Summary
Knogle ekstracellulære matrix (BEM) model for osteosarkom (OS) er veletableret og vist her. Det kan bruges som en egnet stillads til efterligne primær tumor vækst i vitro og giver en ideel model for at studere den histologiske og cytogenic heterogenitet af OS.
Abstract
Osteosarkom (OS) er den mest almindelige og et stærkt pågående primære knogletumor. Det er kendetegnet med anatomiske og histologiske variationer sammen med diagnostiske eller prognostiske vanskeligheder. OS består genotypisk og fænotype heterogene kræftceller. Knogle mikromiljø elementer er bevist at tage højde for tumor heterogenitet og sygdom progression. Knogle ekstracellulære matrix (BEM) bevarer mikrostrukturanalyse matricer og biokemiske bestanddele af indfødte ekstracellulære matrix. Dette væv-specifik niche giver en gunstig og langsigtede stillads til OS celle såning og spredning. Denne artikel indeholder en protokol for forberedelse af BEM model og dens yderligere eksperimentelle program. OS celler kan vokse og differentiere sig til flere fænotyper overensstemmelse med histopatologiske kompleksiteten af OS kliniske prøver. Modellen giver også mulighed for visualisering af forskelligartede morfologier og deres tilknytning til genetiske ændringer og underliggende reguleringsmekanismer. Som homologe til menneskelige OS, kan dette BEM-OS model udviklet og anvendes til patologi og kliniske forskning af OS.
Introduction
Osteosarkom (OS) forekommer normalt i aktivt voksende områder, metaphysis af lange knogler, i løbet af ungdomsårene. Mere end 80% af de OS-ramte sites har præference for metaphysis af proksimale tibia samt proksimale humerus og distale og proksimale femur, svarende til placeringen af vækst plade1. OS består af flere celle undertyper med mesenchymale egenskaber og stor mangfoldighed i histologiske funktioner og kvalitet. Beviser støtter mesenchymale stamceller (msc), osteoblaster engageret prækursorer og pericytes som cellerne i oprindelse2,3,4,5. Disse celler kan akkumulere genetiske eller epigenetiske ændringer og give anledning til OS under indflydelse af visse knogle microenvironmental signaler. Både indre og ydre mekanismer resultere i genomisk ustabilitet og heterogenitet af OS, med flere morfologiske og kliniske fænotyper6,7. For individualiserede behandlinger eller screening af nye stoffer skal roman modeller genereres til mod heterogenitet eller andre kliniske forstyrrelser.
OS er en intra ossøse maligne solid tumor. Kompleksitet og aktivitet i den omgivende mikromiljø elementer giver fænotypiske og funktionelle forskelle på OS celler i forskellige steder af en tumor. Knogle ekstracellulære matrix (BEM) giver en strukturelle og biokemiske stillads til mineralske deposition og knogle remodellering. Den organiske del af ekstracellulære matrix (ECM) består hovedsagelig af type I kollagen udskilles af osteoblastic slægt celler, mens dens mineraliseret del består af calcium fosfat i form af hydroxyapatit8. ECM netværk dynamisk rolle er at regulere celle vedhæftning, differentiering, cross-talk og væv funktion vedligeholdelse9.
Demineraliseret BEM og ECM hydrogels held har været anvendt i cellekultur og kan øge celle spredning10,11. Syntetiserede knogle-lignende ECM kan regulere Gruppestørrelse, skæbne beslutninger og afstamning progression af MSCs12,13,14. Derudover beviser resultater dens kliniske betydning for at give osteogenic aktivitet ved at stimulere cellulære processer under knogle dannelses- og regenereringsprocesserne15,16,17.
I denne artikel etablerer vores gruppe en modificeret model og gunstige alternativ for tre-dimensionelle langsigtede kultur. OS celler injiceres i de væv-afledte BEM præsentere en uensartet mesenchymale fænotype let i forhold til plast todimensionale kulturer. BEM afledt af lokationsspecifikke homologe væv vise sin dramatiske fordel som en naturlig niche for OS celler in vitro- og har et stort potentiale i OS teoretisk og klinisk forskning. Dette karakteriserede BEM platform er enkel, men effektiv for in vitro- forskning og kan forlænges i modellering flere kræftformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrs pleje og brug udføres Ifølge National Institutes of sundhed Guide til pleje og brug af forsøgsdyr (NIH publikation NO.80-23, revideret i 1996) efter godkendelse fra dyret etiske udvalg af Sun Yat-sen universitetet.
1. ben forberedelse
- Få 4 til 6 uger gamle BALB/c mus (uden sex-specifikke krav). Aflive en mus aseptisk af cervikal dislokation og afskære frisk fibula, skinnebenet og lårbenet fra en hindlimb med en steril kirurgiske saks. Skrælle den epitelvæv og derefter fjerne så meget af det bløde væv som muligt ved hjælp af saks og pincet.
