Summary
Die extrazelluläre Matrix (BEM) Knochenmodell für Osteosarkom (OS) ist hier gut etabliert und gezeigt. Es kann als geeignete Gerüst für Primärtumor Wachstum in Vitro imitiert und bietet ein ideales Modell für das Studium der histologischen und cytogenic Heterogenität des Betriebssystems verwendet werden.
Abstract
Osteosarkom (OS) ist die häufigste und eine sehr aggressive primäre Knochentumor. Es wird mit anatomischen und histologischen Varianten sowie diagnostische oder prognostische Schwierigkeiten gekennzeichnet. OS umfasst genotypisiert und phänotypisch heterogene Krebszellen. Mikroumgebung Knochenteile werden entfallen Tumorprogression Heterogenität und Krankheit nachgewiesen. Extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) behält die mikrostrukturellen Matrizen und biochemische Komponenten der native extrazelluläre Matrix. Diese Gewebe-spezifische Nische bietet eine günstige und langfristige Gerüst für OS-Zelle, die Aussaat und Verbreitung. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Vorbereitung des BEM Modell und dessen weitere experimentelle Anwendung. OS-Zellen können wachsen und in Einklang mit der histopathologischen Komplexität des OS klinischen Proben mehrere Phänotypen unterscheiden. Das Modell erlaubt auch Visualisierung der verschiedenen Morphologien und ihrer Verbindung mit genetischen Veränderungen und zugrunde liegenden Regulationsmechanismen. Als homolog zu menschlichen OS kann, der Pathologie und klinische Forschung von OS dieses BEM-OS-Modell entwickelt und angewendet werden.
Introduction
Osteosarkom (OS) tritt in der Regel in aktiv Anbaugebieten, die Metaphyse der langen Röhrenknochen, während der Adoleszenz. Mehr als 80 % der OS-betroffenen Standorte bevorzugen die Metaphysis des proximalen Tibia sowie proximalen Humerus und distalen und proximalen Femur, der Standort des Wachstums Platte1entspricht. OS umfasst mehrere Untertypen der Zelle mit mesenchymalen Eigenschaften und große Vielfalt in histologischen Merkmale und Klasse. Beweise unterstützen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten engagiert Vorläufer und Perizyten als die Zellen der Ursprung2,3,4,5. Diese Zellen können genetische oder epigenetische Veränderungen zu sammeln und geben Anlass zu OS unter dem Einfluss von bestimmten Knochen microenvironmental Signale. Intrinsische und extrinsische Mechanismen führen die genomische Instabilität und Heterogenität des OS, mit mehreren morphologische und klinische Phänotypen6,7. Für individualisierte Therapien oder Screening neuer Medikamente neue Modelle, gegen Heterogenität oder anderen klinischen Störungen generiert werden müssen.
OS ist ein Intra knöcherner malignen soliden Tumoren. Die Komplexität und die Aktivität der umgebenden Mikroumgebung Elementen verleihen phänotypische und funktionelle Unterschiede auf OS Zellen an verschiedenen Standorten eines Tumors. Extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) stellt eine strukturelle und biochemische Gerüst für mineralische Ablagerungen und Knochenaufbau. Der organische Anteil der extrazellulären Matrix (ECM) besteht hauptsächlich aus Typ I Kollagen sezerniert osteoblastischen Linie Zellen, während seiner mineralisierte Teil von Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit8besteht. Die dynamische Rolle der ECM-Netzwerke ist die Zelladhäsion regulieren, Differenzierung, Übersprechen und Gewebe Funktion Wartung9.
Entmineralisiertem BEM und ECM Hydrogele in Zellkultur erfolgreich benutzt worden und kann Cell Proliferation10,11erhöhen. Synthetisierte Knochen wie ECM kann die Poolgröße, Schicksal Entscheidungen und Linie Fortschreiten der MSCs12,13,14Regeln. Darüber hinaus beweisen Ergebnisse seine klinische Bedeutung zu knochenbildenden Aktivität durch anregende zelluläre Prozesse im Knochen Bildung und Regeneration15,16,17.
