Summary
Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.
Abstract
Osteosarcoma (OS) è il più comune e un tumore altamente aggressivo e primari dell'osso. È caratterizzato da variazioni anatomiche e istologiche assieme alle difficoltà diagnostica o prognostica. OS comprende cellule tumorali genotipico e fenotipico eterogenea. Elementi del microambiente dell'osso sono dimostrati di account per progressione di malattia e di eterogeneità del tumore. Matrice ossea extracellulare (BEM) conserva le matrici microstrutturali e componenti biochimici della matrice extracellulare nativa. Questa nicchia di tessuto-specifica fornisce un'impalcatura favorevole e a lungo termine per proliferazione e semina cellulare di OS. Questo articolo fornisce un protocollo per la preparazione del modello BEM e la sua ulteriore applicazione sperimentale. Le cellule OS possono crescere e differenziarsi in fenotipi più coerenti con la complessità istopatologica di campioni clinici di OS. Il modello consente inoltre la visualizzazione delle diverse morfologie e la loro associazione con alterazioni genetiche e meccanismi di regolazione sottostante. Come omologo umano OS, questo modello di BEM-OS possa essere sviluppato e applicato alla patologia e ricerca clinica del sistema operativo.
Introduction
Osteosarcoma (OS) si presenta solitamente in zone, le metafisi delle ossa lunghe, in attiva crescita durante l'adolescenza. Più dell'80% dei siti colpiti da OS hanno preferenza per la metafisi della tibia prossimale e Omero prossimale, nonché sia distale e prossimale di femore, corrispondente alla posizione della crescita piastra1. OS comprende molteplici sottotipi di cellule con proprietà mesenchymal e considerevole diversità nelle caratteristiche istologiche e grado. Evidenze supportano le cellule staminali mesenchimali (MSCs), precursori impegnati osteoblasti e periciti come le cellule di origine2,3,4,5. Queste cellule possono accumularsi le alterazioni genetiche o epigenetiche e dar luogo a OS sotto l'influenza di determinati segnali microambiente osseo. Meccanismi sia intrinseci sia estrinseci causare l'instabilità genomica e l'eterogeneità del sistema operativo, con molteplici fenotipi morfologici e clinici6,7. Per terapie individualizzate o screening di nuovi farmaci, nuovi modelli devono essere generati per contro eterogeneità o altri disordini clinici.
OS è un tumore solido maligno intraosseo. La complessità e l'attività del microambiente elementi circostanti conferire differenze fenotipiche e funzionali sulle cellule OS in posizioni diverse di un tumore. Matrice ossea extracellulare (BEM) fornisce un'impalcatura strutturale e biochimica per deposizione minerale e rimodellamento osseo. La parte organica della matrice extracellulare (ECM) consiste principalmente di tipo I collagene secreto dalle cellule osteoblastic lignaggio, mentre la relativa parte mineralizzate è composto da fosfato di calcio sotto forma di idrossiapatite8. Il ruolo dinamico delle reti di ECM è di regolare adesione cellulare, differenziazione, cross-talk e tessuto funzione manutenzione9.
Demineralizzata idrogeli BEM ed ECM sono stati utilizzati con successo nella coltura delle cellule e possono migliorare la proliferazione delle cellule10,11. Sintetizzato osso-come ECM può regolare la dimensione del pool, le decisioni destino e progressione di lignaggio di MSCs12,13,14. Inoltre, risultati della prova relativa importanza clinica per fornire attività osteogenica di processi cellulari stimolanti durante osso formazione e rigenerazione15,16,17.
In questo articolo, il nostro gruppo costituisce un modello modificato e alternativa favorevole per tridimensionale coltura a lungo termine. Cellule di OS iniettate il BEM tessuto-derivato presentano un fenotipo eterogeneo mesenchymal prontamente rispetto alla plastica culture bidimensionale. BEM derivato da Visualizza site-specific del tessuto omologo relativo vantaggio drammatico come essendo una nicchia nativa per OS cellule in vitro e ha un grande potenziale nella ricerca teorica e clinica di OS. Questa piattaforma BEM caratterizzata è semplice ma efficiente per la ricerca in vitro e può essere prorogata nel modellare i cancri multipli.
