Summary
Bein ekstracellulær matrix (BEM) modell for osteosarcoma (OS) er godt etablert og vist her. Den kan brukes som en egnet stillaset for mimicking primære tumor vekst i vitro og gir en ideell modell for å studere histologic og cytogenic heterogenitet av OS.
Abstract
Osteosarcoma (OS) er den vanligste og en svært aggressiv primær bein svulst. Det er preget med anatomiske og histologic varianter med diagnostiske eller prognostiske problemer. OS består av genotypically og svært heterogen kreftceller. Ben microenvironment elementene viste seg kontoen for svulst heterogenitet og sykdom progresjon. Bein ekstracellulær matrix (BEM) beholder microstructural matriser og biokjemiske komponenter av innfødte ekstracellulær matrix. Dette vev-spesifikke nisje gir en gunstig og langsiktige stillaset for OS cellen såing og spredning. Denne artikkelen inneholder en protokoll for utarbeidelse av BEM modell og videre eksperimentelle programmet. OS celler kan vokse og skille ut flere fenotyper samsvar med histopathological kompleksiteten av OS klinisk. Modellen kan også visualisering av ulike morphologies og deres tilknytning genetiske endringer og underliggende regulatoriske mekanismer. Som homologe til menneskelig OS, kan denne BEM-OS-modellen bli utviklet og anvendt patologi og klinisk forskning av OS.
Introduction
Osteosarcoma (OS) oppstår vanligvis i aktivt voksende områder, metaphysis av lange ben, i ungdomsårene. Mer enn 80% av de OS-berørte områdene har preferanse for metaphysis av proksimale tibia og proksimale humerus samt både distale og proksimale femur, tilsvarer plasseringen av vekst plate1. OS består av flere celle undergrupper med mesenchymal egenskaper og stort mangfold i histologic funksjoner og karakter. Bevisene støtter stamceller (MSCs), osteoblasts forpliktet prekursorer og pericytes som cellene opprinnelse2,3,4,5. Disse cellene kan akkumulere genetisk eller epigenetic endringer og gi opphav til OS under påvirkning av visse bein microenvironmental signaler. Både indre og ytre resultere i genomisk ustabilitet og heterogenitet av OS, med flere morfologiske og klinisk fenotyper6,7. Individualiserte terapier eller screening av nye stoffer må romanen modeller genereres til mot heterogenitet eller andre kliniske lidelser.
OS er en intra osseous ondartet solid svulst. Kompleksiteten og aktiviteten til rundt microenvironment elementer konferere fenotypiske og funksjonelle forskjeller på OS celler i forskjellige steder av en svulst. Bein ekstracellulær matrix (BEM) gir en strukturell og biokjemiske stillaset for mineral avsettelse og ubalanse. Den organiske delen av ekstracellulær matrix (EFM) består hovedsakelig av typen I kollagen utskilles av osteoblastic avstamning celler, mens den mineralholdig delen består av kalsium fosfat i form av hydroxyapatite8. ECM nettverk dynamisk rolle er å regulere celle vedheft, differensiering, cross-talk og vev funksjon vedlikehold9.
Demineralisert BEM og ECM hydrogels har blitt brukt i cellekultur og kan forbedre celle spredning10,11. Syntetisk Ben-lignende ECM kan regulere utvalgsstørrelsen, skjebne beslutninger og avstamning progresjon MSCs12,13,14. Videre bevis resultatene klinisk betydning for å gi osteogenic aktivitet av stimulerende cellulære prosesser under bein dannelse og regeneration15,16,17.
I denne artikkelen etablerer vår gruppe en endret modell og gunstig alternativ for tredimensjonale langsiktige kultur. OS cellene injisert i vev-avledet BEM presenterer en heterogeneously mesenchymal fenotypen lett sammenlignet med plast todimensjonal kulturer. BEM avledet fra områdespesifikke homologe vev viser sin dramatiske fordel som en innfødt nisje for OS celler i vitro og har stort potensial i OS teoretisk og klinisk forskning. Denne preget BEM-plattformen er enkel, men effektiv for i vitro forskning og kan forlenges i modellering flere kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr omsorg og bruk er gjennomført i henhold til nasjonale institutter for helse guiden og bruke forsøksdyr (NIH publikasjonen NO.80-23, revidert i 1996) etter godkjenning fra dyr etikk komiteen av Sun Yat-sen University.
1. bein forberedelse
- Få 4 til 6-uke-gamle BALB/c mus (uten sex-spesifikke krav). Euthanize en mus tas aseptisk ved cervical forvridning og kuttet av fersk fibula og tibia, femur fra en hindlimb med sterilt kirurgisk saks. Løsner epitel vev og fjern så mye av bløtvev som mulig ved hjelp av saks og pinsett.