In diesem Artikel stellt unsere Fraktion ein modifiziertes Modell und günstige Alternative für dreidimensionale langfristige Kultur. OS-Zellen in das Gewebe abgeleitet BEM injiziert präsentieren einen heterogen mesenchymalen Phänotyp leicht im Vergleich zu Kunststoff zweidimensionale Kulturen. BEM abgeleitet ortsspezifische homologe Gewebe zeigen dramatische Geltung als eine native Nische für OS in Vitro Zellen und hat ein großes Potenzial in der OS theoretischen und klinischen Forschung. Diese zeichnet sich BEM-Plattform ist einfach aber effizient für in-vitro- Forschung und bei der Modellierung von mehreren Krebserkrankungen verlängert werden.
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Protocol
Tierpflege und Nutzung werden nach den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und verwenden von Labortieren (NIH Publikation Nr. 80-23, revidiert 1996) nach der Genehmigung der Tier Ethik Ausschuss der Sun Yat-Sen University durchgeführt.
(1) Knochen-Vorbereitung
- Erhalten Sie 4 bis 6 Wochen alten BALB/c Mäusen (ohne Geschlecht-spezifische Anforderung). Einschläfern Sie eine Maus aseptisch durch zervikale Dislokation und frischen Fibula, Tibia und Femur aus einem Megalosauridae mit sterile chirurgische Schere abgeschnitten. Das Epithelgewebe abziehen und dann so viel des Weichgewebes wie möglich mit Schere und Pinzette entfernen.
- Spülen Sie die Beinknochen mit sterilen 10 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, um Blut in einer 6 cm Schale entfernen. Tauchen Sie die Knochen in 75 % Ethanol für 3 min, dann spülen mit PBS zweimal. Die sauberen Knochen können monatelang bis in einen sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit sterilen PBS bei-80 ° C gespeichert werden.
Hinweis: In den folgenden Schritten verwendet PBS hat 10 mM PO43−.
2. Knochen Sie Demineralisation und decellularization
- Die gefrorenen Knochen bei Raumtemperatur auftauen und dann einfrieren wieder bei-80 ° C, für 1H vorbehaltlich der Knochen mehr als 2 – 3 Frost-Tau-Zyklen für Zelle Lysis und Gewebe Zusammenbruch.
- Inkubieren Sie die Knochen in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 0,5 N HCl über Nacht bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform oder Orbital Shaker mit sanften Schaukeln/schütteln vollständig und sogar Knochen abzudecken.
Hinweis: Stellen Sie sicher, die Knochen werden ausschließlich während der Bewegung in der Säure getaucht und begnügen Sie sich nicht während des Prozesses. Das Volumen der HCl-Lösung sollte mehr als zehnmal so, dass der Knochen. - Nach der Entkalkung die HCl-Lösung vollständig zu dekantieren und spülen unter fließendem Wasser für 1 h. Waschen Sie die Knochen zweimal für 15 min pro Waschgang mit destilliertem Wasser auf einem schaukelnden Plattform oder Orbital-Shaker.
Hinweis: Stellen Sie sicher die Lösung oder das Wasser zwischen den Waschgängen und nach dem letzten Waschen mit destilliertem Wasser vollständig zu entfernen. - Extrahieren Sie die Lipide in den entmineralisiertem Knochen mit einem 1:1 Gemisch aus Methanol und Chloroform in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit Alufolie für 1 h bei Raumtemperatur10gewickelt.
- Dann Transfer die Knochen in einem anderen Gefäß umwickelt mit Alufolie für 30 min. Methanol Methanol vollständig entfernen und spülen Sie mit destilliertem Wasser zweimal für 15 min mit sanft schütteln. Dekantieren Sie letzte Waschwasser und fahren Sie mit den folgenden Schritten unter sterilen Bedingungen.
Hinweis: Während der Extraktionsschritt muss Licht vermieden werden um Chloroform Zersetzung zu vermeiden. Die Mischung kann in lichtbeständigen Container gelagert werden oder ein Zentrifugenröhrchen mit Alufolie umwickelt. Alle Behandlungen durchführen und Schritte unter bescheidenen Rotation oder Schaukelbewegung zu waschen. - Spülen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit sterilem PBS für 3 min, und übertragen Sie dann die Knochen in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Hinzufügen von 40 mL sterile 0,05 % Trypsin-EDTA (TE) in das Rohr und inkubieren Sie Knochen für 23 h in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C18.
- TE Lösung zu verwerfen und zweimal mit sterilen PBS ergänzt mit 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin abspülen. PBS waschen nach Umfüllen das Finale komplett, mit 40 mL sterile PBS aufzufüllen. 24 h bei Raumtemperatur mit sanften Schaukeln oder schütteln für antibiotische einweichen waschen Sie gründlich.
