Summary
다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
다리 (OS)는 가장 일반적이 고 매우 공격적 기본 뼈 종양 이다. 해부학 및 조직학 변화 진단 또는 전조 어려움 함께 특징입니다. 운영 체제 genotypically 그리고 phenotypically 이종 암 세포를 구성 되어 있습니다. 뼈 microenvironment 요소는 종양이 고 질병 진행에 대 한 계정에 입증 했다. 뼈 기질 (괜 찮) microstructural 행렬 및 기본 세포 외 매트릭스의 생 화 확 적인 구성 요소를 유지합니다. 이 조직의 특정 틈새 OS 셀 시드 및 확산에 대 한 유리한 및 장기 비 계를 제공 합니다. 이 문서는 벰 모델과 더 실험적인 응용 프로그램의 준비에 대 한 프로토콜을 제공합니다. OS 셀 성장 하 고 여러 고기 OS 임상 표본의 histopathological 복잡도와 일치로 분화 수 있습니다. 모델은 또한 다양 한 형태학 그리고 유전 변경 및 내부 규제 메커니즘 함께 그들의 협회의 시각화 수 있습니다. 인간의 OS에 동종로이 벰 OS 모델 개발 고 병 리 및 운영 체제의 임상 연구에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
다리 (OS)는 적극적으로 성장 하는 지역, 긴 뼈의 metaphysis 사춘기 동안에 일반적으로 발생 합니다. 운영 체제의 영향을 받는 사이트의 80% 이상이 있다 metaphysis 원심 및 근 위 대 퇴 골, 성장 판1의 위치에 해당 뿐만 아니라 근 위 경골 근 위 상 완 골의 대 한 선호. 운영 체제 여러 셀 하위 엽 속성 및 조직학 특징 및 급료에서 상당한 다양성으로 구성 되어 있습니다. 증거 원본2,3,,45의 셀으로 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), osteoblasts 커밋된 선구자 및 pericytes을 지원합니다. 이러한 세포 축적 유전자 또는 후 변경 하 고 특정 뼈 microenvironmental 신호의 영향 아래 운영 체제를 야기할 수 있습니다. 내부 및 외부 메커니즘 genomic 불안정성 및 여러 형태학 상과 임상 고기6,7운영 체제의이 결과. 개별된 치료, 새로운 의약품의 심사에 대 한 새로운 모델이 또는 다른 임상 질환에 대 한 생성 될 필요가 있다.
운영 체제는 내부 뼈가 있는 악성 고체 종양입니다. 복잡성과 활동의 microenvironment 요소를 둘러싼 OS 세포 종양의 다른 위치에 따라 phenotypic와 기능 차이 부여. 뼈 기질 (괜 찮) 미네랄 증 착 및 뼈 구조 및 생 화 확 적인 발판을 제공합니다. 세포 외 기질 (ECM)의 유기 부분은 주로 이루어져 있다 유형 나 콜라겐의 광물 화 된 부분 hydroxyapatite8의 형태로 칼슘 인산 염의 구성 하는 동안 osteoblastic 계보 세포에 의해 분 비. 세포 접착을 규제 하는 ECM 네트워크의 동적 역할, 차별화, 잡담 및 조직 기능 유지 관리9.
광된 벰 및 ECM hydrogels 성공적으로 세포 배양에 사용 되 고 세포 확산10,11을 향상 시킬 수 있습니다. 합성된 뼈 같은 ECM 수영장 크기, 운명 결정 및 MSCs12,,1314의 계보 진행을 조절할 수 있습니다. 또한, 결과 뼈 형성과 재생15,,1617중 자극 세포 프로세스 osteogenic 활동을 제공 하는 임상 의미 증거.
이 문서에서는, 우리의 그룹 수정 모델과 3 차원 장기 문화에 대 한 유리한 대안을 설정합니다. OS 셀 조직 파생 벰 주입 플라스틱 2 차원 문화에 비해 쉽게 heterogeneously 엽 형 제시. 벰에서에서 파생 된 사이트별 동종 조직 쇼 그것의 극적인 이용으로 운영 체제에 대 한 네이티브 틈새 체 외에서 세포 고 운영 체제 이론 및 임상 연구에 큰 잠재력이 있다. 이 특징이 벰 플랫폼 간단 하지만 생체 외에서 연구를 위한 효율적 이며 여러 암 모델링에 확장 될 수 있습니다.
