Summary
Hier is het bot extracellulaire matrix (BEM) model voor Osteosarcoom (OS) gevestigde en getoond. Het kan worden gebruikt als een geschikte steiger voor nabootsen van primaire tumor groei in vitro en bieden een ideaal model voor het bestuderen van de histologische en cytogenic heterogeniteit van OS.
Abstract
Osteosarcoom (OS) is de meest voorkomende en een zeer agressieve primaire bot tumor. Het wordt gekenmerkt met anatomische en histologische varianten samen met diagnostische of prognostische moeilijkheden. OS omvat genotypisch en fenotypische heterogene kankercellen. Bot communicatie elementen blijkt rekening voor de heterogeniteit en ziekte progressie van de tumor. Bot extracellulaire matrix (BEM) behoudt de microstructurele matrices en biochemische onderdelen van inheemse extracellulaire matrix. Dit weefsel-specifieke niche biedt een gunstige en lange steiger voor OS cel zaaien en proliferatie. Dit artikel bevat een protocol voor de bereiding van BEM model en de verdere experimentele toepassing. OS cellen kunnen groeien en differentiëren in meerdere fenotypen consistent met de histopathologische complexiteit van OS klinische monsters. Het model maakt het ook mogelijk visualisatie van uiteenlopende morphologies en hun associatie met genetische veranderingen en onderliggende regulerende mechanismen. Als homoloog aan menselijke OS, kan dit model BEM-OS worden ontwikkeld en toegepast op de pathologie en klinisch onderzoek van OS.
Introduction
Osteosarcoom (OS) treedt meestal op in de actief groeiende gebieden, de metaphysis van lange beenderen, tijdens de adolescentie. Meer dan 80% van de sites die getroffen zijn door OS hebben voorkeur voor de metaphysis van proximale tibia, evenals proximale humerus en zowel de distale als de proximale dijbeen, overeenkomt met de locatie van de groei plaat1. OS bestaat uit meerdere subtypes van de cel met mesenchymale eigenschappen en aanzienlijke verscheidenheid is in histologische kenmerken en rang. Bewijzen ondersteunen mesenchymale stamcellen (MSCs), botcellen gepleegd precursoren en pericytes als de cellen van oorsprong2,,3,,4,5 Deze cellen kunnen accumuleren genetische of epigenetische veranderingen en aanleiding geven tot OS onder invloed van bepaalde microenvironmental signalen van bot. Zowel intrinsieke en extrinsieke mechanismen leiden tot de instabiliteit van het genoom en de heterogeniteit van OS, met meerdere morfologische en klinische fenotypen6,7. Voor geïndividualiseerde therapieën of screening van nieuwe geneesmiddelen moeten nieuwe modellen worden gegenereerd om tegen heterogeniteit of andere klinische aandoeningen.
OS is een intra werden kwaadaardige solide tumor. De complexiteit en de activiteit van het omringende communicatie elementen verlenen fenotypische en functionele verschillen op OS cellen op verschillende locaties van een tumor. Bot extracellulaire matrix (BEM) voorziet in een structurele en biochemische steiger minerale afzetting en bot remodeling. Het organische gedeelte van extracellulaire matrix (ECM) bestaat voornamelijk uit type I collageen uitgescheiden door osteoblastic lineage cellen, terwijl haar gemineraliseerde gedeelte uit calciumfosfaat in de vorm van hydroxyapatiet8 bestaat. De dynamische rol van ECM netwerken is het reguleren van de cel adhesie, differentiatie, cross-talk en weefsels functie onderhoud9.
Gedemineraliseerd BEM en ECM hydrogels zijn met succes gebruikt in de cultuur van de cel en cel proliferatie10,11kunt verbeteren. Gesynthetiseerde bot-achtige ECM kunt regelen de grootte van het zwembad, lot besluiten en bloedlijn progressie van MSCs12,13,14. Bovendien bewijzen de resultaten zijn klinische betekenis om osteogenic activiteit door stimulerende cellulaire processen tijdens bot vorming en regeneratie15,16,17.