Hinweis: Alle sterile PBS verwendet in diesem und den folgenden Schritten enthält 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin. Über Nacht waschen unter Rotation oder Schaukelbewegung erfolgen für längere gründliche eintauchen mit Antibiotika, effektive Sterilisation von Porenräumen zu erreichen. - Entfernen Sie die PBS und übertragen Sie die Knochen in eine frische 50 mL Zentrifugenröhrchen, gefüllt mit steriler PBS. Die vorbereiteten demineralisiertes und decellularized Knochen nennt man extrazelluläre Knochenmatrix (BEM) und können 2 Monate bis erforderlich bei 4 ° C gelagert werden.
3. Handy-Aussaat und Kultur
- Nehmen Sie die BEM von 4 ° C Kühlschrank und zweimal in 75 % Ethanol für 30 s, dann spülen mit PBS eintauchen. Übertragen Sie die BEM auf eine saubere 6-Well Zellplatte Kultur. Fügen Sie 2 mL komplette Kulturmedium (Dulbeccos modifiziert Adlers Medium/F12 (DF12) mit 5 % fötalen Rinderserum, 90 μg/mL Ampicillin und 90 μg/mL Kanamycin). Inkubieren Sie die BEM über Nacht in eine CO2 Inkubator bei 37 ° c
- Erhalten Sie menschliche OS-Zell-Linien (MNNG/HOS und MG-63). Aussetzen Sie ca. 1,0 x 105 OS Zellen mit 100 μl PBS mit Phenol rot als Indikator.
Hinweis: Um besser verfolgen und mehrschichtige Zellen innerhalb des dreidimensionalen Modells BEM zu beobachten, sind MNNG/HOS und MG-63 mit Lentivirale Vektor ausdrücken fluoreszierende mCherry und grün fluoreszierendes Protein (GFP) infiziert. - Nach die BEM im Medium voll getränkt ist, injizieren Sie OS Zellen in BEM von proximalen oder distalen Epiphyse, wenn die Nadel die Markhöhle BEM erreicht. Inkubieren Sie das OS-BEM-Modell für ein Minimum von 2 h in einer befeuchteten 5 % CO2 Atmosphäre bei 37 ° C zu gewährleisten, die injizierten Zellen fest haften, BEM.
Hinweis: Vorwärmen der Medien, die für die Zellkultur verwendet. Der Inkubator für Zellkultur verwendet hat eine befeuchtete 5 % CO2 Atmosphäre bei 37 ° C. - Fügen Sie 1 mL komplette Kulturmedium in die Platte komplett beschichten die Oberfläche der BEM Kultur über Nacht in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Übertragen Sie das Modell OS-BEM sanft in einen neuen Brunnen 6-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette und refeed 1 mL frisches Nährmedium Kultur des Modells für 14 Tage in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C und aktualisieren Sie das Kulturmedium situationsgerecht Verbreitung von OS-Zellen.
- Halten Sie die Statusüberwachung mittlere Farbe und Zelle unter dem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei der Kultur. Wenn OS Zellen auf Platte erweitern, übertragen Sie sanft das OS-BEM-Modell auf eine andere neu auch mit sterilen Pinzette.
Hinweis: Das Kulturmedium ist leuchtend rot bei pH 7,4, der optimale pH-Wert für die meisten Säugetier-Zellkultur. Wenn das Medium in orange oder sogar gelb verwandelt, sofort aktualisieren Sie das Medium, um eine gesunde Umwelt für OS Zellen zu erhalten. - Das OS-BEM-Modell in einen neuen Brunnen mit einer Pinzette und sanft spülen mit PBS, das Kulturmedium zu entfernen. Dann übertragen Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und befestigen Sie mit 10 % gepuffert Formalin zur histologischen Identifikation.