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Protocol
Uso e cura degli animali sono condotti secondo l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (pubblicazione NIH No. 80-23, riveduta nel 1996), previa approvazione del Comitato etica animale di Sun Yat-sen University.
1. osso preparazione
- Ottenere 4 ai topi BALB/c 6-settimana-vecchio (senza sesso-specifico requisito). Eutanasia di un mouse in modo asettico di dislocazione cervicale e tagliato di fresco perone, tibia e femore da un arto posteriore con forbici chirurgiche sterili. Staccare il tessuto epiteliale e quindi rimuovere tanto del tessuto molle possibili utilizzando forbici e pinzette.
- Sciacquare le ossa della gamba con soluzione fisiologica sterile 10 mM tamponato fosfato (PBS) due volte per rimuovere il sangue in un piatto di 6 cm. Immergere le ossa in etanolo di 75% per 3 minuti, poi sciacquare due volte con PBS. Le ossa pulite possono essere memorizzate in una provetta sterile da 50 mL con PBS sterile a-80 ° C per mesi fino a quando richiesto.
Nota: PBS utilizzato in tutti i passaggi seguenti ha 10 mM PO43.
2. osso demineralizzazione e decellularizzati
- Scongelare le ossa surgelate a temperatura ambiente e poi congelare di nuovo a-80 ° C per 1 h. soggetti le ossa a più di 2 – 3 cicli di congelamento-scongelamento per la ripartizione del tessuto e lisi cellulare.
- Incubare le ossa in una provetta sterile 50 mL con 0,5 N HCl durante la notte a temperatura ambiente in un agitatore a dondolo piattaforma o orbitale con dondolo/agitazione delicata per garantire una copertura completa e anche delle ossa.
Nota: Assicurarsi che le ossa sono interamente immersi durante il movimento nell'acido e non accontentano durante il processo. Il volume di HCl soluzione dovrebbe essere più di dieci volte a quella delle ossa. - Dopo la decalcificazione, decantare la soluzione di HCl completamente e sciacquare sotto l'acqua corrente per 1 h. Quindi, lavare le ossa due volte per 15min per lavaggio con acqua distillata in un agitatore a dondolo piattaforma o orbitale.
Nota: Assicurarsi di rimuovere completamente la soluzione o l'acqua tra un lavaggio e dopo il lavaggio finale con acqua distillata. - Estrarre i lipidi nelle ossa demineralizzate con una miscela 1:1 di metanolo e cloroformio in una provetta da centrifuga 50ml avvolta con carta stagnola per 1 h a temperatura ambiente10.
- Quindi, trasferimento le ossa in un altro tubo di metanolo avvolto con carta stagnola per 30 min. rimuovere completamente il metanolo e sciacquare con acqua distillata acqua due volte per 15min con agitando delicatamente. Decantare acqua lavaggio finale e procedere con le seguenti operazioni in condizioni sterili.
Nota: Durante la fase di estrazione, la luce deve essere evitata per prevenire la decomposizione di cloroformio. La miscela può essere conservata in contenitore resistente alla luce o una provetta da centrifuga avvolto con carta stagnola. Eseguire tutti i trattamenti e lavare passaggi sotto modesta rotazione o movimento. - Sciacquare le ossa in un piatto di 6cm con PBS sterile per 3 minuti e poi trasferire le ossa in una nuova provetta 50 mL. Aggiungere 40 mL sterile 0,05% tripsina-EDTA (TE) nel tubo e incubare le ossa per 23 h in incubatore a CO2 a 37 ° C18.
- Scartare la soluzione TE e lavare due volte con PBS sterile completati con ampicillina μg/mL 90 e 90 μg/mL kanamicina. Dopo la decantazione finale lavare completamente il PBS, rifornito con 40 mL di PBS sterile. Lavare accuratamente per 24 h a temperatura ambiente con dolce dondolo o agitazione per ammollo antibiotico.