- Skyl ben knogler med steril 10 mM fosfatbufferet saltopløsning (PBS) to gange for at fjerne blod i en 6 cm parabol. Fordyb knogler i 75% ethanol i 3 min., derefter skylles med PBS to gange. Ren knogler kan opbevares i en steril 50 mL-centrifugerør med steril PBS ved-80 ° C i måneder indtil kræves.
Bemærk: PBS bruges i alle de følgende trin er 10 mM PO43.
2. knogler demineralisering og decellularization
- Optø frosne knoglerne ved stuetemperatur, og derefter fryse igen ved-80 ° C for 1 h. er underlagt knoglerne mere end 2 – 3 fryse-tø cykler for celle lysis og væv opdeling.
- Inkuber knogler i en steril 50 mL-centrifugerør med 0,5 N HCl natten over ved stuetemperatur på en vuggende platform eller orbital shaker med blid vuggende/ryste at sikre fuldstændig og endda dækning af knogler.
Bemærk: Sørg for knoglerne er helt nedsænket under bevægelse i syren og ikke slå sig ned i løbet af processen. Volumen af HCl løsning bør være mere end 10 gange som for knoglerne. - Efter afkalkning, dekanteres HCl løsning helt og skyl under rindende vand i 1 time. Derefter vask knogler to gange i 15 min. pr. vask med destilleret vand på en vuggende platform eller orbital shaker.
Bemærk: Sørg for at helt at fjerne den løsning eller vand mellem vasker og efter den sidste vask med destilleret vand. - Uddrag lipider i demineraliseret knogler med en 1:1 blanding af metanol og chloroform i et 50 mL centrifugeglas omviklet med sølvpapir i 1 time ved stuetemperatur10.
- Derefter, overføre knogler i et andet rør af methanol omviklet med sølvpapir for 30 min. Fjern methanol helt og skyl med destilleret vand to gange i 15 min. med forsigtigt ryste. Dekanteres endelige vaskevand og fortsætte med følgende trin under steril tilstand.
Bemærk: Under ekstraktionstrinet, lys skal undgås for at forhindre chloroform nedbrydning. Blandingen kan være gemt i lysægte container eller et centrifugeglas omviklet med sølvpapir. Udføre alle behandling og vaske trin under beskedne rotation eller vuggende bevægelse. - Skyl knogler i en 6 cm parabol med steril PBS til 3 min, og derefter overføre knogler i en ny 50 mL-centrifugerør. Tilsættes 40 mL steril 0,05% trypsin-EDTA (TE) ind i røret og der inkuberes knogler til 23 h i en CO2 inkubator ved 37 ° C18.
- Kassér TE løsningen og skylles to gange med steril PBS suppleret med 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin. Efter klaring finalen vask PBS helt, genopbygge med 40 mL steril PBS. Vask grundigt i 24 timer ved stuetemperatur med blid vuggende eller ryste for antibiotika blød.
Bemærk: Alle steril PBS anvendes i dette og de følgende trin indeholder 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin. Overnight vask under rotation eller vuggende bevægelse udføres for lange perioder grundig fordybelse med antibiotika for at opnå effektiv sterilisering af pore rum. - Fjerne PBS og overføre knogler i en frisk 50 mL-centrifugerør fyldt med steril PBS. Den tilberedte demineraliseret og decellularized knogler kaldes knogle ekstracellulære matrix (BEM) og kan opbevares ved 4 ° C i 2 måneder indtil kræves.
3. celle såning og kultur
- Tag BEM fra 4 ° C køleskab og nedsænke det i 75% ethanol til 30 s, så Skyl med PBS to gange. Overføre BEM på en ren 6-godt celle kultur tallerken. Tilsættes 2 mL komplet næringssubstratet (Dulbeccos modificerede Eagle's medium/F12 (DF12) der indeholder 5% føtal bovint serum, 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin). Inkuber BEM natten over i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Få menneskelige OS cellelinjer (MNNG/HOS og MG-63). Suspendere ca 1,0 x 105 OS celler med 100 μL PBS indeholdende phenol rød som indikator.
Bemærk: For at bedre styr og observere flere lag celler inden for den tre-dimensionelle BEM model, MNNG/HOS og MG-63 er inficeret med lentiviral vektor udtrykker fluorescerende mCherry og grønt fluorescerende proteiner (NGL). - Efter BEM er fuldt gennemblødt i mediet, skal du injicere OS celler i BEM fra proksimale eller distale epiphysis, når nålen når medullær hulrummet af BEM. Inkuber OS-BEM model for et minimum af 2 h i en fugtig 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C til at sikre de injicerede celler fast overholder BEM.