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Representative Results
Nach der Entsalzung und Decellularization scheint BEM durchscheinend mit stärkeren Widerstandsfähigkeit und Festigkeit im Vergleich zu nativen Maus Knochen sein. Eine kleine Muskel-Rückstände und der Raum der Markhöhle können deutlich (Abbildung 1A, B) beobachtet werden. Um festzustellen, die effektive Decellularization von BEM, BEM nach der Fixierung in Paraffin eingebettet, und dann in Scheiben geschnitten in 3 – 5 μm Abschnitte für Färbung Hämatoxylin-Eosin (H & E). Die gründliche Beseitigung von Zellkernen zeigt Hellfeld Bildgebung. Die natürliche poröse Struktur und Kollagen Netz-Anordnung ist in decellularized BEM (Abbildung 1C, D) gepflegt. Darüber hinaus immunhistochemische (IHC) Färbung der vorherrschende organische Bestandteile der Knochenmatrix, wie Kollagen, die ich und Kollagen IV keine Schäden auf ECM-Komponenten in zeigen decellularized BEM im Vergleich zu den nativen Knochen (Abbildung 1E). Daher bietet BEM leski geeignet und viel versprechende große Biokompatibilität für OS-Zelle, die Aussaat und Verbreitung.
MNNG/HOS Zellen weisen eine sehr atypische Morphologie mit fein vakuolisierten Zytoplasma, während MG-63 Zellen Fibroblasten Rücken Formen in Monolayer Kultur (Abbildung 2A, B) haben. Der histologische Abschnitt von einem OS-Patienten zeigt deutliche zellulärer Pleomorphismus mit abgerundeten oder polygonalen Zellen, Anisonucleosis und mehrere Mitosen (Abbildung 2C). Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit und die Qualität des Modells BEM, sind beide Zelllinien in der Markhöhle BEM injiziert und überwacht mittels Fluoreszenz-Imaging während der 14-Tage-Kultur (Abb. 3A, B). Histologische Schnitten mit H & E Färbung zeigen, dass OS Zellen Muskel Rückstände beimessen und in dichten Haufen wachsen oder entlang der Knochenmatrix zu halten und vermehren. Periost und Endost sind durch die Ausdehnung des OS Zellen infiltriert. Auffällig ist, unterscheiden sich die Zelle Wachstumsmuster der OS-BEM Modell von zweidimensionalen Platte Kultur. Wie in Abbildung 3Cdargestellt, zeigen OS Zellen auf die decellularized BEM sehr heterogene Morphologie ähnlich wie die zytopathologischen Eigenschaften eines OS-Sektion. Einige OS Zellen Ortung in Spongiosa und Markhöhle sind kugelförmig und teilweise verbreitet heraus, während die Zellen entlang der Knochenhaut und Endost ruht in länglichen Zellen, begleitet von nuklearen Pleomorphismus extrem verteilt sind. Zell-Aktivität wird mittels Ki67 Immunostaining, das zeigt auch große Vorteile in langfristige Kulturen bestimmt. Auch OS Zellen in BEM Kultur hoch express Knochen Matrix Glykoprotein-abgesondert Protein sauer und reich an Cystein (SPARC/Osteonectin) – das ist spezifisch für osteoid Matrix (Abbildung 3D).
Abbildung 1 : Die strukturellen Merkmale der Maus decellularized BEM. (A, B) Übersicht der Maus native (A) und decellularized (B) Knochen. (C, D) Decellularization wurde von H & E Färbung der Maus native Tibia (C) und decellularized Knochen (D) bewertet. Zellkerne gefärbt mit Hämatoxylin konnte in native Maus Tibia, aber nicht in der BEM beobachtet werden. (E) IHC beflecken für Kollagen ich und Kollagen IV, die wichtigsten Komponenten von ECM, die konserviert werden in Maus Tibia nach Decellularization zu erkennen. Gelber Pfeil weist darauf hin das reichlich Kollagen ich innerhalb der Spongiosa und blauer Pfeil weist darauf hin das reichlich Kollagen IV in kompakten Knochen. Skalieren von Balken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Die zytomorphologischen Merkmale des OS. (A, B) Menschlichen OS Zellinien MNNG/HOS (A) und MG-63 (B) in Kunststoff-Flasche Kultur erweitert. Maßstabsleiste = 100 μm. (C) histologischen Abschnitt mit H & E Färbung des OS Patienten. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Charakterisierung von OS Zellen in decellularized Knochen extrazelluläre Matrix Modell. (A, B) Vertreter mCherry Ausdruck (rot) Bild MNNG/HOS (A) und GLP Ausdruck (grün) Bild des MG-63 (B) durch die Fluoreszenz-Mikroskopie nach Aussaat und Anzucht in BEM. Maßstabsleiste = 100 μm. (C) H & E Analyse zeigen typische Morphologie der injizierten MNNG/HOS und MG-63 Zellen nach der Kultivierung in BEM. (D) IHC Analyse auf Ki67 und SPARC Ausdruck MNNG/HOS Zellen nach Kultivierung in BEM Modell für 14 Tage. Die repräsentative Bilder sind zwei Sätze von Schnittserien gebeizt mit Ki67 und SPARC. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In der Regel OS so osteoblastischen klassifiziert werden können, Chondroblastic und fibroblastic je nach seiner dominierenden Bestandteil der histologischen Subtypen. Seine Prognose ist nicht nur abhängig vom histologischen Parameter sondern auch auf seine anatomischen Website. Es kann in den Knochen (in der intramedullären oder intracortical Fach), auf den Oberflächen von Knochen und extraosseous Seiten19auftreten. Die Entstehung und die Heterogenität der OS können als eine Konjugation von onkogenen Veranstaltungen und eine adäquate microenvironmental zu steigern, gefolgt von zunehmenden Entwicklung und Migration zu entfernten Organen20,21,22 aufgeklärt werden ,23. Geheimnis im Laufe der Evolution OS könnte mit einem richtigen Modell, klinische Implikationen auf die OS-Umgebung und Nischen zu skizzieren entziffert werden.