In dit artikel stelt onze fractie een gemodificeerde model en gunstige alternatief voor driedimensionale langetermijnkweek. OS cellen geïnjecteerd in de BEM weefsel afkomstige presenteren een ongelijkmatig mesenchymale fenotype gemakkelijk in vergelijking met plastic tweedimensionale culturen. BEM afgeleid van site-specific homologe weefsel Toon haar dramatische voordeel zoals een native niche voor OS in vitro cellen en heeft een groot potentieel in OS theoretisch en klinisch onderzoek. Dit gekarakteriseerd BEM-platform is eenvoudig, maar efficiënt voor in vitro onderzoek en in het modelleren van meerdere kankers kan worden verlengd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verzorging van de dieren en het gebruik worden uitgevoerd volgens de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicatie NO.80-23, herzien in 1996) na goedkeuring van het dier ethiek Comité van zon Yat-sen-universiteit.
1. been voorbereiding
- Verkrijgen van 4 tot 6 weken oude BALB/c muizen (zonder geslacht-specifieke eis). Een muis aseptisch euthanaseren door cervicale dislocatie en afgesneden verse kuitbeen, scheenbeen en het dijbeen van een stuk met een steriele chirurgische schaar. Afschilferen van de epitheelweefsel en Verwijder zo veel van het zachte weefsel mogelijk met behulp van schaar en pincet.
- Spoel de been botten met steriele 10 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal om bloed in een 6 cm schotel. De botten in 75% ethanol voor 3 min. onderdompelen en spoel tweemaal met PBS. De schone botten kunnen worden opgeslagen in een centrifugebuis steriele 50 mL met steriel PBS-80 ° c voor maanden totdat vereist.
Opmerking: PBS gebruikt in alle volgende stappen heeft 10 mM PO43−.
2. bone demineralisatie en decellularization
- De bevroren botten op kamertemperatuur ontdooien en dan bevriezen weer bij-80 ° C voor 1 h. de botten aan meer dan 2-3 bevriezen-ontdooien cycli voor cel lysis en weefsel analyse onderworpen.
- Incubeer de botten in een centrifugebuis steriele 50 mL met 0,5 N HCl's nachts bij kamertemperatuur op een rockende platform of orbital shaker met zachte wiegen/schudden om te zorgen voor volledige en zelfs dekking van botten.
Opmerking: Zorg ervoor dat de botten worden volledig ondergedompeld tijdens beweging in het zuur en neem geen genoegen tijdens het proces. De hoeveelheid zoutzuur moet meer dan tien keer als die van de beenderen. - Na ontkalking, decanteren in de HCl-oplossing volledig en spoel onder stromend water gedurende 1 uur. Vervolgens wassen de botten tweemaal voor 15 min per wasbeurt met gedestilleerd water op een rockende platform of orbital shaker.
Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing of het water tussen de wasbeurten en na de laatste wasbeurt met gedestilleerd water volledig te verwijderen. - Pak de lipiden in de gedemineraliseerd botten met een 1:1 mengsel van methanol en chloroform in een tube van 50 mL centrifuge omwikkeld met aluminiumfolie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur10.
- Vervolgens overdracht de botten in een andere buis van methanol omwikkeld met aluminiumfolie voor 30 min. volledig verwijderen van de methanol en naspoelen met gedestilleerd water tweemaal voor 15 min met voorzichtig schudden. Definitieve waswater decanteren en verder met de volgende stappen onder steriele toestand.
Opmerking: Tijdens de extractie stap, licht moet vermeden worden om te voorkomen dat chloroform ontleding. Het mengsel kan worden opgeslagen in licht-resistente container of een centrifugebuis omwikkeld met aluminiumfolie. Het uitvoeren van alle behandeling en wassen stappen onder bescheiden rotatie of beweging schommelen. - Spoel de botten in een 6 cm schotel met steriel PBS gedurende 3 minuten, en breng de botten in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL. Voeg 40 mL steriele 0,05% trypsine-EDTA (TE) in de buis en incubeer beenderen voor 23 h in een CO2 incubator bij 37 ° C18.
