Summary
线虫是解剖寄主-病原体相互作用的良好模型。这里描述的是一个协议, 感染蠕虫与炎组链球菌成员, 并确定激活的氧化应激反应对 h2o2 产生的这一组生物。
Abstract
线虫是一种自由生活的线虫, 已成为研究宿主病原体相互作用的一个有吸引力的模型。该协议利用该模型通过 h2o2 的生产来确定群链球菌引起的致病性.炎群链球菌是一种新出现的威胁, 引起许多人类疾病, 如菌血症、心内膜炎和眼眶蜂窝炎。这里描述的是一个协议, 以确定这些蠕虫的生存响应 h2o2 产生的这一组病原体.利用氧化应激反应转录因子的基因skn-1编码, 表明该模型对于识别对链球菌感染至关重要的宿主基因非常重要。此外, 研究表明, 在这些病原体存在的情况下, 可以使用转基因记者蠕虫菌株监测氧化应激反应的激活, 其中 SKN-1 与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合。这些检测提供了一个机会, 研究氧化应激反应的 h2o2从一个生物来源, 而不是外源添加活性氧 (ros) 来源.
Introduction
Mitis 组链球菌是口咽腔1的人的共生体.然而, 这些生物可以逃离这个生态位, 并导致各种侵入性疾病2。这些微生物引起的感染包括菌血症、心内膜炎和眼眶蜂窝炎 2、3、4、5、6。此外, 它们正在成为免疫功能低下、中性粒细胞减少和接受化疗5、7、8、9 的癌症患者的血液感染的病原体..
由于很少发现毒力因素, 因此不清楚缓解组发病机制的机制。据悉, 它产生了 H2o2, 这已证明在口腔微生物群落中发挥了重要作用。最近, 几项研究强调了 h2o2 作为诱导上皮细胞死亡的细胞毒素的作用 11,12.属于这一组的肺炎已被证明会产生高水平的 h2o2, 从而导致肺泡细胞13的 dna 损伤和凋亡.使用急性肺炎动物模型, 同样的研究人员证明, 由细菌生产h2o2 具有毒力优势.对肺炎球菌性脑膜炎的研究也表明, 病原体衍生的h2o2 与气素协同作用, 引发神经元细胞死亡14.这些观察清楚地证明,这一组细菌产生的 h2o2 对其致病性很重要.
有趣的是, 还表明, 通过生产 h2o215 ,16, 群的成员会导致线虫的死亡.这种自由生活的线虫被用作研究许多生物过程的简单的、可遗传可操作的模型。最近, 蠕虫已成为研究宿主病原体相互作用的模型 17,18。此外, 一些研究强调了利用这种生物研究氧化应激的重要性19,20,21。其生命周期短, RNAi 能够击倒感兴趣的基因, 以及使用绿色荧光蛋白 (GFP) 融合记者来监测基因表达, 这些都是使其成为一个有吸引力的模型系统的一些属性。更重要的是, 调节蠕虫氧化应激和先天免疫的途径与哺乳动物20,22高度保守。
在该协议中, 它被证明如何使用线虫来阐明链球菌衍生的 h2o2 引起的致病性.改进的存活试验显示, 缓解组成员能够通过h2o2的生产迅速杀死蠕虫.利用缓解组的成员, 提供了活性氧 (ROS) 的持续生物来源, 而不是诱导蠕虫氧化应激的化学来源。此外, 细菌能够迅速对蠕虫进行殖民, 这使得 H2o2 可以直接针对肠道细胞 (与其他必须跨越几个屏障的来源相比)。该检测方法是: 1) 通过测定skn-1突变菌株的生存率, 或通过在蠕虫中使用 RNAi 击倒skn-1 , 相对于 n2 野生类型和病媒控制处理的蠕虫, 进行了验证。skn-1 是调节线虫 23,24, 25中氧化应激反应的重要转录因子。除了生存检测外, 还使用一种表示 SKN-1BC:GFP 转基因记者的蠕虫菌株,通过缓解组生产的 h2o2 来监测氧化应激反应的激活.
