.
Obs: till exempel använda anti-NDUFA9 antikroppar (1: 2000) för komplexa I, anti-SDHA antikropp (1: 2000) för komplex II, anti-UQCRC2 antikroppar (1: 1000) för komplex III, anti-COX1 antikropp (1: 2000) för komplex IV och anti-ATP5A antikroppar (1: 2000) för komplex V. Listan över antikropparna som presenteras i Tabell för material.
Representative Results
Med BN-sida, kan defekter i sammansättningen av mitokondrie OXPHOS komplex undersökas. Figur 1a visar montering av respiratoriska kedja komplex i mänskliga neuroblastomceller (SH-SY5Y) behandlade med kloramfenikol, som specifikt hämmar översättning av mtDNA-kodade OXPHOS subenheter. Chloramphenicol utarmat de OXPHOS komplex som innehöll mitochondrially-kodade subenheter (komplex I, III, IV. Figur 1A), medan komplex II, som kodas uteslutande av nukleära gener, var compensatorily uppreglerad. Komplex V var inte immunoblotted här.
Flera frysning-tining cykler förstöra OXPHOS komplex. Figur 1b visar nedbrytningen av OXPHOS komplex genom frysning-tining cykler. Mitokondriell respiratoriska komplexen i prov 3 som har genomgått flera frysning-tining cykler har en lägre intensitet i bandet och skiftas i jämförelse med de samma prover, som frystes endast en gång. En Okuperade western blot bild av figur 1B visas i kompletterande figur 1.
Kvaliteten på gelen är viktigt för skarpa och tydliga band. Figur 1 C visar en immunoblot från en gel som inte polymerisera väl. Strippning av membranet kan också påverka detektion av OXPHOS komplex. I figur 1 D, komplexa jag upptäcktes före eller efter strippning. Signal-brusförhållande är mycket lägre efter strippning.
Figur 1. BN-sida immunoblots från framgångsrika och suboptimala experiment. (A) utarmning av OXPHOS komplex av hämmare av mitokondrie översättning. Mänskliga neuroblastomceller (SH-SY5Y) behandlades med kloramfenikol (CAP) för 48 timmar. CTRL, kontroll celler utan kloramfenikol behandling. Den nedre panelen visar kvantifiering av immunoblot. Värdet på kontrollen tas som 1 (visas som en streckad linje). Data presenteras som genomsnitt ± SD, n = 3, * P < 0,0001 jämfört med kontroll användande oparade Student's t-test. (B) störningar av OXPHOS komplex av flera frysning-tining cykler. Proverna 1-3 var beredda från mänskliga osteosarkom celler (143B) på samma villkor. Prov nummer 1 och 2 var frusen och smält bara en gång, medan antalet prov 3 genomgick fyra frysning-tining cykler. (C) BN-sidan immunoblots av OXPHOS komplex isolerade från HEK293 celler. Den smetar av banden orsakas av låg kvalitet av gelen. (D) effekt av strippar på detektion av OXPHOS komplex. Påvisande av komplex I mänskliga neuroblastomceller (SH-SY5Y) före och efter strippning av samma membran. OXPHOS komplex som hittades med anti-NDUFA9 antikropp (komplex jag), anti-SDHA antikropp (komplex II), anti-UQCRC2 antikropp (komplex III) och anti-COX1 antikropp (komplex IV). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert eller lösning | Sammansättning | Recept |
| 3 x gel buffert | 1,5 M aminokapronsyra | 3,94 g aminokapronsyra |
| 150 mM Bis-tris | 0,63 g av Bis-tris | |
| dH2O | Lägg till dH2O till 20 mL | |
| pH 7,0 | Justera pH till 7,0 | |
| Katod buffert | 15 mM Bis-tris | 3,14 g av Bis-tris |
| 50 mM tricine | 8,96 g tricine | |
| dH2O | Lägg till dH2O till 1000 mL | |
| pH 7,0 | Justera pH till 7,0 | |
| Blå katoden buffert | 0,02% coomassie blå G | 0,04 g Serva blå g |
| 15 mM Bis-tris | 200 mL katod buffert | |
| 50 mM tricine | ||
| dH2O | ||
| pH 7,0 | ||
| Anod buffert | 50 mM Bis-tris | 20.93 g |
| dH2O | Lägg till dH2O till 2000 mL | |
| pH 7,0 | Justera pH till 7,0 | |
| Mitokondriell buffert | 1.75 M aminokapronsyra | 0,5 mL 3 x gel buffert |
| 75 mM Bis-tris | 0,5 mL 2 M aminokapronsyra | |
| 2 mM EDTA | 4 µL 500 mM EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7,0 | - | |
| Prov buffert | 750 mM aminokapronsyra | 0,94 mL 2 M aminokapronsyra |
| 5% comassie blå G | 0,125 g Serva blå g | |
| dH2O | Lägga till dH2O 2,5 mL | |
| 2M aminokapronsyra | 2 M aminokapronsyra | 2,62 g aminokapronsyra |
| dH2O | Lägg till dH2O till 10 mL |
Tabell 1. Buffrar och lösningar används för BN-sida.
| Blå infödda geler | Separera 6% gel | Separera 15% gel | Stapling 4% gel |
| 3 x gel buffert | 3.3 mL | 3.3 mL | 1,64 mL |
| 40% akrylamid/Bis 37.5:1 | 1,5 mL | 3,75 mL | 0,5 mL |
| dH2O | 5.14 mL | 0,93 mL | 2.77 mL |
| Glycerol | 0 | 2 mL | 0 |
| 10% ammonium persulfatoxidation * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| Totala volymen | 10 mL | 10 mL | 5 mL |
| * Göra alltid färska 10% ammonium persulfatoxidation i dH2O | |||
Tabell 2. Recept av gel för BN-sida.