- Skyll etappe Ben med sterilt 10 mM fosfat bufret saltvann (PBS) å fjerne blod i 6 cm parabol. Fordype bein i 75% etanol i 3 minutter, og skyll med PBS to ganger. Ren bein kan lagres i et sterilt 50 mL sentrifuge rør med sterilt PBS ved-80 ° C for måneder til nødvendig.
Merk: PBS brukes i alle følgende trinn har 10 mM PO43−.
2. bein demineralisering og decellularization
- Tine frossen bein i romtemperatur, og deretter fryse igjen ved-80 ° C for 1 h. underlagt bein mer enn 2-3 fryse-Tin sykluser for cellen lyse og vev sammenbrudd.
- Inkuber bein i et sterilt 50 mL sentrifuge rør med 0,5 N HCl over natten i romtemperatur på en rocking plattform eller orbital shaker med milde rocking/skjelvende å sikre komplett og selv dekning av bein.
Merk: Kontroller at beina er helt midt under bevegelse i syre og ikke slå under prosessen. Volumet av HCl løsning bør være mer enn ti ganger som bein. - Etter Avkalking, Dekanter HCl løsningen helt og skyll under rennende vann 1t. Deretter vaskes bein to ganger i 15 min per vask med destillert vann på en rocking plattform eller orbital shaker.
Merk: Husk å fjerne oppløsningen eller vann mellom vasker og etter siste vask med destillert vann. - Ekstra lipider i demineralisert bein med en 1:1 blanding av metanol og kloroform i en 50 mL sentrifuge tube innpakket med aluminiumsfolie 1t ved romtemperatur10.
- Deretter overføre bein i en annen tube metanol pakket med aluminiumsfolie for 30 min. fjerne metanol helt og skyll med destillert vann to ganger i 15 min med forsiktig risting. Dekanter siste vann og fortsette med fremgangsmåten under sterilt tilstand.
Merk: Under det utvinning steget er lys må unngås for å hindre kloroform nedbryting. Blandingen kan lagres i lys-resistente container eller en sentrifuge tube innpakket med aluminiumsfolie. Utføre all behandling og vask trinnene under beskjeden rotasjon eller rocking bevegelse. - Skyll bein i en 6 cm parabolen med sterilt PBS i 3 minutter, og deretter overføre bein i en ny 50 mL sentrifuge tube. Legg til 40 mL steril 0,05% trypsin-EDTA (TE) inn i røret og ruge bein for 23t i en CO2 inkubator 37 ° C18.
- Forkaste TE løsningen og skyll to ganger med sterilt PBS med 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin. Etter dekantere vin finalen vask PBS helt, fylle med 40 mL steril PBS. Vask grundig for 24 timer ved romtemperatur med milde rocking eller rister for antibiotika suge.
Merk: Alle sterilt PBS brukes i dette og følgende inneholder 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin. Overnatting vask under rotasjon eller rocking bevegelse utføres for lengre grundig nedsenking med antibiotika for å oppnå effektiv sterilisering av pore mellomrom. - Fjerne PBS og overføre bein i en fersk 50 mL sentrifuge rør fylt med sterilt PBS. Den forberedt fullt demineralisert og decellularized bein kalles bein ekstracellulær matrix (BEM) og kan lagres på 4 ° C for 2 måneder til nødvendig.
3. celle såing og kultur
- Ta ut BEM fra 4 ° C kjøleskap og Dynk kjeden i 75% etanol for 30 s, og skyll med PBS to ganger. Overføre BEM på en ren 6-vel celle kultur plate. Legg 2 mL fullstendig kultur medium (Dulbeccos endret Eagle's medium/F12 (DF12) som inneholder 5% fosterets bovin serum, 90 μg/mL ampicillin og 90 μg/mL kanamycin). Inkuber BEM overnatter i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Få menneskelige OS linjer (MNNG/HOS og MG-63). Suspendere ca 1.0 x 105 OS celler med 100 μL PBS med fenol rød som indikator.
Merk: For å bedre oversikt og observere flerlags celler innenfor en tre-dimensjonal BEM modell, MNNG/HOS og MG-63 er infisert med lentiviral vektor uttrykke fluorescerende mCherry og grønne fluorescerende protein (GFP). - Etter BEM er fullt dynket i medium, injisere OS celler i BEM fra proksimale eller distale epiphysis når nålen når det medullær hulrommet BEM. Inkuber OS-BEM modellen i minst 2 timer en fuktet 5% CO2 atmosfæren på 37 ° C å sikre injisert cellene overholder fast BEM.