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Protocol
1. ty (Tod-hewitt 酵母提取物) 琼脂板的制备
- 对于1升的培养基, 在2升的 erlenmeyer 烧瓶中加入30克的 Tod-hewitt 粉、2克的酵母提取物和20克的琼脂。在烧瓶内加入970毫升去离子水, 并加入搅拌吧。在121°c 的温度和 15 lb ch 2 的压力下, 对介质进行高压灭菌30分钟。此后, 将介质放在搅拌板上, 并允许温和搅拌冷却。
- 将培养基倒入适当大小的无菌 Petri 培养皿 (100 毫米 x 15 毫米的培养皿用于细菌的生长和维护, 35 毫米 x 10 毫米用于杀死检测的菜肴) 在层流下。让介质在层流罩下干燥2小时。此后, 板材可在4°c 下存放1个月。
2. 线虫生长培养基 (NGM) 和 RNAi 饲料板 (NGM RNAi) 的制备
- 使用搅拌棒, 在 2l Erlenmeyer 烧瓶中溶解2.5 克的肽和3克的氯化钠970毫升的去离子水。在媒体上添加20克琼脂。在121°c 的温度和 15 lb* 英寸2 的压力下, 使介质在搅拌板上, 并允许温和搅拌冷却。
- 在制备 NGM 板的介质中加入以下溶液: 1 M 磷酸钾缓冲液的25毫升 (pH 值 = 6.0)、1 m MgSO4的 1 ml、1 m cacl2的 1 ml、(95% 乙醇中的 5 mgml) 胆固醇的 1 ml, 1 毫升 (乙醇中的 10% vw) 尼司他汀, 1 毫升 25 mgml 链霉素。
- 在制备 NGM RNAi 进料板的培养基中加入以下溶液: 1 M 磷酸钾缓冲液的25毫升 (pH = 6.0)、1 m MgSO 4 的 1ml、1 m ccl2的 1 ml、(95% 乙醇中的 5 mg/ml) 胆固醇的 1 ml1毫升 (乙醇中的 10% vw) nystatin, 1 mL 的 50 Mgml 卡比西林, 1 毫升的 IM IPTG。
- 将介质倒入层状流动下的60毫米 x 15 毫米无菌 Petri 培养皿中。让介质在层流罩下干燥2小时。随后, 板材可在4°c 下存放1个月。
3.线虫的维护
- 通过在板材中心发现50μl 的隔夜生长的大肠杆菌Op50, 将 ngm 板播种。大肠杆菌培养以前是在 LURIA-BERTANI (lb) 培养基中制备的, 在4°c 下储存数月。覆盖板材, 并允许它们在层流罩下干燥 24小时, 然后将其存放在聚苯乙烯容器中。
- 在解剖显微镜下, 用无菌蠕虫采摘, 取起10到12个妊娠成虫, 并将蠕虫转移到大肠杆菌op50 种子 ngm 板。在20°c 下连夜培育板材。
- 第二天, 用无菌的蠕虫采摘去除成虫, 让胚胎在 20°c (~ 2.5天) 发育成 L4 幼虫。
4. 蠕虫年龄同步种群的准备
-
用 M9W 清洗2到 4个 NGM 板的妊娠成年人, 并将其收集在15毫升的锥形管中。
- 制备 M9W: 将3克氯化钠、6克 na 2 hpo4和3克 kh 2 po 4, 最终溶解在1 升去离子水中.高压灭菌的溶液, 并添加1毫升的 1 m MgSO4。
- 将管旋转为 450 x g 1分钟, 然后将上清液装饰, 同时确保蜗杆颗粒保持完整。
- 加入 400μl 8.25 次氯酸钠 (家用漂白剂) 和 100μl 5n NaOH, 制备蠕虫裂解溶液。将裂解溶液加入蠕虫颗粒, 通过闪烁管混合物物, 直到70% 的成虫被裂解。在解剖显微镜下定期观察管的内容, 以确保鸡蛋不过度漂白。
- 在锥形管的内装物中加入10毫升的 M9W, 稀释漂白剂混合物。
- 将管以 450 x g的速度旋转 1分钟, 并加入10毫升的 m9w。
- 重复步骤4.5 两次。
- 将生成的蛋球在 M9W 的3-5 毫升中重新出现。将管放在管旋转器上。允许管材在室温 (RPM) 下连夜以18转/分的速度旋转。
- 第二天, 以 450 x g的速度将管旋转 1分钟, 使 l1 幼虫进入球团。通过吸入去除大部分 M9W, 在管内留下 ~ 250μl 的液体。将 L1 幼虫重新悬浮, 并将三个5Μl 滴的蠕虫悬浮液放在培养皿盖上, 然后使用解剖显微镜估计每μL 的蠕虫数量。
5. 蠕虫中 RNAi 的诱导
- 使用无菌循环或采摘, 从冷冻库存 (Ahringer 和 Vidal 库) 中取出所需的含有 rna 的大肠杆菌菌株, 制成100毫米 x 15 毫米 lb 琼脂板, 其中含有50μml 卡比西林和15μgml 四环素。在37°c 下将板材培育24小时。
