Summary
骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic の多様性を研究するための理想的なモデルを提供するため、適切な足場として使用できます。
Abstract
骨肉腫 (OS) は、最も一般的な非常に積極的な原発性骨腫瘍です。診断や予後の難しさと共に解剖学的および組織学的変化が特徴です。OS には、際と表現型異種癌細胞が装備されています。骨の微小環境要素は腫瘍の多様性と疾患の進行が証明しました。骨の細胞外マトリックス (BEM) は、微細構造のマトリックスおよびネイティブの細胞外マトリックスの生化学成分を保持します。この組織固有のニッチは、OS の細胞播種の増殖有利と長期的な足場を提供します。この資料では、境界要素法モデルとそのさらに実験アプリケーションの準備のため、プロトコルを提供します。OS 細胞が成長し、OS 臨床検体の病理組織学的複雑さと一貫性のある複数の表現型に分化することができます。モデルには多様な形態と遺伝子異常や根本的な規制メカニズムとの関連付けの可視化ができます。相同性の高い人間の OS、としてこの BEM OS モデルを開発し、病理学および OS の臨床研究に適用できます。
Introduction
骨肉腫 (OS) は、思春期成長分野、長骨の骨幹端が積極的に通常発生します。OS の影響を受けたサイトの 80% 以上には、脛骨近位端、上腕骨近位成長板1の位置に対応する、遠位、近位大腿骨の骨幹端のための好みがあります。OS には、間葉系組織学的特徴とグレードのかなりの多様性と複数の細胞サブタイプが装備されています。証拠は、起源2,3,4、5の細胞と間葉系幹細胞 (Msc)、骨芽細胞前駆体コミットとペリサイトをサポートします。これらの細胞は、遺伝やエピジェネティックな変化を蓄積し、OS を生じさせる特定の骨アイソレータケージ信号の影響の下でできます。組み込みと外因性のメカニズムは、ゲノム不安定性と複数の形態学的および臨床的表現型6,7OS の不均一性。個別療法や新薬のスクリーニングは、新しいモデルが不均一性やその他の疾患に対して生成される必要があります。
OS は、内骨の悪性固形腫瘍です。複雑さと周囲の微小環境要素の活動、腫瘍の場所が異なる OS 細胞に表現型および機能に違いを与えます。骨の細胞外マトリックス (BEM) は、鉱物の堆積と骨リモデリングの構造および生化学的足場を提供します。細胞外マトリックス (ECM) の有機性部分主に成っているタイプ私ハイドロキシアパ タイト8の形でリン酸カルシウムの石灰化部分を作曲しながら骨芽細胞系細胞から分泌されるコラーゲン。ECM ネットワークの動的な役割は細胞接着を調整することは、差別化、クロストーク、組織機能メンテナンス9。
脱灰の BEM と ECM のゲルは、細胞培養で正常に使用されているおよび細胞増殖10,11を高めることができます。合成の骨のような ECM は、プールのサイズ、運命の決定と MSCs12,13,14系統進行を調整できます。さらに、結果は、骨形成と再生15,16,17の中に刺激的な細胞プロセスによって貪食を提供する臨床的意義を証拠します。
この記事で私たちのグループは、変更されたモデルと長期培養の好ましい代わりを確立します。OS 細胞組織由来 BEM に注入はプラスチックの二次元文化に比べて容易に異質間葉系表現型を紹介します。境界要素法はその劇的な利点サイト固有の同種組織をから派生した OS のネイティブ ニッチをされている培養細胞し、OS 理論と臨床的研究では大きな可能性があります。この特徴の BEM プラットフォームはシンプルですが生体外で研究効率と他臓器重複癌のモデリングに拡張可能性があります。
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Protocol
アニマル ・ ケアおよび使用の行われています健康ガイドの国家機関によると、ケア実験の動物の使用 (NIH 文書第 80-23、1996 年に改訂) 孫逸仙大学動物倫理委員会から承認された後。
1. 骨の準備
- 6 週齢 BALB/c マウス (なしセックス固有要件) に 4 を取得します。頚部転位によって無菌マウスを安楽死させるし、新鮮な腓骨、脛骨と大腿骨、後肢を滅菌手術用はさみでカットします。上皮性のティッシュをはがし、はさみとピンセットを使用して、できるだけ多くの軟部組織から削除します。
- 滅菌 10 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 6 cm 皿に血を削除する 2 回と脚の骨をすすいでください。3 分、75% エタノールに骨を浸すし、PBS で 2 回すすぎます。きれいな骨は、3ヶ月必要になるまで-80 ° C で滅菌 PBS で滅菌 50 mL 遠心チューブに格納できます。