Merk: Forvarm alle medier som brukes til cellekultur. Inkubator brukes for cellekultur har en fuktet 5% CO2 atmosfære på 37 ° C. - Legg 1 mL fullstendig kultur medium til platen til helt coat overflaten av BEM kulturen overnatter i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Forsiktig overføre OS-BEM modellen i en ny brønn av 6-vel plate med sterilt tweezer og refeed 1 mL frisk kultur medium. Kultur modellen i 14 dager i en CO2 inkubator på 37 ° C og Oppdater kultur medium ifølge spredning situasjonen OS celler.
- Holde overvåking middels farge og celle statusen under mikroskopet invertert fluorescens under kultur prosessen. Når OS cellene utvider platen, forsiktig overføre OS-BEM modellen til en ny med sterilt tweezer.
Merk: Kultur medium er rød ved pH 7.4, som er den optimale pH verdien for mest pattedyr cellekultur. Hvis mediet blir til oransje eller til og med gule, umiddelbart oppdatere medium for å opprettholde et sunt miljø for OS celler. - Overføre OS-BEM modellen til en ny brønn med pinsett og forsiktig skyll med PBS fjerne kultur medium. Deretter overføre til et 15 mL sentrifuge rør og fikse med 10% bufret formalin for histologiske identifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter demineralisering og decellularization synes BEM å være gjennomsiktig med sterkere elastisitet og fasthet i forhold til opprinnelige musen bein. En liten muskel rester og for medullær hulrom kan være tydelig observert (figur 1A, B). For å finne den effektive decellularization av BEM, er BEM innebygd i parafin etter fiksering, og deretter skiver 3 – 5 μm inndelinger for hematoxylin-eosin (H & E) flekker. Grundig fjerning av cellen kjerner vises av lyse-feltet tenkelig. Naturlig porøs struktur og kollagen nettverk ordningen er godt vedlikeholdt i decellularized BEM (figur 1C, D). I tillegg immunohistochemical (IHC) flekker av dominerende organisk komponenter av bein matrix, som kollagen jeg og kollagen IV viser ingen skade på ECM komponenter i decellularized BEM sammenlignet med de innfødte beinet (figur 1E). BEM gir derfor en egnet og lovende stillaset stor biocompatibility for OS celle såing og spredning.
MNNG/HOS celler forevise en svært atypiske morfologi med fint vacuolated cytoplasma, mens MG-63 celler har fibroblast-lignende spindled figurer i monolayer kultur (figur 2A, B). Histologiske delen fra en OS-pasient viser betydelig mobilnettet pleomorphism avrundet eller Mangekantet celler, anisonucleosis og flere mitoses (figur 2C). For å bekrefte levedyktighet og kvaliteten på BEM modellen, er begge linjer injisert inn i medullær hulrommet i BEM og overvåkes via fluorescens imaging under 14 dagers kultur (Figur 3A, B). Histologiske seksjoner med H & E flekker avslører at OS celler knytte til muskel rester og vokse inn i tykke hauger eller følge langs bein matrise og sprer. Både periosteum og endosteum er infiltrert av OS celler. Påfallende, avviker celle vekst mønstrene av OS-BEM modellen fra todimensjonal plate kultur. Som illustrert i Figur 3C, viser OS celler i den decellularized BEM svært heterogen morfologi ligner cytopathologic funksjonene i en OS-delen. Noen OS celler å finne i cancellous bein og medullær hulrom er sfærisk og delvis spredt ut, mens cellene hviler langs periosteum og endosteum er ekstremt spredt i avlange celler ledsaget av kjernefysiske pleomorphism. Celle aktivitet bestemmes ved hjelp av Ki67 immunostaining, som også viser store fordeler i langsiktig kulturer. Også OS celler i BEM kultur svært uttrykke bein matrix glykoprotein-utskilles protein syreholdig og rik på cystein (SPARC/osteonectin)-som er spesifikke for osteoid matrise (Figur 3D).