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Protocol
동물 관리 및 사용은 실시 건강 가이드의 국가 학회에 따르면 치료 및 사용의 실험실 동물 (NIH 간행물 NO.80-23, 1996 년에서 개정)에 대 한는 동물 윤리 위원회의 썬 얏-센 대학교에서 승인 후.
1. 뼈 준비
- 4를 6 주 된 BALB/c 마우스 (없이 섹스 관련 요구 사항)를 가져옵니다. 자 궁 경부 전위에 의해 aseptically 마우스를 안락사 하 고 신선한 비 골, 경골 및 대 퇴 골 한 hindlimb에서 불 임 수술가 위로 잘라. 상피 조직 벗기십시오 고가 위 핀셋을 사용 하 여 가능한 부드러운 조직을 많이 제거.
- 살 균 10 m m 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 6 cm 접시에 혈액을 제거를 두 번와 다리 뼈를 씻어. 3 분, 75% 에탄올에 뼈를 담 궈 후 PBS로 두번 씻어. 깨끗 한 뼈 개월까지 필요한 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브-80 ° C에서 살 균 PBS에에서 저장할 수 있습니다.
참고: 모든 다음 단계에 사용 하는 PBS는 10 mM 포43−.
2. 뼈 demineralization 및 decellularization
- 실내 온도에, 냉동된 뼈를 녹여 하 고 다시 동결-80 ° C에서 1 헤 셀 세포 및 조직 분석에 대 한 2-3 회 freeze-thaw 주기를 뼈를 주제에 대 한.
- 0.5와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 뼈를 품 어 뼈의 완전 하 고도 범위를 보장 하기 위해 부드러운 락/동요와 락 플랫폼 또는 궤도 통에 실 온에서 하룻밤 N HCl.
참고: 뼈는 산에 모션 동안 완전히 몰입 하 고 과정에서 정착 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. HCl 솔루션의 볼륨은 뼈의 10 배 이상 이어야 한다. - Decalcification, 후 완전히 HCl 솔루션을 가만히 따르다와 흐르는 물에 1 시간을 위해 린스. 그런 다음 락 플랫폼 또는 궤도 셰이 커에 증류수 세척 당 15 분 동안 두 번 뼈를 씻어.
참고: 솔루션 또는 물 세척 사이 및 최종 세척 후 증류수를 완전히 제거 해야 합니다. - 메탄올의 1:1 혼합 광된 뼈에 지질 및 실내 온도10에서 1 시간에 대 한 주석 호 일 포장 50 mL 원심 분리기 튜브에 클로 프롬을 추출.
- 그런 다음 전송 30 분에 대 한 주석 호 일으로 감싸 메탄올의 다른 튜브에 뼈 완전히 메탄올을 제거 하 고 린스 부드럽게 흔들어와 15 분 동안 두 번 증류수. 최종 세척 수를 가만히 따르다 하 고 무 균 조건 하에서 다음 단계를 진행 합니다.
참고: 추출 단계에서 라이트는 클로 프롬 분해를 방지 하기 위해 피해 야 한다. 혼합물은 빛-내성 컨테이너에 저장할 수 있습니다 또는 원심 분리기 튜브 깡통 호 일으로 감싸. 모든 처리를 수행 하 고 겸손 한 회전 또는 모션 락 아래 단계를 씻어. - 6 cm 3 분 살 균 PBS 가진 접시에 뼈를 헹 구 고 새로운 50 mL 원심 분리기 관으로 뼈를 전송. 튜브에 40 mL 살 균 0.05% 트립 신-EDTA (테)를 추가 하 고 37 ° C18에서 CO2 배양 기에서 23 h에 대 한 뼈를 품 어.
- 테 솔루션을 무시 하 고 살 균 PBS 90 μ g/mL 암 피 실린과 90 μ g/mL 대 보충으로 두 번 씻어. 마지막 decanting 후 완전히 씻어 PBS, 40 mL 살 균 PBS를 가진 보충. 부드러운 락 또는 항생제 담가 흔들어 실 온에서 24 h에 대 한 철저 하 게 씻는 다.