Kompletterande Figur 1. Okuperade western blot bilden av figur 1B. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
En av de mest kritiska delarna av protokollet är att bevara intakt OXPHOS komplex under provberedning, lagring och gel elektrofores. Således, mitokondrierna bör isoleras vid + 4 ° C och proverna bör inte genomgå frysning-tining cykler. OXPHOS komplex tål endast en frysning-tining cykeln under hela förfarandet. Flera frysning-tining cykler förstöra OXPHOS komplex (figur 1B). Kontroll och experimentella prover som ska jämföras bör förberedas parallellt att undvika eventuella skillnader i förvaring, som kan ge missvisande resultat. Om det inte är möjligt att utföra alla steg i protokollet parallellt med alla prover, rekommenderar vi att frysa tvättade cell pellets vid-80 ° C (steg 1.4 i detta protokoll) och senare utföra resten av protokollet för alla prover tillsammans åtminstone tills gel elec trophoresis. Särskild uppmärksamhet bör ägnas städningen av elektrofores apparaten (tank, kassett). Om samma apparatur används för SDS-PAGE, tvätta det mycket väl före BN-sida. Eventuella kvarvarande SDS kan orsaka dissociation av OXPHOS komplex under elektrofores.
Hög kvalitet gradient gel är en annan viktig del av protokollet. Förtillverkade geler för blå infödda sida är kommersiellt tillgängliga. Det rekommenderas dock inte att använda dem, eftersom de buffertar som används för kommersiella geler kan ha en sammansättning, som skiljer sig från provet buffertar. Gradient gel används här (6-15%) är optimal för separation av enskilda OXPHOS komplex. För att upptäcka högre ordningens supramolekylär strukturer av OXPHOS, även känd som respiratoriska kedja supercomplexes14, är vissa optimering krävs11.
För visualisering av OXPHOS använda komplex de specifika antikropparna sekventiellt, baserat på deras egenskaper. Exempelvis använda första antikroppen som ger den svagaste signalen och antikroppen med den starkaste signalen senast. Detta är viktigt eftersom de strippar försvagar detektion (figur 1 d). Sammansättningen av respiratoriska kedja komplex kan undersökas om efter BN-sidan gelen utsätts för den andra dimensionen SDS-PAGE15.
Protokollet beskrivs här föreslår att antikroppar mot enskilda OXPHOS komplex sekventiellt. Kommersiellt tillgängliga OXPHOS antikroppen cocktail kan dock användas för att upptäcka alla fem OXPHOS komplex samtidigt. Ändå, för att kunna upptäcka ofullständigt monterade OXPHOS komplex och definiera sin identitet, antikroppar mot enskilda OXPHOS komplex bör användas sekventiellt. Detta steg är tidskrävande; Det kan dock vara nödvändigt för att testa nya experimentella förhållanden och modeller.
Koncentrationen av digitonin används för mitokondriell isolering bör optimeras för en viss celltyp. Som ett rengöringsmedel permeabilizes digitonin cellmembran. Den optimala koncentrationen av digitonin permeabilizes effektivt plasmamembranet av cellerna lämnar mitokondriella membranet intakt. För låg koncentration av digitonin orsakar hög kontaminering av mitokondriell extrakten medan alltför hög koncentration skadar de mitokondriella membran och minskar den totala mitokondriella avkastningen. Den optimala digitonin/proteinkvot (g/g) varierar från 0,3 till 1. Western blot analys av proteiner som utvunnits ur pellets och supernatanterna kan användas för att testa den optimala koncentrationen av digitonin16.
Detta protokoll innehåller inte protein lastning kontroll på immunoblot; Därför bör protein koncentrationen av extraherade komplex noggrant mätas minst i exemplar att säkerställa lika belastning. Proverna kan dessutom köras i BN-sida i replikat. Om montering av selektiv OXPHOS komplex är nedsatt, opåverkat komplex kan fungera som kontroller laddas.
Uppskattning av det molekylära samlas av proteinkomplex i BN-sidan är utmanande18. Det nuvarande protokollet omfattar inte den molekylvikt markören; för att uppskatta montering av de OXPHOS komplex, bör därför de kontrollprov innehållande opåverkat komplex alltid ingå i analysen. Kontrollproverna för BN-sidan är vanligtvis obehandlad eller vild typ celler.
Metoden presenteras här är optimerad för detektion av mitokondriell respiratoriska kedja komplex; Det kan emellertid också tillämpas för utvärdering av oligomerisering av mitokondrie proteiner19. Dessutom kan andelen montering av OXPHOS komplex studeras av första nedbrytande mitokondrie-kodade subenhet som innehåller komplex av kloramfenikol och sedan följa deras återhämtning efter avlägsnande av kloramfenikol10. BN-sida kan således användas för att utvärdera steady state nivåer och montering av OXPHOS för olika tillämpningar, inklusive molekylär diagnostik av människans mitokondriella sjukdomar9,11.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Helsingfors universitetsbibliotek är tackade för det finansiella stödet i publicering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T.
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y.
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