メモ: 次のすべての手順で使用される PBS 10 mM PO43−があります。
2. 骨の脱灰・ decellularization
- 常温、冷凍骨を解凍し、再び凍結-80 ° C で 1 h. は対象セル換散およびティッシュの破壊のための以上 2-3 凍結融解の骨の。
- 0.5 と滅菌 50 mL 遠心管中骨を孵化させなさい骨の完全かつもカバレッジを確保する穏やかなロッキング振動ロッキング プラットフォームまたは軌道シェーカーで室温で一晩 N HCl。
注: 骨完全酸のモーション中に没頭しているし、処理中に解決してはいけないことを確認します。塩酸溶液の量は、骨の 10 倍以上にする必要があります。 - 脱灰後、塩酸溶液を完全にデカント、1 h の流水ですすいでください。ロッキングのプラットフォームまたは軌道シェーカーに蒸留水で洗浄あたり 15 分間 2 回骨を洗います。
メモ: は、ソリューションまたは蒸留水水洗浄の間最終的な洗浄の後、完全に削除することを確認してください。 - メタノールの 1:1 混合物と脱灰骨の脂質と部屋の温度10の 1 h の錫箔巻き 50 mL 遠心管中のクロロホルム抽出します。
- その後、転送メタノール 30 分の錫箔巻きの別の管に骨メタノールを完全に削除し、すすぎは軽く振とうしながら 15 分間 2 回蒸留水。最終的な洗浄水をデカントし、無菌状態の下で次の手順に進みます。
注: 抽出段階では、光はクロロホルムの分解を防ぐために避けなければなりません。混合物は、光耐性コンテナーに格納できるまたは遠心管はスズ箔で包まれました。すべての治療を行い、ささやかな回転やロッキングの下の手順を洗います。 - 3 分間滅菌 PBS の 6 cm 皿の骨を洗浄し、新しい 50 mL の遠心管に骨を転送します。チューブに 40 mL 滅菌 0.05% トリプシン-EDTA (TE) を追加し、37 ° C18で CO2インキュベーターで 23 時間骨を孵化させなさい。
- TE 液を捨て、90 μ g/mL アンピシリンと 90 μ g/mL カナマイシンを添加した滅菌 PBS で 2 回すすいでください。デカント決勝後 PBS を完全に洗って、40 mL 滅菌 PBS で補充します。穏やかな揺動するか抗生物質のソークの揺れで部屋の温度で 24 時間を徹底的に洗浄します。
注: この手順と次の手順で使用されているすべての滅菌 PBS には 90 μ g/mL アンピシリンと 90 μ g/mL カナマイシンが含まれています。回転やロッキングの下一晩洗浄、気孔スペースの効果的な滅菌を達成するために抗生物質を浸漬を徹底的な長時間実行されます。 - PBS を取り外して滅菌 PBS でいっぱい新鮮な 50 mL の遠心管に骨を転送します。準備脱灰して 2 ヶ月必要になるまでの 4 ° C で保存できる脱骨骨細胞外マトリックス (BEM) と呼びます。
3. 細胞播種と文化
- 4 ° C の冷蔵庫から解法を取り出すし、2 回 30 秒、その後、PBS で洗浄するために 75% エタノールでそれを浸します。きれいな 6 も細胞培養プレート上に境界を転送します。2 mL の完全培 (ダルベッコ改変イーグルの中/F12 (DF12) を 5% ウシ胎児血清、90 μ g/mL アンピシリンおよび 90 μ g/mL カナマイシンを含む) を追加します。37 ° C で CO2インキュベーターで一晩 BEM を孵化させなさい
- ヒトの OS 細胞株 (MNNG/HOS と MG 63) を取得します。指標としてフェノールレッドを含む 100 μ L の PBS で 105 OS 細胞 x 約 1.0 を中断します。
注: に追跡し、三次元境界要素法モデル内で多層細胞観察、MNNG/HOS と MG 63 に感染しているレンチウイルスベクター蛍光 mCherry と緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現します。 - 解法は完全に培地に浸漬後、は、針が BEM の髄腔に達したら BEM に近位または遠位の骨端から OS セルを挿入します。加湿 5% で 2 h の最小の OS 境界要素法モデルをインキュベート挿入された細胞はしっかりと境界要素法に従うように 37 ° C で CO2雰囲気。
注: は、細胞培養で使用されるすべてのメディアを事前暖かい。細胞培養用インキュベーターは、加湿が 37 ° C で 5% CO2の大気 - 37 ° C で CO2インキュベーターで一晩境界文化の表面を完全にコートにプレートに完全培地 1 mL を追加します。