Nota: Tutto il PBS sterile utilizzato in questa e le seguenti operazioni contiene 90 μg/mL ampicillina e 90 kanamicina μg/mL. Durante la notte lavaggio sotto rotazione o movimento vengono eseguite per immersione completa lunghi periodi con antibiotici per ottenere una sterilizzazione efficace degli spazi dei pori. - Rimuovere il PBS e trasferire le ossa in una provetta da centrifuga fresca 50 mL riempita con PBS sterile. Il preparato demineralizzata e decellularizzate ossa sono chiamate matrice ossea extracellulare (BEM) e possono essere memorizzate a 4 ° C per 2 mesi fino a quando richiesto.
3. semina e coltura delle cellule
- Estrarre il BEM dal frigorifero a 4 ° C e immergerlo in etanolo di 75% per 30 s, quindi risciacquare con PBS due volte. Trasferire il BEM su una piastra di coltura cellulare pulito 6-pozzetti. Aggiungere 2 mL di terreno cultura completa (Dulbecco modificato medio/F12 dell'Aquila (DF12) contenente 5% di siero bovino fetale, 90 μg/mL ampicillina e 90 kanamicina μg/mL). Incubare il BEM pernottamento in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
- Ottenere linee di cellule umane di OS (MNNG/HOS e MG-63). Sospendere circa 1,0 x 105 OS cellule con 100 μL PBS contenente rosso fenolo come indicatore.
Nota: Per meglio monitorare e osservare le cellule multistrate all'interno il modello tridimensionale di BEM, MNNG/HOS e MG-63 sono infettati con vettore lentivirale esprimendo mCherry fluorescente e proteina fluorescente verde (GFP). - Dopo il BEM è completamente imbevuto nel mezzo, iniettare le cellule OS nelle BEM da epifisi prossimale o distale, quando l'ago raggiunge la cavità midollare del BEM. Incubare il modello OS-BEM per un minimo di 2 h in un umidificata 5% CO2 atmosfera a 37 ° C per garantire le cellule iniettate aderiscano saldamente al BEM.
Nota: Pre-riscaldare tutti i media utilizzati per la coltura cellulare. L'incubatore utilizzato per la coltura cellulare ha un umidificata 5% CO2 ambiente a 37 ° C. - Aggiungere 1 mL di coltura completa nella piastra per rivestire completamente la superficie della cultura BEM pernottamento in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
- Trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un nuovo pozzo di 6 pozzetti con una pinzetta sterile e terreno di coltura fresco pila 1 mL. Il modello della coltura per 14 giorni in incubatore a CO2 a 37 ° C e aggiornare il terreno di coltura secondo la situazione di proliferazione delle cellule di OS.
- Monitorare lo stato delle cellule e di colore medio sotto il microscopio di fluorescenza invertito durante il processo di cultura. Quando le cellule OS espande alla piastra, trasferire delicatamente il modello OS-BEM a altro di nuovo bene con pinzette sterili.
Nota: Il terreno di coltura è rosso brillante a pH 7.4, che è il valore di pH ottimale per la coltura cellulare più mammifero. Se il mezzo si trasforma in giallo arancia o addirittura, aggiornare immediatamente il mezzo per mantenere un ambiente sano per le cellule di OS. - Trasferire il modello OS-BEM in un nuovo pozzo con pinzette e risciacquare delicatamente con PBS per rimuovere il terreno di coltura. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL, quindi fissare con formalina 10% tamponata per identificazione istologica.
