Summary

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Published: April 12, 2019
doi:

Summary

Кость внеклеточного матрикса (BEM) модель для остеосаркомы (ОС) является хорошо установленным и показано здесь. Он может использоваться как подходит леска подражая первичной опухоли роста в пробирке и предоставления идеальная модель для изучения гистологическое и цитогенетических неоднородность OS.

Abstract

Остеосаркома (ОС) является наиболее распространенным и высоко агрессивной первичной костной опухоли. Она характеризуется с анатомическими и гистологические варианты диагностических и прогностических трудности. OS включает в себя genotypically и фенотипически гетерогенных раковых клеток. Кость микроокружения элементы обоснованы с учетом неоднородности и болезнь прогрессии опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) сохраняет микроструктурных матрицы и биохимических компонентов родной внеклеточного матрикса. Ткани специфические ниши обеспечивает благоприятные и долгосрочные леску для OS ячейки посева и распространения. Эта статья предоставляет протокол для подготовки БЭМ модели и ее дальнейшее экспериментальное приложение. OS клетки могут расти и дифференцироваться в несколько фенотипы с гистопатологические сложности OS клинических образцов. Модель также позволяет визуализировать различные морфологии и их ассоциации с генетическими аномалиями и основные механизмы регулирования. Как гомологичных человека ОС эта модель БЭМ-OS может разработана и применяется к патологии и клинических исследований ОС.

Introduction

Остеосаркома (OS) обычно происходит в активно растущих областей, метафизе длинных костей, в подростковом возрасте. Более 80% пострадавших от OS сайты имеют предпочтение метафиз проксимального отдела голени и проксимального отдела плечевой кости, а также проксимальных и дистальных бедра, соответствующее расположение роста пластина1. OS включает в себя несколько подтипов клеток с мезенхимальных свойствами и значительное разнообразие в Гистологические особенности и класс. Свидетельства поддержки мезенхимальных стволовых клеток (МСК), остеобласты совершено прекурсоров и pericytes как клетки происхождения-2,3,4,5. Эти клетки могут накапливаться генетических или эпигеномные изменения и привести к OS под влиянием некоторых костей microenvironmental сигналов. Внутренние и внешние механизмы в результате геномная нестабильность и неоднородность ОС, с несколько морфологических и клинических фенотипов6,7. Для индивидуальной терапии или скрининга новых лекарственных препаратов Роман модели должен быть сгенерирован для против неоднородность или других клинических расстройств.

OS-внутри костной злокачественная опухоль твердых. Сложность и активности окружающих микроокружения элементы предоставляют фенотипических и функциональные различия по OS клеток в разных местах опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) обеспечивает структурных и биохимические леску для осаждения минеральных и костного ремоделирования. Органической частью внеклеточного матрикса (ECM), главным образом состоит из типа я коллагена выделяется клетками osteoblastic линии, в то время как его минерализованных часть состоит из фосфата кальция в виде гидроксиапатита8. Динамическая роль ECM сетей заключается в регулировании клеточной адгезии, дифференциация, кросс talk и ткани функции обслуживания9.

Деминерализованная БЭМ и ECM гидрогели были успешно использованы в культуре клеток и может повысить клетки распространения10,11. Синтезированные кости как ECM может регулировать размер пула, судьба решения и линии прогрессирование MSCs12,,1314. Кроме того результаты свидетельствуют его клиническое значение для предоставления Остеогенные деятельности путем стимулирования клеточных процессов во время кости формирования и регенерации15,16,17.

В этой статье наша группа устанавливает модифицированная модель и благоприятной альтернативой для трехмерных долгосрочные культуры. OS клетки вводят в ткани производные БЭМ представляют гетерогенно мезенхимальных фенотип легко по сравнению с пластиковой двумерных культур. BEM производным от участкам гомологичной ткани показать его драматические преимущество как родной ниши для OS клетки в пробирке и имеет большой потенциал в OS теоретических и клинических исследованиях. Эта платформа характеризуется BEM является простой, но эффективный в vitro исследования и может быть продлен в моделировании нескольких видов рака.

Protocol

Уход за животными и использования проводятся согласно национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (публикация NO.80-23, пересмотренной в 1996 году низ) после утверждения от животных этики Комитета Sun Yat-sen University. 1. кость ?…

Representative Results

После установки деминерализации и decellularization BEM, по-видимому, полупрозрачные, с сильной стойкость и упорство, по сравнению с родной мыши кости. Немного мышцы остатков и пространство медуллярного полости можно ясно наблюдать (рис. 1A, B). Чтобы определить эффективны?…

Discussion

Как правило ОС могут быть классифицированы как osteoblastic, chondroblastic и fibroblastic подтипов в зависимости от ее доминирующей гистологических компонента. Его прогноз зависит не только от гистологических параметров, но и на своем сайте анатомические. Это может произойти внутри костей (в Интрамеду?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы значение поддержка Чэнь Liuying ее административной помощи и длинные Чжао за его прекрасную технической помощи при строительстве подмостей внеклеточного матрикса костной ткани. Это исследование поддерживается за счет субсидий из национального фонда Китая естественных наук (31871413).

Materials

15 mL centrifuge tube Greiner 188271
50 mL centrifuge tube Greiner 227270
6 cm cell culture dish Greiner 628160
6-well plate Greiner 657160
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393
C57-BL/6J mouse Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
CO2 incubator SHEL LAB SCO5A
Dibasic sodium phosphate Guangzhou Chemical Reagent Factory BE14-GR-500G
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D0547
Fetal bovine serum Hyclone SH30084.03
Hemocytometer BLAU 717805
Kanamycin Sigma-Aldrich PHR1487
MG-63 Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
MNNG/HOS Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
Phenol red Sigma-Aldrich P4633 A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0.
Potassium chloride Sangon Biotech A100395
Potassium Phosphate Monobasic Sangon Biotech A501211
Sodium chloride Sangon Biotech A501218

References

  1. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
  2. Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
  3. Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
  4. Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
  5. Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
  6. Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma – shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
  7. Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
  8. Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
  9. Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
  10. Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
  11. Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
  12. Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
  13. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
  14. Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
  15. Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
  16. Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
  17. Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
  18. Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
  19. Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
  20. Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
  21. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  22. Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
  23. Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
  24. Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
  25. Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
  26. Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
  27. Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
  28. Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
  29. Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
  30. Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
  31. Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
  32. Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
  33. Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
  34. Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
  35. Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Yao, Y., Zhang, Y. Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma. J. Vis. Exp. (146), e59271, doi:10.3791/59271 (2019).

View Video