- 将所需的 RNAi 菌株中的分离菌落采摘并接种到含有2毫升 lb 的无菌 15 mL 锥形管中, 并辅以50μgl 卡比西林。在37°c 时, 在150转/分的轨道振动台将管道培养16小时。
- 第二天, 使用无菌摊铺机将150μl 的隔夜培养物传播到65毫米 x 15 毫米 NGM RNAi 喂养板上。在37°c 下将板材培育24小时。
- 在37°c 孵育后, 让板材冷却到 RT。在大肠杆菌种子 NGM rnai 喂养板中加入适当体积的含有 ~ 200个 l1 幼虫 (从蠕虫步骤的年龄同步种群中获得)。在20°c 下培育板材, 直到幼虫达到 L4 阶段 (~ 2.5天)。
6. 米蒂斯组链球菌感染的制备
- 在100毫米 x15 毫米几乎不是的 TS 琼脂上, 将所需的链球菌菌株 (如果盘子存放在 4°C, 则先将盘子加热到 37°c, 然后再将相应菌株划伤), 然后在 37°c (~ 18小时) 处将其在提供微氧的蜡烛罐中孵育。环境为链球菌的成长 (条纹板可以在4°C 保存一个星期)。
- 为繁殖链球菌的临床分离株, 使用胰蛋白酶大豆血琼脂。在37°c 的温度下将盘子在蜡烛罐中连夜 (约 18小时)。
- 第二天, 从蜡烛罐中取出盘子, 用无菌循环选择孤立的菌落。接种含有2毫升硫汤的15毫升无菌锥形管。为繁殖链球菌的临床分离株, 用5% 的羊血补充硫代汤。拧紧瓶盖, 在静态条件下在37°c 下孵育管。
7. 生存检测
请注意:图 1描述了此检测中涉及的步骤。为了证明由缓解群得到的h2o2负责蠕虫的杀灭, 用过氧化氢酶补充培养基, 或突变菌株 spxb 和补充菌株spxB; spxb + s. gordonii可以被使用。SpxB 编码了一种丙酮酸氧化酶, 该氧化酶负责在亚克组中生产h2o2.
- 预热35毫米 x10 毫米 THY 板至37°c。添加80Μl 的隔夜培养所需的链球菌株, 并使用无菌摊铺机将细菌完全传播到琼脂表面。在37°c 的温度下将盘子在蜡烛罐中连夜 (约 18小时)。作为对照, 种子 2 35 毫米 x 10 毫米 NGM 板与80μl 隔夜生长的大肠杆菌Op50 培养物。在37°c 条件下隔夜培育板材。
- 为了确认由缓解组产生的 h2o2 负责杀死蠕虫, 在 thy 板上添加 50μl, 其中包含 1, 000 单位过氧化氢酶 c。使用无菌摊铺机将过氧化氢酶溶液铺开, 并允许板材在层流中干燥 30分钟. 然后将板材与步骤7.1 中所述的相应链球菌菌株一起播种。
- 第二天, 从蜡烛罐中取出盘子, 让盘子冷却到 RT 10-15. 使用无菌的蠕虫采摘, 将 30 l4 幼虫从 NGM 或 NGM RNAi 喂养板转移到链球菌种子 THY 板。使用两个种子的 THY 板, 每个菌株的链球菌总共有60个蠕虫。在25°c 下培育板材。
- 使用解剖显微镜, 在几个时间点计算每个板块上的活的和死的 L4 幼虫的数量。最初, 把虫子打分为死亡或每30分钟存活一次。此后, 当蠕虫迅速开始死亡时, 每隔15分钟给它们打分。使用无菌蠕虫采摘轻轻地推动蠕虫, 并确定它们是死是活。如果没有对刺激的反应, 蠕虫就被认为是死的。
- 该检测将需要5-6 才能完成。再重复两次实验。检测完成后, 将两个板块的数据集中起来。输入各组的数据, 比较生存曲线, 并使用统计软件进行卡普兰-梅耶尔生存分析。
8. 显微镜用琼脂糖垫的制备
- 通过微波加热, 将琼脂糖在去离子水中溶解2%。5毫升的溶液量足以准备20张幻灯片。
- 将实验室胶带纵向贴在两个玻璃幻灯片上。这将决定琼脂糖垫的厚度。在两个带胶带的幻灯片之间放置一个干净的玻璃滑梯。
- 将100μl 熔融琼脂糖放置在清洁滑块的中心。立即将另一个干净的玻璃放在熔融的琼脂糖上, 轻轻按下, 制成垫子。允许琼脂糖凝固并随后取出顶部幻灯片。琼脂糖垫已准备好使用。
9. 针对链球菌感染的SKN-1 定位观察
请注意:图 2描述了此检测中涉及的步骤。利用 SKN-1BC:GFP 转基因蠕虫菌株确定了 SKN-1 的定位。为了证明 SKN - 1 的定位 , 由于由群生产的 h2o2 , 采用了野生类型 ( WT ) 、 spxb 和补体菌株 spxb ; s . gordonii 的 spxb + . 此外, 还采用了转基因记者株 SKN-1BC:GFP 和 RNAi 干扰技术, 证明 p38 MAPK 通路的成分调节了 SKN-1 的定位。