- 6 ウェル プレート滅菌ピンセットや新鮮な培地 1 mL の再フィードの新しい井戸の中へ優しく転送 OS 境界要素法モデル。37 ° C で CO2インキュベーターで 14 日間培養モデルと OS 細胞の増殖状況に応じて培養液を更新します。
- 文化プロセス中に倒立蛍光顕微鏡下で培地の色とセルの状態を監視してください。OS 細胞をプレートに展開、そっと別滅菌ピンセットでうまく新しい OS 境界要素法モデルを転送します。
注: 培養培地は、ほとんどの哺乳類の細胞培養のための最適な pH 値である ph 7.4 では、鮮やかな赤です。培地はオレンジ色あるいは黄色に変身する場合、すぐに OS 細胞の健康的な環境を維持するために媒体を更新します。 - ピンセットで新しい井戸に OS 境界要素法モデルを転送し、培養培地を削除する PBS で優しく洗い。15 mL 遠心管に転送し、組織学的同定のための 10% ホルマリンで固定します。
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Representative Results
脱灰と decellularization、BEM は強い弾力性と粘り強さのネイティブ マウスの骨に比べて半透明に表示されます。少し筋肉残渣と髄腔の空間明確に観察できる (図 1A, B)。境界要素法の効果的な decellularization を決定するには、境界要素法は固定後パラフィンに埋め込まれ、ヘマトキシリン-エオシン (H & E) 汚損のため 3-5 μ m のセクションにスライスします。明視野イメージングによる細胞核の徹底的な除去が表示されます。自然な多孔質構造とコラーゲンのネットワークの配置も、脱境界要素法 (図 1C D) で維持されます。さらに、I と IV コラーゲンで ECM の部品の破壊を示すコラーゲンなどの骨基質の主要な有機成分の染色 (IHC) は BEM (図 1E) ネイティブの骨と比較して脱。したがって、境界要素法は、OS の細胞播種と増殖のため偉大な生体適合性を適切かつ有望な足場を提供します。
MNNG/HOS 細胞は、MG 63 細胞単層培養 (図 2A、B) で線維芽細胞のような紡錘形の形を持っている間に細かく胞細胞質を有する高度異型形態を展示します。OS 患者から組織切片では、円形または多角形の細胞、掻爬複数有糸分裂 (図 2C) と重要な細胞の多形が表示されます。、生存率および境界要素法モデルの品質を確認するには、両方の細胞は BEM の髄腔に注入しを 14 日文化 (図 3A, B) における蛍光イメージングによる監視します。H & E 染色標本では、OS 細胞が筋残基を付けると太い杭に成長や骨に沿って付着し、増殖を明らかにします。骨膜と骨内膜は、OS 細胞の膨張が潜入しています。驚くほど、OS 境界要素法モデルのセル成長パターンは二次元板文化と異なります。図 3Cに示すように、decellularized 境界上の OS のセルは OS セクションの難渋のような非常に異種の形態を表示します。海綿骨と髄腔内検索いくつかの OS 細胞は球状と部分的に普及して、骨膜と骨内膜に沿って休んで細胞は非常に細長い細胞核の大小不同を伴ってに広がっているに対し。細胞活性、キ67 免疫染色も長期的な文化の偉大な利点を示していますを使用して決定されます。また、OS 細胞境界要素法における高骨マトリックス糖蛋白質を表現-酸性およびシステイン (SPARC/オステオネクチン) で豊富な分泌-類骨マトリックス (図 3D) のために特定であります。
図 1: マウスの構造特性脱 BEM 。(A, B)マウス ネイティブ (A) と脱 (B) 骨の概要です。(C, D)Decellularization は、H & E 染色マウス ネイティブ脛骨 (C) と脱骨 (D) によって評価されました。解法ではなくネイティブ マウス脛骨で、核はヘマトキシリンで染色を観察できます。(E) IHC 染色コラーゲン I とコラーゲン IV decellularization 後マウス脛骨で保持されている ECM の主要なコンポーネントを検出します。黄色の矢印を指摘する豊富なコラーゲン私海綿骨と皮質骨内の豊富なコラーゲン IV を青い矢印ポイント内にあります。スケール バー = 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: OS の細胞形態学的特徴。(A, B)人間 OS 細胞 MNNG/HOS (A) および MG 63 (B) プラスチック製フラスコ培養で展開します。スケールバー = 100 μ m。(C) H & E 染色 OS 患者の病理組織学的セクションです。