참고:이 다음 단계에 사용 되는 모든 살 균 PBS 90 μ g/mL 암 피 실린 및 90 μ g/mL 대 포함 한다. 회전 또는 모션 락 하룻밤 세척 기 공 공간의 효과적인 살 균을 달성 하기 위해 항생제와 오랜 기간 철저 한 침수에 대 한 수행 됩니다. - PBS를 제거 하 고 살 균 PBS 가득 신선한 50 mL 원심 분리기 관으로 뼈를 전송. 준비는 광 고 decellularized 뼈 뼈 기질 (괜 찮) 라고 하며 2 개월 필요할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 셀 시드 및 문화
- 벰 4 ℃ 냉장고에서 꺼내와 두 번 30 s, 다음 PBS와 린스에 대 한 75% 에탄올에 몰두. 깨끗 한 6 잘 셀 문화 접시에 벰 전송. 2 mL 전체 문화 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간/F12 (DF12) 5% 태아 둔감 한 혈 청, 90 μ g/mL 암 피 실린 및 90 μ g/mL 대 포함)를 추가 합니다. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 벰 품 어
- 인간의 OS 셀 선을 (MNNG/호 및 밀리 그램-63)를 가져옵니다. 표시기로 페 놀 레드를 포함 하는 100 μ PBS를 가진 105 OS 셀 x 약 1.0를 일시 중단 합니다.
참고: 더 나은 추적 하 고 관찰 하는 3 차원 벰 모델 내에서 다층 셀, MNNG/호 및 밀리 그램-63는 감염 lentiviral 벡터 형광 mCherry와 녹색 형광 단백질 (GFP). - 후에 괜 찮은 매체에 완전히 젖 었, OS 셀에 삽입할 벰 인접 또는 말 초 뼈에서 바늘 벰의 골 수 구멍에 도달 하면. 습도 5%에서 2 h의 최소 운영 체제-벰 모델을 품 어 삽입 된 셀 단단히 벰 준수 되도록 37 ° C에서 CO2 분위기.
참고: 사전 따뜻한 세포 배양에 대 한 모든 미디어 사용. 세포 배양에 사용 하는 인큐베이터는 습도 37 ° c.에 5% CO2 분위기 - 완전히 하룻밤 37 ° c.에 CO2 배양 기에서에서 벰 문화의 표면 코트 접시에 1 mL 완전 한 문화 매체를 추가
- 6 잘 플레이트 살 균 족집게와 refeed 1 mL 신선한 문화 매체의 새로운 우물으로 부드럽게 전송 OS 벰 모델. 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 14 일에 대 한 모델을 문화 고 문화 매체 운영 체제 셀의 확산 상황에 따라 새로 고칩니다.
- 문화 과정에서 거꾸로 형광 현미경 중간 색상 및 셀 상태를 모니터링 하십시오. OS 셀 접시를 확장, 부드럽게 다른 살 균 족집게와 새로운 운영 체제-벰 모델을 전송 합니다.
참고: 문화 매체는 대부분 포유류 세포 배양에 대 한 최적의 pH 값은 pH 7.4에 밝은 빨간색입니다. 매체 주황색 또는 노란색으로 변하면, 즉시 OS 셀에 대 한 건강 한 환경을 유지 하기 위하여 매체를 새로 고칩니다. - 핀셋으로 새로운 잘으로 OS 벰 모델을 전송 하 고 문화 매체를 제거 하는 PBS로 부드럽게 씻어. 그리고, 15 mL 원심 분리기 튜브로 전송 조직학 식별에 대 한 버퍼링 10% 포 르 말린으로 고정 합니다.
