Summary
骨肉瘤 (OS) 的骨细胞外基质 (BEM) 模型已经建立, 并在此进行了展示。它可作为模拟原发肿瘤体外生长的合适支架, 为研究 os 的组织学和细胞生成异质性提供了理想的模型。
Abstract
骨肉瘤 (OS) 是最常见的, 也是一种极具攻击性的原发性骨肿瘤。它的特点是解剖和组织学变异, 以及诊断或预后困难。OS 包括基因型和表型异质性癌细胞。骨微环境元素被证明是肿瘤异质性和疾病进展的原因。骨细胞外基质 (BEM) 保留了本期细胞外基质的微观结构基质和生化成分。这种组织特异性生态位为 OS 细胞的播种和增殖提供了有利的长期支架。本文为 BEM 模型的建立及其进一步的实验应用提供了一种协议。OS 细胞可以生长并分化为多个表型, 与 OS 临床标本的组织病理学复杂性一致。该模型还允许可视化不同的形态及其与基因改变和潜在的调控机制的联系。作为与人类操作系统相对应的, 这种 BEM-OS 模型可以开发并应用于 OS 的病理和临床研究。
Introduction
骨肉瘤 (OS) 通常发生在活跃生长的地区, 长骨的形而上学, 在青春期。80% 以上受 oss 影响的部位优先考虑胫骨近端和肱骨近端以及股骨远端和股骨近端的形而上学, 与生长板1的位置相对应。OS 包括多种细胞亚型, 具有间充质性质, 组织学特征和等级差异较大。证据支持间充质干细胞 (mscs), 成骨细胞承诺前体和周细胞作为起源2,3,4,5的细胞。这些细胞可以积累遗传或表观遗传改变, 并在某些骨骼微环境信号的影响下产生 OS。内在和外在机制都导致 os 的基因组不稳定性和异质性, 具有多种形态和临床表型 6,7。对于个性化的治疗或新药筛选, 需要产生新的模型, 以抵御异质性或其他临床疾病。
OS 是骨内恶性实体瘤。周围微环境元素的复杂性和活性赋予肿瘤不同部位的 OS 细胞表型和功能差异。骨细胞外基质 (BEM) 为矿物沉积和骨重塑提供了结构和生化支架。细胞外基质 (ECM) 的有机部分主要由成骨细胞谱系细胞分泌的 i 型胶原蛋白组成, 而其矿化部分则由羟基磷灰石8形式的磷酸钙组成。ECM 网络的动态作用是调节细胞粘附、分化、交叉交谈和组织功能维持9。
脱盐边界元和 ECM 水凝胶已成功应用于细胞培养, 可促进细胞增殖10、11.综合骨样 ecm可以调节骨髓间充质干细胞 12,13, 14 的池大小、命运决定和血统进展。此外, 研究结果证明, 在骨形成和再生过程中, 通过刺激细胞过程来提供成骨活性的临床意义为15、16、17.
在本文中, 我们的团队建立了一个改进的模型和有利的替代三维长期文化。与塑料二维培养相比, 注入组织源性 BEM 的 OS 细胞很容易呈现异质间充质表型。从位点特异性同源组织中提取的 BEM 作为体外os 细胞的本土生态位, 显示出其巨大的优势, 在 os 理论和临床研究中具有巨大的潜力。这种具有特征的 BEM 平台简单而高效, 可用于体外研究, 可用于多种癌症的建模。
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Protocol
动物护理和使用是根据国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南 (NIH 出版物第80-23, 1996年修订), 经中山大学动物伦理委员会批准进行的。
1. 骨准备
- 获得4至6周龄的 balb1 小鼠 (无特定性别的要求)。通过颈椎脱位使小鼠无菌化地安乐死, 用无菌手术剪刀将新鲜的腓骨、胫骨和股骨从后肢中切断。剥去上皮组织, 然后用剪刀和推子尽可能多地切除软组织。
- 用不育的 10 mM 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 两次冲洗腿部骨骼, 以去除6厘米盘中的血液。将骨头浸泡在75% 的乙醇中 3分钟, 然后用 PBS 冲洗两次。清洁的骨骼可以储存在无菌的50毫升离心管中, 在-80°c 的无菌 PBS 中存放数月, 直到需要。
注: 在以下所有步骤中使用的 PBS 有 10 mM PO4 3−.