- 预热35毫米 x10 毫米 THY 板至37°c。添加80Μl 的隔夜培养所需的链球菌菌株, 并使用无菌摊铺机将细菌完全传播到琼脂表面。在37°c 的温度下将盘子在蜡烛罐中连夜 (约 18小时)。作为对照, 种子 3 35 毫米 x 10 毫米 NGM 板与80Μl 隔夜生长的大肠杆菌Op50 培养物。在37°c 下将这些板培养约18小时。
- 第二天, 从蜡烛罐中取出盘子, 让盘子冷却到 RT 10-15. 使用 NGM 和 NGM RNAi 进料板中的 M9W 清洗 L4 幼虫。收集蠕虫在15毫升锥形管。
- 将管以 450 x g的速度旋转 1分钟, 分解上清液, 加入10毫升的 m9w。
- 再重复步骤9.3 三次。
- 将蠕虫重新悬浮在约25μl 的 M9W 中, 将蠕虫悬浮液的三个5Μl 滴放在干净的 Petri 培养皿盖上, 并用解剖显微镜估计每μL 的蠕虫数量。
- 在每个 THY 链球菌和 NGM 大肠杆菌种子板上加入 ~ 100个 L4 幼虫 。每株细菌使用三个盘子。在25°c 下将板材培育2至3小时。
- 此后, 从孵化器中取出盘子, 用 M9W 清洗, 并将蠕虫收集在15毫升的锥形管中。
- 按照步骤9.3 中的说明, 清洗蠕虫3倍。
- 通过吸入去除大部分 M9W, 并在蜗杆颗粒中加入含有 2 mM 氮化钠或 2 mM 盐酸四米索的 500ΜL M9W。这将麻醉蠕虫, 确保在显微镜下成像时不会发生任何运动。
注意事项:处理氮化钠时, 请使用个人防护设备 (PPE)。在化学引擎盖下准备氮化物溶液。 - 在 RT 中培养蠕虫颗粒15分钟。然后, 将蠕虫悬浮液的15Μl 斑点到准备好的琼脂糖垫上。轻轻地在装有麻醉蠕虫的琼脂糖垫上放置1.5 路盖板。
- 使用荧光显微镜, 利用 FITC 和 DAPI 滤波器可视化 SKN-1 的定位。10倍和20x 放大倍率下的图像蠕虫。
- 根据 SKN-1 的本地化水平对蠕虫进行评分。无核定位, SKN-1BC: 在蠕虫的前部或后部的 gfp 定位, 以及所有肠道细胞中的 SKN-1B:GFP 的核定位, 分别分为低、中、高定位。
- 在给荧光显微图打分后, 用统计软件用 che-squed 和 Fisher 的精确测试来确定统计差异。
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Representative Results
与突变体、唾液和 非致病性大肠杆菌50 ( 图 3a) 相比, 群的成员迅速杀死了蠕虫. 西叶、和 的中位生存率分别为 300 分钟、 300 分钟和 345 分钟。为了确定是否由 H2o2 介导杀灭, 过氧化氢酶补充到 thy 琼脂.在过氧化氢酶存在的情况下, 蠕虫的杀戮被消灭 (图 3b)。为了进一步证实链球菌衍生的 H2o2 是否介导了蠕虫的杀灭 , 分析了SPXB突变株、 Wt 菌株和补体菌株spxb ; spxb + 是否介导的蠕虫。与野生类型和补体菌株相比, 在Spxb突变株上没有观察到蠕虫的死亡 (图 3c)。这些数据表明, 由缓解群产生的 h2o2 介导蠕虫的杀灭.我们还观察到类似的杀虫动力学, 当蠕虫暴露在临床分离的炎群链球菌从癌症患者的血液中获得 (图 3d)。在此基础上, 对 h2o2 引起的致病性进行了评价。
为了识别对链球菌感染至关重要的宿主基因,将 skn-1击倒, 编码了线虫的氧化应激反应转录因子。然后, 比较了病媒控制处理蠕虫的生存率。与病媒对照处理蠕虫相比, skn-1敲除蠕虫的生存率显著下降 (图 4a)。利用skn-1突变株进一步验证了这一数据, 并将其生存率与 n2 野生蠕虫的生存率进行了比较。我们观察到类似于skn-1突变体的杀灭表型, 如skn-1 敲除所示, 这表明 skn-1 影响了群蠕虫的存活 (图 4b)。
其次, 确定了由缓解组产生的 h2o2 是否导致了 skn-1bc:gfp 在蠕虫中的本地化.在暴露于野生类型和补充污渍的蠕虫中观察到 SKN - 1BC : GFP 的局部化 , 而不是对s . gordonii的 Spxb 突变株的反应 (图 5a , b) .此外, 为了确定 SKN-1 的激活, p38 MAPK 通路的成分被击倒。观察到 SKN-1BC:GFP 在nsy-1、 sek-1、 pm-1和skn-1敲除蠕虫相对于病媒控制处理的蠕虫的定位减少。数据表明, 针对子组产生的 h2o2 (图 5c,d), 激活 skn-1需要 p38 mapk.