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Representative Results
Demineralization decellularization 후에, 벰 강한 탄력성과 기본 마우스 뼈에 비해 끈기와 반투명 것 처럼 보인다. 찌 꺼 기를 작은 근육 및 골 수 구멍의 공간은 (그림 1A, B) 명확 하 게 관찰 될 수 있다. 벰의 효과적인 decellularization를 확인 하려면 벰 파라핀에 고정, 후 포함 이며 다음 되며 오신 (H & E) 얼룩에 대 한 3-5 μ m 섹션으로 슬라이스. 세포 핵의 철저 한 제거는 밝은 필드 영상으로 표시 됩니다. 자연 다공성 구조와 콜라겐 네트워크 배치 decellularized 벰 (그림 1C, D)에 잘 유지 됩니다. 또한, 네이티브 뼈 (그림 1E)에 비해 벰 decellularized immunohistochemical (IHC) 어 콜라겐 IV 설명에 ECM 분 대에 손상 하는 콜라겐과 같은 뼈 매트릭스의 주된 유기 구성의 얼룩. 따라서, 벰 OS 셀 시드 및 확산에 대 한 좋은 생체 적합성과 적합 하 고 유망한 발판을 제공 합니다.
MG-63 세포 단층 문화 (그림 2A, B)에 섬유 모양의 spindled 셰이프를 하는 동안 MNNG/호 셀 가늘게 vacuolated 세포질와 매우 비정형 형태를 전시 한다. OS 환자에서 조직학 섹션 둥근 또는 다각형 셀, anisonucleosis와 여러 mitoses (그림 2C) 중요 한 세포질 pleomorphism 표시 됩니다. 생존 및 벰 모델의 품질을 확인 하려면 두 셀 라인 벰의 골 수 구멍에 주입 하 고 14 일 문화 (그림 3A, B) 중 형광 이미징 통해 모니터링할. H & E 얼룩과 조직학 단면도 OS 셀 근육 잔류물에 연결 및 두께 더미로 성장 또는 뼈 매트릭스 따라 준수과 공개 확산. 과 endosteum OS 셀의 확장에 의해 침투 된다. 기 막히게, OS 벰 모델의 세포 성장 패턴 2 차원 판 문화에서 다. 그림 3C에서 볼 수 있듯이 OS 셀 decellularized 벰 보여 매우 이질적인 형태는 운영 체제 섹션의 cytopathologic 기능에 유사한. 일부 운영 체제 셀 수가 뼈와 골 수 구멍에서 찾기는 구형 및 일부 확산 밖으로, 반면 셀과 endosteum 휴식 매우 길쭉한 세포 핵 pleomorphism 동반으로 전파 됩니다. 세포 활동 또한 장기 문화에 큰 장점을 보여줍니다 Ki67 immunostaining를 사용 하 여 결정 됩니다. 또한, 운영 체제 셀 벰 문화에 높은 뼈 매트릭스 당단백질 익스프레스-시스테인 (SPARC/osteonectin)에서 풍부 하 고 산 성 단백질을 분 비-osteoid 매트릭스 (그림 3D)에 대 한 특정입니다.
그림 1 : 마우스의 구조상 특성 decellularized 벰. (A, B) 마우스 기본 (A) 및 decellularized (B) 뼈의 개요. (C, D) Decellularization H & E 마우스 기본 경골 (C)의 얼룩이 지 고 뼈 (D) decellularized에 의해 평가 되었다. 되며 물 핵 기본 마우스 경골은 괜 찮에만 관찰 될 수 있었다. (E) IHC 어 콜라겐 IV decellularization 후 마우스 경골에서 보존은 ECM의 주요 구성 요소를 검색 하기 위해 콜라겐에 대 한 얼룩. 노란색 화살표 지적 풍부한 콜라겐 나 수가 뼈 및 조밀한 뼈 내의 풍부한 콜라겐 IV 파란색 화살표 지적 한다. 스케일 바 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 운영 체제의 cytomorphological 특성. (A, B) 인간의 OS 셀 라인 MNNG/호 (A) 및 밀리 그램-63 (B) 플라스틱 플라스 크 문화에 확장 합니다. 눈금 막대 100 μ m =. (C) H & E OS 환자의 얼룩과 조직 섹션. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 운영 체제의 decellularized 뼈 세포 세포 외 매트릭스 모델. (A, B) 시드 및 벰에서 경작 후 형광 현미경 검사 법에 의해 MNNG/호 (A)와 GFP 식 (녹색) 이미지의 밀리 그램-63 (B)의 대표 mCherry 식 (레드) 이미지. 눈금 막대 100 μ m =. (C) H & E 분석 벰에서 경작 후 주입된 MNNG/호 및 밀리 그램-63 셀의 전형적인 형태를 보여주는. (D) IHC 벰 모델에 14 일 동안 배양 후 MNNG/호 셀 Ki67 및 SPARC 식 수준에 분석. 대표 이미지는 스테인드 Ki67와 SPARC 직렬 섹션의 두 세트. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
일반적으로, OS로 osteoblastic 분류 될 수 있다, 그것의 지배적인 더 구성 요소에 따라 chondroblastic, 및 fibroblastic 하위. 그것의 예 지는 그것의 해부학 사이트에 뿐만 아니라 더 매개 변수 뿐만 아니라 의존 합니다. 그것은 extraosseous 사이트19그리고 뼈의 표면에 (intramedullary 또는 intracortical 구획)에서 뼈 안에 발생할 수 있습니다. 출현 및이 운영 체제의 종양 이벤트 및 증가 개발 및 마이그레이션 먼 장기20,21,22에 이어서 적절 한 microenvironmental 부스트의 활용으로 해명 될 수 있습니다. ,23. 미스터리 OS 진화 하는 동안 적절 한 모델 OS 환경 및 틈새를 대상으로 임상 의미를 윤곽을 해독 수 있습니다.