スケールバー = 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脱骨細胞 OS の細胞外マトリックス モデル。(A, B)シードおよび境界要素法で培養後蛍光顕微鏡による式 (グリーン) イメージ MG 63 (B) を MNNG/HOS (A) および GFP の代表 mCherry 式 (赤) イメージ。スケールバー = 100 μ m。(C) H & E 解析の境界要素解析における養殖後注入 MNNG/HOS および MG 63 細胞の典型的な形態を示します。(D) IHC MNNG/HOS 細胞境界要素法モデルで 14 日間培養後のキ67 と SPARC の発現レベルの分析。代表的な画像は、連続切片キ67 SPARC とステンド グラスの 2 つセットです。スケールバー = 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
一般的には、OS は、骨芽細胞分類できます、chondroblastic と fibroblastic は、その支配的な組織のコンポーネントによってサブタイプします。その予後はだけではなく、また、その解剖学的部位の組織学的パラメーターに依存します。それは表面の骨と extraosseous サイト19(髄または皮質内コンパートメント) で骨の内部に起こるかもしれない。出現および OS の不均一性、発癌イベントや遠隔臓器20,21,22 に、増加の開発と移行に続く十分なアイソレータケージ ブーストの活用として解明されうる ,23。OS 環境やニッチをターゲットの臨床的意義を概説する適切なモデル OS の進化過程で謎を解読する可能性があります。
プラスチック製の食器または培養フラスコ栽培ほとんどダイナミックで複雑な生物の微小環境に要約するだろうが。長足様々 な前臨床モデル (例えば、マウス、ゼブラフィッシュと犬) の骨肉腫を模倣されている宣言し、病態調査と薬剤開発4,24,25,に適用26,27,28。 まだ、その不快感と実験の間に苦しむための実験動物の懸念している研究者。In vitro三次元モデル decellularized 境界要素法モデルによる利便性、迅速な操作とコスト削減の利点を持っているようそれは実行可能な細胞や組織、長期的な簡単なメンテナンスを提供します、またプラスチック文化よりもネイティブの生物学的状況に近いです。それは、表現型多様性と成功29と OS の脱分化の調節機構を実証研究に使用されています。
このプロトコルはマウスから組織由来の境界を生成する可能性を明らかにし、組織からヒト, ラット, イヌの使用可能性があります。成功確立および境界要素法の適用のための最も重要な手順は、: (i) は細胞の残骸の除去完了(ii) 滅菌、健全な文化の状態の維持(iii) 手先の器用さと注入、転送、OS bem の文化の中に穏やかなピペッティングします。
他の報告されたプロトコルは一般的に加圧や強力な decellularization30,31 を達成するためにトリトン X-100、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、DNase/RNase ソリューションなどの化学的・酵素的治療の組み合わせを採用します。.洗剤と decellularization を受け、軟骨組織は、グリコサミノグリカン32を含む ECM コンポーネントを削除する示されています。最大限によりそのまま境界要素法を要約するには、適度なまだ強力な decellularization メソッドが解散し、主要なコンポーネントの損傷と骨環境のネイティブ アーキテクチャを避けるためにここで実行されます。
しかし、この OS 境界要素法モデルが流れる媒体、その結果、酸素や栄養素の偏在につながるなしプレートで休んだことを無視することです。血管網とその他の細胞のサブタイプ、コミュニケーションおよびアイソレータケージ信号の相互作用を調節し、骨の恒常性考察24, 33,34,考慮する必要があります35. うまくいけば、このモデルは OS 研究ガイド精密医療に光を当てるに他のハイテク技術と結合されます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、骨細胞外マトリックス足場の構築時に優れた技術的な援助の彼女の行政支援と長い趙柳営陳のサポートを値します。本研究は、中国の国家自然科学基金 (31871413) からの助成金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
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