גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced
Summary
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.
Abstract
החקירה של הפוטנציאל immunogenic של חיידקים commensal על המערכת החיסונית המארח הוא מרכיב חיוני אחד כאשר הלומדים אינטראקציות מארח-חיידק מעיים. היא מבוססת היטב commensals שונים התערוכה פוטנציאל שונים כדי לעורר את המערכת החיסונית מעיים של המארח. בחקירות אלה כרוכים בעלי חוליות, בעיקר מכרסמים. מאז לחששות הגוברים אתית מקושרים עם ניסויים מעורבים בעלי חוליות, יש ביקוש גבוה למודלים תחליפים הגעה.
כאן, אנו מספקים מודל הניהול אוראלי Galleria mellonella באמצעות חיידקים פתוגניים שאינם commensal והערכה אפשרי של הפוטנציאל immunogenic של commensals על המערכת החיסונית mellonella ג . נדגים כי mellonella ג הוא מודל חלופי הגעה חלופיות שימושי המאפשר הניתוח של commensals עם פוטנציאל immunogenic שונים כגון בקטריודיס vulgatus ו- Escherichia coli. מעניין, החיידקים הציג אין השפעה הרג על הזחלים, בדומה יונקים. תגובות מערכת החיסון של mellonella ג היו דומות עם חוליות תגובות מערכת החיסון המולדת, לערב ההוקרה של חיידקים וייצור של מולקולות מיקרוביאלית. אנו מציעים כי mellonella ג היה מסוגל להחזיר את האיזון microbiota הקודם, אשר כידוע אנשים יונקים בריאים. למרות מתן תגובות מערכת החיסון מולדים דומות mellonella ג והן חולייתנים, mellonella ג הנמל לא מערכת חיסונית אדפטיבית. מאז מרכיבי מערכת החיסון המולדת ובדוקים אבולוציונית ששומרו, המודל מאפשר ניתוח prescreening, הראשון של מאפיינים immunogenic חיידקי.
Introduction
Microbiome מעיים היא מרכיב חיוני לצורך תחזוקה של הומאוסטזיס, כרוכה בשתי תגובות מערכת החיסון מולדים, מסתגלת1,2. הקהילה commensal microbiota מאופיינת המרכיבים השונים commensal הראשי: אנחנו חיים איתם בסמביוזה המקנים השפעות מועילות על ידי פונקציות חשובות immunomodulatory, ו pathobionts זה יכולות להיות השפעות מזיקות ועוצמתיים מארחת, לקדם, לעורר דלקת מעיים3,4. מחקרים רבים בנושא אנחנו חיים איתם בסמביוזה ו pathobionts והשפעתם על המערכת החיסונית מארח התפרסמו בעיקר לומדת תגובות מערכת החיסון מסתגלת.
מאז מחקרים אלה כרוכים חיות רבות החקירות והגנה על החלפה של בהמות המשמשות לניסויים היא גוברת טובת הציבור, אנו שואפים למצוא מודל חלופי כדי לאפשר הקרנה של בקטריאלי שונה immunogenic מאפיינים. חרקים, במיוחד mellonella גלריה (galleria), הם מודל חלופי בשימוש נרחב במחקר זיהום. Mellonella ג משלב יתרונות שונים כגון עלויות נמוכות, תפוקה גבוהה; זה מאפשר אוראלי מנהלה של חיידקים, תוואי החשיפה טבעי, וזה מאפשר זיהום סיסטמי5,6. Mellonella ג נוסף מאפשר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר טמפרטורת הגוף הפיזיולוגיות של יונקים ו אופטימום בשביל התקפה אלימה חיידקי גורם ביטוי5. היתרון העיקרי של mellonella ג הוא מערכת החיסון המולדת שנשמרת זה מאפשר את מאפליה של האני-עצמי ושל מקודד מגוון של קולטנים זיהוי דפוס כמו apolipophorin או hemolin opsonin6, 7. על זיהוי חיידק, mellonella ג ניתן מפעילים שונים התגובות החיסון במורד הזרם ההורמונאלית. זה יכול לגרום תגובות סטרס חמצוני, מפרישים מינים חמצן תגובתי (ROS) הכוללת את הפעילות של NOS (סינתאז אוקסידאז חנקתית) ו- NOX (nadph ל אוקסידאז)6,8. בנוסף, mellonella ג מפעילה תגובה פפטיד מיקרוביאלית חזק (אמפר), כשהתוצאה היא ההפרשה של תערובת של מגברים שונים כגון gloverin, moricin, cecropin או gallerimycin כמו defensin6, 89,,10. באופן כללי, מגברים יש ירידה לפרטים מארח די רחבה נגד חיידקים גראם גראם שליליים ופטריות ויש לספק מענה חזק מאז חרקים חסרים כל תגובה מסתגלת10. Gloverin המגבר פעיל נגד חיידקים ופטריות, מעכב הממברנה החיצונית היווצרות6,11. Moricins התערוכה תפקידם מיקרוביאלית נגד חיידקים גראם גראם שליליים על ידי לחדור את הקרום ויוצרים9,נקבובית11. Cecropins לספק פעילות נגד חיידקים ופטריות, permeabilize את קרום באופן דומה כמו9,moricins10. Gallerimycin הוא פפטיד דמוי defensin עם תכונות אנטי פטרייתי9. מעניין, נמצא כי השילוב של cecropin ו- gallerimycin היה פעילות סינרגטיים נגד e. coli10.