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Representative Results
Dopo la demineralizzazione e decellularizzati, BEM sembra essere traslucido con maggiore resilienza e tenacia rispetto all'osso del mouse nativi. Un piccolo residuo di muscolo e lo spazio della cavità midollare può essere osservati chiaramente (Figura 1A, B). Per determinare l'effettiva decellularizzazione di BEM, BEM è inclusi in paraffina dopo la fissazione e quindi tagliata in 3 – 5 μm sezioni per la macchiatura dell'hematoxylin-eosina (H & E). La rimozione completa dei nuclei delle cellule è indicata da formazione immagine campo chiaro. La disposizione di una rete collagene e struttura porosa naturale è ben mantenuta in decellularizzati BEM (Figura 1C, D). Inoltre, la colorazione immunoistochimica (IHC) di predominante componenti organici della matrice ossea, come il collagene in che collagene IV e io non dimostrare nessun danno sui componenti della ECM decellularized BEM rispetto all'osso nativo (Figura 1E). Di conseguenza, BEM fornisce un'impalcatura adatta e promettente con ottima biocompatibilità per semina cellulare di OS e la proliferazione.
Le cellule MNNG/HOS presentano una morfologia altamente atipica con citoplasma finemente vacuolato, mentre le cellule MG-63 hanno forme filate fibroblasto-come nella cultura dello strato monomolecolare (Figura 2A, B). Il preparato istologico da un paziente di OS Visualizza significativo pleomorphism cellulare con cellule arrotondate o poligonali, anisonucleosi e più mitosi (Figura 2C). Per verificare la fattibilità e la qualità del modello BEM, entrambe le linee cellulari sono iniettate nella cavità midollare del BEM e monitorate tramite imaging di fluorescenza durante la cultura di 14 giorni (Figura 3A, B). Sezioni istologiche con colorazione H & E rivelano che cellule OS allegare ai residui di muscolo e crescono in spessore pile o aderiscano lungo matrice ossea e proliferano. Sia periostio ed endosteum sono infiltrati dall'espansione delle cellule di OS. Sorprendentemente, i modelli di crescita delle cellule del modello OS-BEM differiscono da cultura piastra bidimensionale. Come illustrato nella Figura 3C, cellule di OS sul BEM decellularizzato mostrano altamente eterogenea morfologia simile alle caratteristiche cytopathologic di una sezione di OS. Alcune cellule di OS individuazione in osso spugnoso e cavità midollare sono orientabili e parzialmente diffusa fuori, mentre le cellule di riposo lungo il periostio ed endosteum sono estremamente sparsi in cellule allungate, accompagnate da pleomorphism nucleare. L'attività delle cellule è determinata usando immunostaining Ki67, che mostra anche grandi vantaggi in colture a lungo termine. Inoltre, le cellule di OS nella cultura BEM altamente esprimono glicoproteina matrice ossea — secernuto proteina acida e ricca in cisteina (SPARC/osteonectin) — che è specifico per matrice osteoide (Figura 3D).
Figura 1 : Le caratteristiche strutturali del mouse decellularized BEM. (A, B) Panoramica di mouse nativo (A) e decellularizzate (B) dell'osso. (C, D) Decellularizzazione è stata valutata da H & E macchiatura della tibia nativo del mouse (C) e decellularized dell'osso (D). I nuclei colorati con ematossilina potrebbero essere osservati nella tibia del mouse nativi, ma non nel BEM. (E) IHC che macchia per collagene I e collagene IV per rilevare i componenti principali di ECM che si conservano nella tibia del mouse dopo decellularizzati. Freccia gialla punti fuori il collageno abbondante ho all'interno di osso spugnoso e freccia blu indica fuori le abbondanti del collageno IV all'interno dell'osso compatto. Scala bar = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Le caratteristiche di cytomorphological del OS. (A, B) Cellula umana OS MNNG/HOS (A) e MG-63 (B) espanse in coltura di boccetta di plastica. Scala bar = 100 μm. (C) sezione istopatologica con H & E la colorazione del paziente di OS. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caratterizzazione di OS cellule nell'osso decellularizzato modello di matrice extracellulare. (A, B) Rappresentante mCherry espressioni (rosso) immagine di MNNG/HOS (A) e GFP immagine di espressione (verde) di MG-63 (B) mediante microscopia a fluorescenza dopo la semina e la coltura in BEM. Scala bar = 100 μm. (C) H & E analisi risultati morfologia tipica delle cellule iniettate MNNG/HOS e MG-63 dopo la coltura in BEM. (D) IHC analisi sul livello di espressione di Ki67 e SPARC di MNNG/HOS cellule dopo la coltura nel modello BEM per 14 giorni. Le immagini rappresentative sono due insiemi delle sezioni di serie macchiate con Ki67 e SPARC. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In generale, OS possono essere classificati come osteoblastica, chondroblastic e fibroblastic i sottotipi a seconda della sua dominante componente istologica. Relativa prognosi dipende non solo dai parametri istologici ma anche sul suo sito anatomico. Può verificarsi all'interno delle ossa (nel intramidollare o vano intracortical), sulle superfici delle ossa e in siti extraosseous19. L'emersione e l'eterogeneità del sistema operativo può essere delucidate come una coniugazione di eventi oncogenici e un'adeguata Spinta microambiente, seguito dal crescente sviluppo e migrazione a organi distanti20,21,22 ,23. Mistero nel corso dell'evoluzione OS potrebbe essere decifrato con un modello adeguato per delineare le implicazioni cliniche di targeting l'ambiente del sistema operativo e nicchia.