- De oplossing TE negeren en spoel tweemaal met steriel PBS aangevuld met 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine. Na de finale decanteren wassen PBS volledig, met 40 mL steriele PBS te vullen. Was grondig gedurende 24 uur bij kamertemperatuur met zachte wiegen of schudden voor antibiotica weken.
Opmerking: Alle van de steriele PBS gebruikt in dit en de volgende stappen bevat 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine. 'S nachts wassen onder rotatie of beweging schommelen worden uitgevoerd voor de grondige onderdompeling lange periodes met antibiotica om doeltreffende sterilisatie van porie ruimten. - Verwijderen van de PBS en breng de botten in een centrifugebuis van de verse 50 mL gevuld met steriel PBS. De klaargemaakte gedemineraliseerd en decellularized botten heten bot extracellulaire matrix (BEM) en kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor 2 maanden totdat vereist.
3. cel zaaien en cultuur
- Neem de BEM uit koelkast 4 ° C en dompel het in 75% ethanol voor 30 s, dan spoelen met PBS tweemaal. Overdracht van de BEM op een bord schoon 6-well cel cultuur. Voeg toe 2 mL volledige kweekmedium (Dulbecco van gewijzigd Eagle's medium/F12 (DF12) met 5% foetale runderserum, 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine). Incubeer de BEM overnachting in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Het verkrijgen van menselijke cellijnen van de OS (MNNG/HOS en MG-63). Schorten ongeveer 1,0 x 105 OS cellen met 100 μl PBS met fenol rood als indicator.
Opmerking: Om beter te volgen en observeren van meerdere lagen cellen binnen het driedimensionale BEM-model, MNNG/HOS en MG-63 zijn besmet met lentivirale vector uiting van fluorescerende mCherry en groen fluorescente proteïne (GFP). - Nadat de BEM volledig in het medium gedrenkt is, injecteren OS cellen BEM uit proximaal of DISTAAL epiphysis wanneer de naald de Wallenberg holte van BEM bereikt. Incubeer de OS-BEM model voor een minimum van 2 h in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C om de cellen geïnjecteerd stevig vasthouden aan BEM.
Opmerking: Pre warm alle media gebruikt voor celkweek. De incubator gebruikt voor cultuur van de cel heeft een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C. - Voeg 1 mL volledige voedingsbodem in de plaat volledig jas het oppervlak van de cultuur van de BEM overnachting in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Pipetteer zachtjes het OS-BEM-model in een nieuwe put van 6-well plaat met een steriel pincet en bijvoeding 1 mL verse kweekmedium. Cultuur van het model voor 14 dagen in een CO2 incubator bij 37 ° C en vernieuw het kweekmedium volgens de situatie van de proliferatie van cellen van het OS.
- Houd controle van middellange kleur en cel status onder de omgekeerde fluorescentie Microscoop tijdens het proces van de cultuur. Wanneer OS cellen naar plaat uitbreiden, zachtjes overbrengen in de OS-BEM-model een andere nieuwe goed met steriel pincet.
Opmerking: Het kweekmedium is helder rood bij pH 7.4, dat is de optimale pH-waarde voor de cultuur van de cel van de meeste zoogdieren. Als het medium in oranje of zelfs geel verandert, onmiddellijk vernieuwen het medium te handhaven van een gezond milieu voor OS cellen. - Breng het OS-BEM-model in een nieuwe put met een pincet en voorzichtig spoelen met PBS te verwijderen het kweekmedium. Vervolgens breng kwantitatief over in een centrifugebuis 15 mL en repareren met 10% gebufferd formaline voor histologisch identificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na demineralisatie en decellularization lijkt BEM te zijn doorschijnend met sterkere veerkracht en vasthoudendheid in vergelijking met inheemse muis bot. Een kleine residu van de spier en de ruimte van Wallenberg spouw kunnen duidelijk worden waargenomen (Figuur 1A, B). Om te bepalen van de effectieve decellularization van BEM, is BEM ingesloten in paraffine na fixatie, en vervolgens gesneden in 3 – 5 μm secties voor Haematoxyline-eosine-kleuring (H & E). De grondige verwijdering van celkernen wordt aangetoond door heldere-veld imaging. De natuurlijke poreuze structuur en collageen van netwerk regeling is goed onderhouden in decellularized BEM (Figuur 1C, D). Daarnaast (IHC) immunohistochemische kleuring van overheersende organische componenten van bot matrix, zoals collageen die i en collageen IV tonen geen schade op ECM componenten in decellularized BEM in vergelijking met het oorspronkelijke bot (Figuur 1E). BEM biedt daarom een geschikt en veelbelovende steiger met grote biocompatibiliteit voor OS cel zaaien en proliferatie.