Bemærk: Før varm alle medier bruges til cellekultur. Væksthuset bruges til cellekultur har en befugtet 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C. - Tilsæt 1 mL komplet næringssubstratet i plade til helt pels overfladen af BEM kultur natten over i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Forsigtigt overførsel OS-BEM model i en ny brønd af 6-godt plade med en steril pincet og refeed 1 mL frisk næringssubstratet. Kultur modellen for 14 dage i en CO2 inkubator ved 37 ° C og opdatere næringssubstratet alt efter spredning af OS celler.
- Holde overvåge medium farve og celle status under inverteret fluorescens mikroskop under kultur-processen. Når OS celler udvide til pladen, forsigtigt overføre OS-BEM model til en anden ny godt med steril pincet.
Bemærk: Næringssubstratet er lyse rødt på pH 7,4, som er den optimale pH værdi for de fleste pattedyr cellekultur. Hvis mediet bliver til orange eller endda gul, straks opdatere medium for at opretholde et sundt miljø for OS celler. - Overføre OS-BEM model i en ny brønd med en pincet og forsigtigt Skyl med PBS fjerne næringssubstratet. Derefter, overføre i en 15 mL-centrifugerør og fastgør med 10% buffered formalin for histologiske identifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter demineralisering og decellularization synes BEM at være gennemsigtig med stærkere ukuelighed og udholdenhed i forhold til native mus knogle. En lille muskel rester og plads på medullær hulrum kan tydeligt iagttages (figur 1A, B). For at bestemme den effektive decellularization af BEM, er BEM indlejret i paraffin efter fiksering, og derefter skåret i 3-5 μm sektioner for hæmatoxylin-eosin (H & E) farvning. Grundig fjernelse af cellekerner er vist af lysfelt billeddannelse. Den naturlige porøse struktur og kollagen netværk ordning er velholdt i decellularized BEM (figur 1C, D). Derudover immunhistokemiske (IHC) farvning af fremherskende organiske komponenter af knoglematrix, såsom kollagen jeg og kollagen IV viser ingen skader på ECM komponenter i decellularized BEM i forhold til den indfødte knogle (figur 1E). Derfor giver BEM en passende og lovende stillads med stor biokompatibilitet for OS celle såning og spredning.
MNNG/HOS cellerne udviser en meget atypisk morfologi med fint vacuolated cytoplasma, mens MG-63 celler har fibroblast-lignende spindled figurer i éncellelag kultur (figur 2A, B). Den histologiske sektion fra en OS patienten viser betydelig cellulære pleomorphism med rundet eller polygonalt celler, anisonucleosis og flere mitoses (figur 2C). Til verificering af levedygtighed og kvaliteten af BEM model, er begge cellelinjer injiceres medullær hulrummet af BEM og overvåges via fluorescens imaging under 14 dages kultur (fig. 3A, B). Histologiske sektioner med H & E farvning afsløre at OS celler tillægger muskel restkoncentrationer og vokse ind i tykke pæle eller overholde langs knoglematrix og formere. Både periosteum og endosteum er infiltreret af udvidelse af OS celler. Påfaldende, celle vækstmønstre af OS-BEM model adskiller sig fra todimensionelt plade kultur. Som illustreret i figur 3C, Vis OS celler på den decellularized BEM meget heterogene morfologi svarende til cytopathologic funktionerne i en OS afsnit. Nogle OS celler lokalisering i spongiosa og medullær hulrum er kugleformet og delvis spredt ud, mens celler hvilende langs periosteum og endosteum er meget spredt ud i aflange celler ledsaget af nukleare pleomorphism. Celleaktivitet bestemmes ved hjælp af Ki67 immunfarvning, som også viser store fordele i langsigtede kulturer. Også, OS celler i BEM kultur meget express knogle matrix glycoprotein — udskilles protein sure og rigt på cystein (SPARC/osteonectin) — som er specifikke for osteoid matrix (figur 3D).