Anbau auf Kunststoffgeschirr oder im Fläschchen in Vitro kann kaum die dynamischen und komplexen biologischen Mikroumgebung rekapitulieren. Große Fortschritte der verschiedenen präklinischen Modellen (z. B. Maus, Zebrafisch und Hund) imitiert das Osteosarkom wurden erklärt und angewendet auf Pathogenese Untersuchung und Droge Entwicklung4,24,25, 26 , 27 , 28., Forscher immer noch Sorge um Versuchstiere aufgrund ihrer Beschwerden und Leiden während der Experimente. In-vitro- dreidimensionale Modelle wie unser decellularized BEM Modell hat den Vorteil durch Bequemlichkeit, schnelle Bedienung und Kostenersparnis; Es bietet langfristige und einfache Wartung der lebensfähigen Zellen oder Gewebe und ist auch näher an die heimischen biologischen Situation als Kunststoff Kultur. Es wurde in unserer Forschung demonstriert die phänotypische Heterogenität und Regulationsmechanismus der OS Entdifferenzierung mit Erfolg29eingesetzt.
Dieses Protokoll klären die Machbarkeit um ein Gewebe abgeleitet BEM von Maus zu generieren und Geweben von Mensch, Ratte und Hund verwendet werden. Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Etablierung und Anwendung von BEM sind: (i) vollständige Beseitigung der Trümmer der Zelle; (Ii) Wartung einer sterilen, gesunde Kultur Bedingung; (Iii) manuelle Geschicklichkeit und sanfte Pipettieren während der Injektion, Transfer und Kultur der OS-BEM Modell.
Andere berichteten Protokolle beschäftigen in der Regel Druckbeaufschlagung oder eine Kombination von chemischen und enzymatischen Behandlungen, wie Triton x-100, Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und DNase/RNase Lösung potente Decellularization30,31 zu erreichen . Das Knorpelgewebe, das Decellularization mit Reinigungsmitteln erfährt hat sich gezeigt, einschließlich Glykosaminoglykane32ECM-Komponenten zu entfernen. Um eine mehr intakt BEM weitest rekapitulieren, wird eine moderate, aber leistungsfähige Decellularization Methode hier durchgeführt, um die Auflösung und Schaden von Schlüsselkomponenten und native Architektur der Knochen Umwelt zu vermeiden.
Es ist jedoch nicht zu vernachlässigen, dass dieses Modell OS-BEM in einer Platte ohne strömendes Medium ruhte, daher führt zu einer ungleichmäßigen Verteilung von Sauerstoff und Nährstoffen. Vaskuläre Netzwerk und andere Zelle-Subtypen, die helfen, zur Regelung der Kommunikation und Interaktion von microenvironmental Signalen und Knochen Homöostase in Betracht24, 33,34, ergriffen werden müssen 35. hoffentlich wird dieses Modell mit anderen High-Tech-engineering-Techniken zu beleuchten OS Forschung und Guide-Präzision-Medizin kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren legen Wert auf die Unterstützung der Liuying Chen für ihre Amtshilfe und lange Zhao für seine hervorragenden technischen Betreuung während des Baus der Knochen extrazelluläre Matrix Gerüste. Diese Studie wird durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (31871413) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
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