MNNG/HOS cellen vertonen een zeer atypische morfologie met fijn vacuolated cytoplasma, terwijl MG-63 cellen fibroblast-achtige Spilvormige vormen in enkelgelaagde cultuur (Figuur 2A, B hebben). De histologische sectie van een OS-patiënt toont belangrijke cellulaire pleomorfisme met afgeronde of veelhoekige cellen, anisonucleosis en meerdere tussen (Figuur 2C). Om te controleren of de levensvatbaarheid en de kwaliteit van het model van de BEM, worden beide cellijnen geïnjecteerd in de Wallenberg holte van BEM en gecontroleerd via fluorescentie imaging tijdens de 14-daagse cultuur (Figuur 3A, B). Histologische secties met H & E kleuring onthullen dat OS cellen aan spier residuen koppelen en tot dikke palen uitgroeien of langs bot matrix houden en vermenigvuldigen. Zowel de endosteum als de beenvlies zijn geïnfiltreerd door de expansie van OS cellen. Opvallend, verschillen de cel groeipatronen van de OS-BEM model van tweedimensionale plaat cultuur. Zoals geïllustreerd in Figuur 3C, Toon OS cellen op de decellularized BEM zeer heterogene morfologie vergelijkbaar met de cytopathologic kenmerken van een OS-sectie. Sommige OS-cellen vinden in spongieuze en Wallenberg holte zijn bolvormig en deels verspreid buiten, terwijl de cellen rust langs het beenvlies en endosteum zijn zeer verspreid in langgerekte cellen vergezeld van nucleaire pleomorfisme. Cel activiteit wordt bepaald met behulp van immunokleuring van de Ki67, waarin ook grote voordelen in lange termijn culturen. Ook OS cellen in BEM cultuur zeer bot matrix glycoproteïne express — uitgescheiden eiwitten zuur en rijk aan cysteïne (SPARC/osteonectin) — die specifiek voor osteoid matrix (Figuur 3D) is.
Figuur 1 : De structurele kenmerken van de muis decellularized BEM. (A, B) Overzicht van muis native (A) en decellularized (B) bot. (C, D) Decellularization werd beoordeeld door H & E kleuring van muis inheemse tibia (C) en het decellularized been (D). Kernen gekleurd met haematoxyline kon worden waargenomen in native muis tibia, maar niet in de BEM. (E) IHC kleuring voor collageen ik en collageen IV op te sporen van de hoofdonderdelen van ECM, die worden bewaard in muis tibia na decellularization. Gele pijl wijst de overvloedige collageen ik binnen spongieuze en blauwe pijl wijst op de overvloedige collageen IV binnen compact bot. Schaal bars = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : De kenmerken van de cytomorphological van OS. (A, B) Menselijke OS cellijnen MNNG/HOS (A) en MG-63 (B) uitgebreid in kunststof kolf cultuur. Schaal bar = 100 μm. (C) histopathologische sectie met H & E kleuring van OS patiënt. Schaal bar = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Karakterisering van OS cellen in decellularized bot model van de extracellulaire matrix. (A, B) Vertegenwoordiger mCherry expressie (rood) afbeelding van MNNG/HOS (A) en GFP expressie (groen) beeld van MG-63 (B) door fluorescentie microscopie na zaaien en kweken in BEM. Schaal bar = 100 μm. (C) H & E analyse weergeven van typische morfologie van de geïnjecteerde MNNG/HOS en MG-63 cellen na het kweken in BEM. (D) IHC analyse op Ki67 en SPARC expressie niveau van MNNG/HOS cellen na het kweken in BEM model voor 14 dagen. De representatieve beelden zijn twee sets van seriële secties gekleurd met Ki67 en SPARC. Schaal bar = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het algemeen, OS kan worden geclassificeerd als osteoblastic, chondroblastic, en fibroblastic subtypen afhankelijk van haar dominante histologische component. De prognose is niet alleen afhankelijk zijn voor histologische parameters maar ook op haar anatomische plaats. Het kan optreden in de botten (in de intramedullaire of intracortical compartiment), op de oppervlakken van botten, en met extraosseous sites19. Het ontstaan en de heterogeniteit van OS kunnen worden toegelicht als een vervoeging van oncogene gebeurtenissen en een voldoende microenvironmental boost, gevolgd door de toenemende migratie en ontwikkeling tot verre organen20,21,22 ,23. Mysterie tijdens OS evolutie kan worden ontcijferd met een goed model te schetsen van de klinische implicaties, gericht op de OS omgeving en niche.