Figur 1 : De strukturelle karakteristika af mus decellularized BEM. (A, B) Oversigt over musen indfødte (A) og decellularized (B) knogle. (C, D) Decellularization blev vurderet af H & E farvning af musen indfødte tibia (C) og decellularized ben (D). Cellekerner farves med hæmatoxylin kunne observeres i native mus tibia, men ikke i BEM. (E) IHC farvning for kollagen jeg og kollagen IV at opdage ECM hovedkomponenter, der er bevaret i mus skinneben efter decellularization. Gul pil peger på den rigelige kollagen jeg inden for spongiosa og blå pil peger ud den rigelige kollagen IV inden for kompakte knogle. Skalere barer = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Cytomorphological kendetegner OS. (A, B) Menneskelige OS cellelinjer MNNG/HOS (A) og MG-63 (B) udvidet i plast kolbe kultur. Skalalinjen = 100 μm. (C) histopatologisk sektion med H & E farvning af OS patienten. Skalalinjen = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Karakterisering af OS celler i decellularized ben ekstracellulære matrix model. (A, B) Repræsentant mCherry udtryk (rød) billede af MNNG/HOS (A) og normal god landbrugspraksis udtryk (grøn) billede af MG-63 (B) af Fluorescens mikroskopi efter såning og dyrkning i BEM. Skalalinjen = 100 μm. (C) H & E analyse viser typiske morfologi af de injicerede MNNG/HOS og MG-63 celler efter dyrkning i BEM. (D) IHC analyse på Ki67 og SPARC udtryk niveau af MNNG/HOS celler efter dyrkning i BEM model for 14 dage. De repræsentative billeder er to sæt af serielle sektioner farves med Ki67 og SPARC. Skalalinjen = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt OS kan klassificeres som osteoblastic, chondroblastic og fibroblastic undertyper afhængigt af dets dominerende histologisk komponent. Sin prognose er ikke kun afhængig af histologiske parametre men også på sin anatomiske hjemmeside. Det kan opstå inde i knogler (i intramedullært eller intracortical rum), på overflader af knogler og extraosseous sites19. Fremkomsten og heterogenitet af OS kan blive belyst som en konjugation af muterede begivenheder og en passende microenvironmental boost, efterfulgt af stigende udvikling og migration til fjerntliggende organer20,21,22 ,23. Mystery under OS evolution kan tydes med en ordentlig model at skitsere kliniske implikationer målretning OS miljø og niche.
Dyrkning plastic retter eller i kolber i vitro kan næppe sammenfatte den dynamiske og indviklede biologiske mikromiljø. Store fremskridt i forskellige prækliniske modeller (f.eks. mus, zebrafisk og hund) efterligne osteosarkom er blevet erklæret og anvendes til patogenesen undersøgelse og narkotika udvikling4,24,25, 26 , 27 , 28. forskere har stadig, bekymring for forsøgsdyr på grund af deres ubehag og lidelse under eksperimenter. In vitro tredimensionale modeller som vores decellularized BEM model har fordelen på grund af sin komfort, hurtig betjening og omkostningsbesparende; Det giver langsigtet og nem vedligeholdelse af levedygtige celler eller væv, og er også tættere på den indfødte biologiske situation end plast kultur. Det har været brugt i vores forskning demonstrerer fænotypiske heterogenitet og regulerende mekanisme af OS dedifferentiation med succes29.
Denne protokol afklaret muligheden for at generere en væv-afledte BEM fra mus og vil kunne anvendes til væv fra menneskelige, rotte som hund. De mest kritiske trin til vellykket etablering og anvendelse af BEM er: (i) fuldstændig fjernelse af celle debris; (ii) vedligeholdelse af en steril, sund kultur tilstand; (iii) håndelag og blid pipettering under injektion, overførsel og kultur af OS-BEM model.
Andre rapporterede protokoller generelt beskæftiger opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet eller en kombination af kemisk og enzymatiske behandlinger, såsom Triton X-100, sodium dodecyl sulfat (SDS) og DNase/RNase løsning til at opnå potent decellularization30,31 . Brusk væv, der gennemgår decellularization med vaske-og rengøringsmidler har vist sig at fjerne ECM komponenter herunder glycosaminoglycans32. For at sammenfatte en mere intakt BEM i videst muligt omfang, er et moderat endnu kraftfulde decellularization metode udført her for at undgå opløsning og beskadigelse af vigtige komponenter og indfødte arkitektur af knogle miljø.
Det er imidlertid ikke at blive forsømt at denne OS-BEM model hvilede i en plade uden flydende medium, derfor føre til en ujævn fordeling af ilt og næringsstoffer. Vaskulære netværk og andre celle undertyper, der hjælper regulere kommunikation og interaktion af microenvironmental signaler og knogle homøostase skal tages i betragtning24, 33,34, 35. forhåbentlig denne model vil blive kombineret med andre high-tech engineering teknikker til at kaste lys over OS forskning og guide præcision medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne værdi Liuying Chen støtte til hendes administrativ bistand og lange Zhao for hans fremragende teknisk bistand under opførelsen af knogle ekstracellulære matrix stilladser. Denne undersøgelse understøttes af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
- Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
- Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
- Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
- Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
- Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
- Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
- Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
- Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
- Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
- Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
- Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
- Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
- Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
- Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
- Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
- Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
- Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
- Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
- Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
- Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
- Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
- Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
- Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
- Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
- Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
- Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
- Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
- Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
- Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
- Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
- Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