Coltivazione in boccette in vitro o piatti di plastica difficilmente può ricapitolare il microambiente biologico dinamico e intricato. Grandi passi di vari modelli pre-clinici (ad esempio, mouse, zebrafish e cane) che imita l'osteosarcoma sono stati dichiarati e applicato a patogenesi indagine e droga sviluppo4,24,25, 26 , 27 , 28. ancora, i ricercatori hanno preoccupazione per gli animali da esperimento a causa del loro disagio e la sofferenza durante gli esperimenti. In vitro modelli tridimensionali come nostro modello BEM decellularizzato ha il vantaggio grazie alla sua convenienza, operazione veloce e risparmio; e offre lunga durata e facile manutenzione di cellule o tessuti vitali ed è anche più vicino alla situazione biologica nativa di cultura plastica. Esso è stato utilizzato nella nostra ricerca che dimostra l'eterogeneità fenotipica e meccanismo di regolazione di dedifferentiation OS con successo29.
Questo protocollo ha chiarito la fattibilità per generare un BEM tessuto-derivato dal mouse e potrebbe essere utilizzato per tessuti da umano, ratto e cane. Le fasi più critiche per successo istituzione e applicazione del BEM sono: (i) completare la rimozione di detriti cellulari; (ii) il mantenimento di una condizione di coltura sterile, sano; (iii) manualità e delicato pipettaggio durante l'iniezione, trasferimento e cultura del modello OS-BEM.
Altri protocolli riferiti generalmente impiegano pressurizzazione o una combinazione di trattamenti chimici ed enzimatici, quali Triton X-100, sodio dodecil solfato (SDS) e dnasi/RNAsi soluzione per realizzare potenti decellularizzazione30,31 . Tessuto cartilagineo che subisce decellularizzati con detergenti ha dimostrato di rimuovere componenti ECM inclusi glicosaminoglicani32. Ricapitolando un BEM più intatta nella massima misura possibile, un metodo di decellularizzazione moderata ma potente viene eseguito qui per evitare la dissoluzione e danneggiamenti dei componenti chiave e architettura nativa dell'ambiente dell'osso.
Tuttavia, non deve essere trascurato che questo modello di OS-BEM riposato in un piatto senza mezzo fluente, portando di conseguenza a una distribuzione irregolare di ossigeno e nutrienti. Rete vascolare ed altri sottotipi di cellule che aiutano che regolano la comunicazione e l'interazione dei segnali microambientali e osso omeostasi devono essere prese in considerazione24, 33,34, 35. speriamo che questo modello sarà combinato con altre tecniche di ingegneria ad alta tecnologia per far luce sulla medicina di precisione di guida e di ricerca OS.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori di valore il supporto di Liuying Chen per la sua assistenza amministrativa e Zhao lungo per la sua eccellente assistenza tecnica durante la costruzione di ponteggi di matrice extracellulare dell'osso. Questo studio è supportato da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
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