Figur 1 : Strukturelle egenskapene til musen decellularized BEM. (A, B) Oversikt over musen innfødte (A) og decellularized (B) bein. (C, D) Decellularization ble vurdert av H & E flekker av musen innfødt tibia (C) og decellularized bein (D). Kjerner med hematoxylin kunne observeres i native musen tibia, men ikke i BEM. (E) IHC flekker for kollagen jeg og kollagen IV oppdage hovedkomponentene i ECM som beholdes i musen tibia etter decellularization. Gule pilen peker rikelig kollagen jeg cancellous bein og blå pilen peker rikelig kollagen IV i kompakt bein. Skalere barer = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Cytomorphological kjennetegner OS. (A, B) Menneskelige OS cellelinjer MNNG/HOS (A) og MG-63 (B) utvidet i plast kolbe kultur. Skala bar = 100 μm. (C) Histopathologic delen med H & E farging av OS pasient. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Karakterisering av OS celler i decellularized Ben ekstracellulær matrix modell. (A, B) Representant mCherry uttrykk (rød) bilde av MNNG/HOS (A) og GFP uttrykk (grønn) bilde av MG-63 (B) av fluorescens mikroskopi etter såing og dyrking i BEM. Skala bar = 100 μm. (C) H & E analyse viser typisk morfologi av injisert MNNG/HOS og MG-63 cellene etter dyrking i BEM. (D) IHC analyse på Ki67 og SPARC uttrykk til MNNG/HOS celler etter dyrking i BEM modellen i 14 dager. Representant bildene er to sett med serielle delene med Ki67 og SPARC. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanligvis OS kan klassifiseres som osteoblastic, chondroblastic og fibroblastic subtyper avhengig av sin dominerende histologic komponent. Dens prognosen er avhengig ikke bare av histologic parametere men også på anatomiske området. Det kan oppstå inne bein (i mulig intramedulær eller intracortical rom), på overflater av bein og extraosseous områder19. Fremveksten og heterogenitet av OS kan bli belyst som en Bøyning av kreftfremkallende hendelser og en tilstrekkelig microenvironmental boost, fulgt av økende utvikling og overføring til fjerne organer20,21,22 ,23. Mysterium under OS utviklingen kan deciphered med en riktig modell skissere klinisk implikasjoner målretting OS miljø og nisje.
Dyrking på plast retter eller i flasker i vitro kan neppe recapitulate den dynamiske og intrikate biologiske microenvironment. Store fremskritt av ulike pre-klinisk modeller (f.eks mus, sebrafisk og hunden) mimicking osteosarcoma er erklært og brukt patogenesen etterforskning og narkotika utvikling4,24,25, 26 , 27 , 28. likevel forskere har bekymring for forsøksdyr sine ubehag og lidelser under eksperimenter. In vitro tredimensjonale modeller som vår decellularized BEM modell har fordelen sin bekvemmelighet, rask operasjon og kostnadsbesparende; Det gir langsiktig og enkelt vedlikehold av levedyktig eller vev, og er også nærmere innfødt biologiske situasjonen enn plast kultur. Det har vært brukt i vår forskning viser fenotypiske heterogenitet og regulatoriske mekanisme OS dedifferentiation med suksess29.
Denne protokollen avklart muligheten for å generere en vev-avledet BEM fra musen og kan brukes for vev fra menneske, rotte og hunden. De viktigste trinnene for vellykket etablering og anvendelse av BEM er: (i) fullstendig fjerning av celle rusk; (ii) vedlikehold av en steril, sunn kultur tilstand; (iii) fingerferdighet og mild pipettering under injeksjon, overføring og kultur av OS-BEM modell.
Andre rapporterte protokoller bruker vanligvis pressurization eller en kombinasjon av kjemiske og enzymatiske behandlinger, for eksempel Triton X-100, natrium dodecyl sulfate (SDS) og DNase/RNase løsning for å oppnå potent decellularization30,31 . Brusk vev som gjennomgår decellularization med vaskemidler har vist å fjerne ECM komponenter inkludert glycosaminoglycans32. For å recapitulate en mer intakt BEM i størst grad, utføres en moderat men kraftig decellularization metoden her for å unngå oppløsning og skader av sentrale komponenter og opprinnelige arkitektur i miljøet som bein.
Det er imidlertid ikke å bli neglisjert at denne OS-BEM modellen hvilte i en plate uten flytende medium, derfor fører til en ujevn fordeling av oksygen og næringsstoffer. Vaskulære nettverk og andre cellen undertypene som hjelper regulere kommunikasjon og samhandling av microenvironmental signaler og bein homeostase må tas i betraktning24, 33,34, 35. forhåpentligvis denne modellen vil bli kombinert med andre høyteknologiske engineering teknikker å belyse OS forskning og guide presisjon medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne verdi støtte fra Liuying Chen for hennes administrative assistanse og lang Zhao for hans utmerket kundestøtte under byggingen av bein ekstracellulær matrix stillaser. Denne studien er støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
- Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
- Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
- Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
- Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
- Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
- Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
- Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
- Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
- Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
- Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
- Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
- Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
- Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
- Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
- Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
- Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
- Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
- Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
- Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
- Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
- Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
- Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
- Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
- Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
- Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
- Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
- Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
- Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
- Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
- Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
- Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