Teelt op kunststof gerechten of in kolven in vitro kan nauwelijks de dynamische en complexe biologische communicatie recapituleren. Grote vooruitgang van verschillende preklinische modellen (bijvoorbeeld muis, zebravis en hond) het nabootsen van de osteosarcoom zijn verklaard en toegepast op de pathogenese onderzoek en drug ontwikkeling4,24,25, 26 , 27 , 28. onderzoekers hebben nog, zorg voor proefdieren als gevolg van hun ongemak en lijden tijdens experimenten. In vitro driedimensionale modellen zoals onze decellularized BEM-model het voordeel vanwege haar gemak, snelle werking en kostenbesparing heeft; het is op lange termijn en gemakkelijke onderhoud van levensvatbare cellen of weefsels, en is tevens dichter bij de inheemse biologische situatie dan plastic cultuur. Het is in ons onderzoek aan te tonen de fenotypische heterogeniteit en reguleringsmechanisme van OS dedifferentiation met succes29gebruikt.
Dit protocol verduidelijkt de haalbaarheid voor het genereren van een weefsel afkomstige BEM van muis en kan worden gebruikt voor weefsels van menselijke, rat en hond. De meest kritische stappen voor een succesvolle vaststelling en toepassing van BEM zijn: (i) volledige verwijdering van cel puin; (ii) het onderhoud van een steriele, gezonde cultuur voorwaarde; (iii) handigheid en zachte pipetteren tijdens de injectie, de overdracht en de cultuur van OS-BEM model.
Andere gemelde protocollen in het algemeen in dienst overdruksystemen of een combinatie van chemische en enzymatische behandelingen, zoals Triton X-100, natrium dodecyl sulfaat (SDS) en DNase/RNase oplossing te bereiken van krachtige decellularization30,31 . Het kraakbeen-weefsel dat decellularization met detergenten ondergaat gebleken om ECM componenten, met inbegrip van glycosaminoglycanen32te verwijderen. Om te recapituleren een meer intact BEM zoveel, wordt een gematigde maar krachtige decellularization-methode hier uitgevoerd om te voorkomen dat de ontbinding en de beschadiging van essentiële onderdelen en inheemse architectuur van het bot milieu.
Het is echter niet te verwaarlozen dat dit OS-BEM model in een plaat zonder stromend medium rustte, dus leidt tot een ongelijke verdeling van zuurstof en voedingsstoffen. Vasculaire netwerk en andere subtypen van de cel die helpen reguleren van de communicatie en interactie van microenvironmental signalen en bot homeostase dienen te worden genomen in overweging24, 33,34, 35. hopelijk, zal dit model worden gecombineerd met andere technieken hightech engineering licht te werpen op OS onderzoek en gids precisie geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs waarderen de steun van Liuying Chen voor haar administratieve bijstand en lange Zhao voor zijn uitstekende technische hulp tijdens de bouw van steigers van de extracellulaire matrix van bot. Deze studie wordt ondersteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
- Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
- Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
- Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
- Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
- Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
- Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
- Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
- Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
- Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
- Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
- Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
- Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
- Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
- Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
- Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
- Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
- Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
- Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
- Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
- Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
- Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
- Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
- Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
- Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
- Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
- Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
- Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
- Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
- Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
- Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
- Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