플라스틱 접시 또는 체 외에 플라스 크에서 재배는 역동적이 고 복잡 한 생물 학적 microenvironment을 정리 거의 수 있습니다. 커다란 진보 다양 한 전 임상 모델 (예: 마우스, zebrafish, 개)는 다리를 흉내 낸 선언 되었고 병 조사 및 약물 개발4,,2425, 에 적용 26 , 27 , 28. 연구원은 아직 그들의 불편과 고통을 실험 중 실험 동물에 대 한 우려. 생체 외에서 3 차원 모델 처럼 우리의 decellularized 벰 모델은 이점을 편의성, 빠른 작업 및 비용 절약; 그것은 가능한 세포 나 조직, 장기 및 쉬운 유지 보수를 제공 합니다 이며 또한 기본 생물학 상황에 플라스틱 문화를 보다 가까이. 그것은 phenotypic이 성공29와 OS dedifferentiation의 규제 메커니즘을 보여주는 우리의 연구에 사용 되었습니다.
이 프로토콜 마우스에서 조직 파생 벰을 생성 하기 위해 타당성을 명확히 하 고 조직에서 인간, 쥐 및 개에 사용할 수 있습니다. 성공적인 설립과 벰의 응용 프로그램에 대 한 가장 중요 한 단계는: (i) 세포 파편;의 제거를 완료 (2) 살 균, 건강 한 문화 상태;의 유지 보수 (iii) 수동 손 재주 고 부드러운 pipetting 주입, 전송 및 운영 체제-벰 모델의 문화.
다른 보고 된 프로토콜 일반적으로 가압 또는 화학, 효소 치료, Triton X-100 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 같은 DNase/RNase 솔루션 강력한 decellularization30,31 달성 하기의 조합 사용 . 세제와 decellularization를 겪 습 연골 조직 있다32를 포함 한 ECM 구성 요소를 제거 하려면 표시 되었습니다. 최고의 범위 더 그대로 벰 정리를 온건 하면서도 강력한 decellularization 방법은 해체 및 핵심 부품의 손상 및 뼈 환경의 기본 아키텍처를 피하기 위해 여기 수행 됩니다.
그러나, 그것은이 OS 벰 모델 흐르는 매체, 결과적으로 산소와 영양분의 고르지 못한 배급에 지도 없이 접시에 휴식 하는 것을 소홀히 될 수 없습니다. 혈관 네트워크 통신 및 상호 작용의 microenvironmental 신호를 조절 하는 데 도움이 하 고 항상성 뼈 다른 셀 하위 필요가 고려24, , 3334, 로 35. 바라 건 대,이 모델 다른-첨단 공학 기술 운영 체제 연구와 가이드 정밀 의학에 결합 될 것 이다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자 가치 뼈 기질 장비의 건설 기간 동안 그의 뛰어난 기술 지원에 대 한 그녀의 행정 지원 및 긴 Zhao Liuying 첸의 지원. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (31871413)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
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