2. 骨脱矿和去细胞去髓鞘
- 在室温下解冻冷冻骨骼, 然后在-80°c 下再次冷冻 1小时. 使骨骼进入2-3 个以上的冻融周期, 以进行细胞裂解和组织分解。
- 在室温下, 在摇椅上或轨道振动台用 0.5 n HCl 的无菌50毫升离心管中培养骨骼, 并进行柔和的岩石晃动, 以确保骨骼的完整和均匀覆盖。
注: 确保骨骼在酸液运动过程中完全浸没, 在过程中不会沉淀。HCl 溶液的体积应是骨骼的十倍以上。 - 脱钙后, 将 HCl 溶液彻底脱色, 在自来水下冲洗1小时。然后, 在摇杆平台或轨道振动台上, 用蒸馏水清洗骨头两次, 每次15分钟。
注: 请确保完全去除溶液或水之间的洗涤和最后洗涤后与蒸馏水。 - 用1:1 甲醇和氯仿混合物在室温10包裹着锡箔1小时的50毫升离心管中提取脱盐骨骼中的脂质.
- 然后, 将骨头转移到另一管用锡箔包裹的甲醇中 30分钟, 将甲醇全部取出, 用蒸馏水用轻轻晃动冲洗15分钟。装饰最后的洗涤水, 并在无菌条件下进行以下步骤。
注: 在提取步骤中, 必须避免光线, 以防止氯仿分解。该混合物可存放在耐光容器或用锡箔包裹的离心管中。在适度的旋转或摇晃动作下进行所有的处理和清洗步骤。 - 用无菌 PBS 将骨头用6厘米的盘子冲洗 3分钟, 然后将骨头转移到一个新的50毫升离心管中。在管中加入40毫升无菌0.05% 的胰蛋白酶-edta (TE), 在 37°c 18 的 CO 2 孵化器中孵育骨骼 23小时.
- 丢弃 TE 溶液, 用无菌 PBS 冲洗两次, 辅以90μgml 氨匹西林和90μgml 卡那霉素。在完全脱除最终洗涤 PBS 后, 补充40毫升无菌 PBS。在室温下彻底清洗 24小时, 轻轻摇晃或晃动, 以便进行抗生素浸泡。
注: 本步骤和以下步骤中使用的所有无菌 PBS 均包含90μgml 氨匹西林和90μgml 卡那霉素。在旋转或晃动运动下进行隔夜清洗, 长期彻底浸泡使用抗生素, 以实现毛孔空间的有效消毒。 - 取出 PBS, 并将骨骼转移到一个新的50毫升离心管充满无菌 PBS。制备的脱矿和脱菌骨称为骨细胞外基质 (BEM), 可在4°c 下储存 2个月, 直到需要。
3. 细胞播种和培养
- 从4°c 冰箱中取出 BEM, 将其浸入75% 的乙醇中 30秒, 然后用 PBS 冲洗两次。将 BEM 转移到一个干净的6孔细胞培养板上。加入2毫升完整培养基 (Dulbecco 改性的 Eagle 招数 f12 (DF12), 含有5% 的胎牛血清、90μgml 氨匹西林和90μgml 卡那霉素)。在37°c 的二氧化碳孵化器中孵育 BEM 一夜.