בשל אופיים קל לשימוש mellonella ג הזחלים הם מודל זיהום שמרבים להשתמש בו כדי להעריך פתוגניות חיידקי. בפרט, מחקרים הנתונים המתקבלים ג mellonella לתאם עם נתונים שהושגו עכברים מהתמיכה של הכוח של מודל זה מארח חלופי. התברר כי הכי פתוגניים אשר נגרמו מהזנים אליהם של ליסטריה במודל זיהום של עכברים להוביל גם שיעורי התמותה גבוהים יותר mellonella ג לאחר זיהום סיסטמי. עוד יותר, פחות ארסית אשר נגרמו מהזנים אליהם התברר להיות גם פחות ארסית המודל של mellonella ג 12. תצפיות דומות שנעשו עם הפטריות פתוגניים האנושי קנדידה אלביקנס. התקפה אלימה של שונות אלביקנס ג זנים יש להיות מוערך על-ידי זיהום סיסטמי ובפיקוח עוקבות של הישרדות זחל. זני avirulent העכבר היו גם avirulent או הייצוגיים מופחתת התקפה אלימה ב mellonella ג, ואילו זנים מידבק עכבר להוביל גם גבוהה התמותה זחל13. המודל mellonella ג נוסף ניתן להשתמש כדי לזהות גורמים פתוגניות של מערכת הפרשת סוג 3 של Pseudomonas aeruginosa14.
מאז רוב החקירות מעורבים mellonella ג התמקדו הגורמים התקפה אלימה באמצעות גישה זיהום סיסטמי היינו מעוניינים במיוחד לספק שיטה מתאימה לניתוח של המעי commensals ב פיטום אוראלי מודל שבו אנחנו ניתן להחיל מינון שונות של חיידקים לכל הזחלים, לא רק להתבונן שיעור התמותה הזחל אך לנתח המחפשים אחר תגובות מערכת החיסון המולדת כדי לשמור על הומאוסטזיס מעיים.
השיטה שלנו מסייע להגדיל את השימוש mellonella ג כמודל חלופי מאז אנו משלבים את היישום של חיידקים וניתוח של RNA הביטוי. זה שימושי לא רק לחזק את המשמעות של מחקרים פתוגנזה חיידקי כאשר כולל הניתוח של תגובות חיסוניות לאחר ניהול אוראלי, לא רק את התצפית של שיעורי תמותה לאחר זיהום סיסטמי. השיטות שלנו מאפשר הניתוח של המאפיינים immunogenic של בקטריאלי פתוגניים שאינם commensals, שכן הוא מספק תנאים מורכבים יותר מאשר תרבית תאים על-ידי המציע מכשול המעי באורגניזם חי.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל mellonella ג הוא מודל נפוצות להערכת גורמים התקפה אלימה חיידקי זיהום סיסטמי הגישה21. מאז רבים פתוגנים וחיידקים להיכנס המארח דרך תוואי אוראלי מושבת או זיהום, תובנות חדשות צריך להימצא להעריך mellonella ג כמודל עבור קולוניזציה אוראלי ולדלקת.
האפשרות האחורי <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי את DFG (SPP1656), קבוצת אימון המחקר DFG 1708, את Bundesministerium לדנציג Bildung und Forschung (BMBF), ומרכז גרמנית עבור זיהום מחקר (DZIF).
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