- 获取人的操作系统细胞系 (mnnn™ hos 和 MG-63)。暂停约 1.0 x10 5 os 细胞, 其中含有 100ΜL pbs, 含有苯酚红作为指示器。
注: 为了更好地跟踪和观察三维 BEM 模型中的多层细胞, mnngeos 和 mCherry 感染了表达荧光 mCherry 和绿色荧光蛋白 (GFP) 的慢病毒载体。 - 当针头到达 bem 的髓腔时, 将 OS 细胞从近端或远端附骨注入 BEM。在37°c 的加湿 5% co2 气氛中, 将 OS-BEM 模型至少培养 2小时,以确保注入的细胞牢固地粘附在 bem 上。
注: 预热用于细胞培养的所有介质。用于细胞培养的孵化器在37°c 下具有加湿5% 的二氧化碳气氛。 - 在板中加入1毫升完整培养基, 在37°c 的 CO2 孵化器中隔夜完全覆盖 BEM 培养基的表面。
- 用无菌高音加水和再饲料1毫升新鲜培养基, 将 OS-BEM 模型轻轻地转化为6井板的新井。该模型在37°c 的 CO2 孵化器中培养 14天, 并根据 os 细胞的增殖情况更新培养基。
- 在培养过程中, 在倒置荧光显微镜下保持对介质颜色和细胞状态的监测。当 OS 细胞扩展到平板时, 用无菌的推特轻轻地将 OS-BEM 模型转移到另一口新井。
注: 培养基在 pH 值7.4 处呈鲜红色, 这是大多数哺乳动物细胞培养的最佳 pH 值。如果介质变为橙色甚至黄色, 请立即刷新介质, 以保持 OS 细胞的健康环境。 - 用推子将 OS-BEM 模型转移到新井中, 然后用 PBS 轻轻冲洗, 去除培养基。然后, 转移到一个15毫升的离心管, 并修复10% 缓冲福尔拉林的组织学鉴定。
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Representative Results
在去脱和去电磁化后, 与原生小鼠骨相比, BEM 具有更强的弹性和韧性。可以清楚地观察到少量肌肉残留和髓腔的空间 (图 1a、b)。为了确定 BEM 的有效去渗, 在固定后将 BEM 嵌入石蜡中, 然后切割成3-5μm 的部分进行血红素-eosin (H & E) 染色。明亮场成像显示了细胞核的彻底切除。在脱细胞 BEM 中, 天然多孔结构和胶原蛋白网络排列得到了很好的维护 (图 1c, d)。此外, 免疫组织化学 (IHC) 染色的主要有机成分的骨基质, 如胶原蛋白 i 和胶原蛋白 IV 显示, 与原生骨相比, 脱珠细胞 BEM 中的 ECM 成分没有损伤 (图 1e)。因此, BEM 为 OS 细胞的播种和增殖提供了一个合适的、有希望的支架, 具有很好的生物相容性。
MNNG/HOS 细胞表现出高度非典型的形态, 细胞质细长, 而 MG-63 细胞在单层培养中具有成纤维细胞状纺锤形 (图 2a, b)。OS 患者的组织学切片显示出明显的细胞多形性与圆形或多边形细胞, 单核细胞增多症和多个有丝分裂 (图 2c)。为了验证 BEM 模型的可行性和质量, 两个细胞系被注入 BEM 的髓腔, 并在14天培养过程中通过荧光成像进行监测 (图 3a, b)。H& E 染色的组织学切片显示 os 细胞附着在肌肉残留物上, 生长成厚桩或沿着骨基质粘附并增殖。骨膜和内皮都是通过 OS 细胞的扩张浸润的。引人注目的是, OS-BEM 模型的细胞生长模式不同于二维板培养。如图 3c 所示, 脱细胞 bem 上的 os 细胞表现出高度异质性形态, 类似于 os 部分的细胞病理特征。一些位于松质骨和髓腔的 os 细胞是球形的, 部分分布, 而沿着骨膜和内皮休息的细胞则极其扩散到拉长的细胞中, 伴随着核多形性。细胞活性是使用 Ki67 免疫染色来确定的, 这在长期培养中也显示出巨大的优势。此外, 在 BEM 培养的 OS 细胞高度表达骨基质糖蛋白--分泌的蛋白质酸性和丰富的半胱氨酸 (sparc/骨联素)--这是骨样基质所特有的 (图 3d)。
图 1: 小鼠脱珠化边界元的结构特点.(A、B)小鼠原生 (A) 和去细胞化 (B) 骨概述。(C, D)采用 H & E 染色法对小鼠原胫骨 (C) 和脱细胞骨 (D) 进行脱细胞化。在原生小鼠胫骨可以观察到血红素染色的成核, 但在 BEM 中不能观察到。(E) ihc 染色胶原蛋白 i 和胶原蛋白 iv, 检测小鼠胫骨去细胞化后保存的 ecm 主要成分。黄色箭头指出松质骨内丰富的胶原蛋白 i 和蓝色箭头指出致密骨内丰富的胶原蛋白 IV。刻度柱 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: Os 的细胞形态特征.(A、B)人的操作系统细胞系 MNNG/hos (A) 和 MG-63 (B) 在塑料烧瓶培养中扩大。刻度杆 = 100μm。(C) Os 患者 H & e 染色的病理组织学切片。刻度杆 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 去细胞化骨中 os 细胞的表征细胞外基质模型.(A、B)用荧光显微镜在 BEM 中播种培养后, 用荧光显微镜观察了 mnngeos (A) 和 GP-63 (b) gp-63 (B) gfp 表达 (红色) 的代表性 mCherry 表达 (红色) 图像。刻度杆 = 100μm。(C) H & e 分析显示了 bem 培养后注入的 mnngeos 和 mg-63 细胞的典型形态。(D) 对 mnngn. hos 细胞在 bem 模型中培养14天后的 KI67 和 sparc 表达水平进行 ihc 分析。代表性图像是两套用 Ki67 和 SPARC 染色的串行截面。刻度杆 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
一般来说, OS 可分为成骨细胞、软骨细胞和成纤维细胞亚型, 这取决于其显性组织学成分。它的预后不仅取决于组织学参数, 而且还取决于其解剖部位。它可能发生在骨骼内 (在髓内或腔内隔间), 在骨骼表面, 和在骨外的地方 19.操作系统的出现和异质性可以解释为致癌事件的结合和充分的微环境促进, 其次是越来越多的发育和向遥远器官迁移20,21,22 ,23。操作系统进化过程中的谜团可能会被一个合适的模型破译, 以概述针对操作系统环境和生态位的临床含义。
无论是在塑料盘子上还是在烧瓶上培养, 都很难再现动态而复杂的生物微生物环境。模仿骨肉瘤的各种临床前模型 (如小鼠、斑马鱼和狗) 的发展已经被宣布, 并应用于发病机制调查和药物开发4,24,25,26,27,28. 尽管如此, 研究人员还是担心实验动物, 因为它们在实验过程中感到不适和痛苦。我们的脱电 BEM 模型等体外三维模型具有方便、操作快、节约成本等优点;它提供了长期和容易维护的活细胞或组织, 也更接近本地生物的情况比塑料培养。在我们的研究中已经成功地证明了 OS 去分化的表型异质性和调控机制.
该协议澄清了从小鼠身上产生组织衍生 BEM 的可行性, 并可用于人、大鼠和狗的组织。成功建立和应用边界 EM 的最关键步骤是: (一) 彻底清除细胞碎片;(ii) 维持无菌、健康的培养条件;(iii) OS-BEM 模型在注射、转移和培养过程中的手动灵巧和温和移液。
其他报告的协议通常采用加压或化学和酶处理相结合, 如 triton x-100、十二烷基硫酸钠 (sds) 和 dnasey/rnase 溶液, 以实现强减电化30,31.用洗涤剂进行去病毒化的软骨组织已被证明可以去除 ECM 成分, 包括糖胺多糖32。为了最大限度地重述一个更完整的 BEM, 这里采用了一种中等但强大的去圣化方法, 以避免骨骼环境的关键部件和原生结构的溶解和破坏。
然而, 不可忽视的是, 这种 OS-BEM 模型停留在一个没有流动介质的板块中, 从而导致氧气和营养物质分布不均。血管网络和其他有助于调节微环境信号和骨骼稳态的通信和相互作用的细胞亚型需要考虑到24、 33、34、 35. 希望该模型能与其他高科技工程技术相结合, 阐明操作系统的研究, 指导精密医学。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者重视陈柳英的行政协助和赵龙在骨细胞外基质支架建设过程中提供的出色技术协助。这项研究得到了国家自然科学基金 (31871413) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
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