图 1: 流程图, 描述了准备生存检测所涉及的步骤.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 流程图, 描述在感染过程中对 SKN-1 进行本地化所涉及的步骤.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:h2o2介导的杀虫基团链球菌杀灭线虫.暴露于 (a)、、 、、唾液、突变和大肠杆菌op50 的 l4 幼虫的卡普兰-梅耶尔存活曲线. (b)在 1, 000 u 的过氧化氢酶存在的情况下,在ty 板上的 thy 板上存在着 gordonii、s. oralis、s. salis.、唾液、s. mutans和大肠杆菌op50。(c) n2 l4 幼虫上的spxb突变体和s-spxb 补体菌株.(d) VGS#3 、 VGS#4、西药(VGS#10)、西药(VGS#13) 和 大肠杆菌op50。这些数据代表了重复两次或两次以上的实验, 每个条件都有 n = 60个蠕虫。采用卡普兰-梅耶尔测井等级分析对生存曲线进行了比较, 并计算了中位生存率。P 值 < 0.05 被认为有统计学意义。经允许对这一数字进行了修改和调整。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: Skn-1 是蠕虫生存所必需的。戈多尼(a) 处理病媒控制的生存情况和接触 gordonii 的 skn-1敲除蠕虫。(b) 在s. gordonii 上喂养的 n2 和skn-1(z67) 突变蠕虫的存活。这些数据代表了重复两次或两次以上的实验, 每个条件都有 n = 60个蠕虫。采用卡普兰-梅耶尔测井等级分析对生存曲线进行了比较, 并计算了中位生存率。P 值 < 0.05 被认为有统计学意义。经允许对这一数字进行了修改和调整。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 链球菌 h2o2 介导的 SKN-1 激活依赖于 p38 mapk 通路. (a) skn-1bp 在暴露于 wt 的蠕虫中的本地化的代表性图像, spxb 突变体和 spxB; spxb +补体菌株的 s. gordonii. 特写镜头显示在每个图像的右上角。标度条 = 100μm. (b) skn-1bc:gfp 的核定位程度和在 wt 上输入的每个类别中蠕虫的百分比, Spxb 突变体和 spxB; spxb +补体菌株 s. gordonii. 与 WT 和spxb 、 spxb + 补体菌株相比 , Skn - 1bc : gfp 在 spxb 突变体 ( p & lt ; 0 . 0001)中的核定位水平明显较低 .(c) skn-1bp 在nsy-1、 se-1、 pm-1、skn-1敲除和病媒控制中定位的代表性图像. 特写镜头显示在每个图像的右上角。刻度条 = 100μm. (d) skn-1bc:gfp 核定位的程度和每个类别中蠕虫的百分比, 分别输入 nsy-1、 sek-1、 pmk-1、 skn-1敲除和处理病媒控制在 s. gordonii 上的蠕虫。与病媒相比, 在nsy-1 (p < 0.01)、 sek-1 (p < 0.001)、pmk-1 (p < 0.0001) 和 skn-1 敲除 (p < 0.0001) 中观察到 skn-1bc:gfp 的核定位水平明显较低. 控制在s. gordonii 上处理过的蠕虫。对接触到每个菌株的100多只蠕虫进行了成像, 并对实验进行了三次重复。经允许对这一数字进行了修改和调整。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
所述方法可用于其他病原菌, 如粪便肠球菌,它也产生在厌氧或微氧条件下生长的 h2o2 26. 通常情况下, 对于大多数病原生物来说, 完成生存检测需要几天到几周的时间。然而, 由于缓解组成员对 h2o2的稳健生产, 在所述条件下, 这些检测可以在5-6 内完成.这确保了能够在短时间内筛选出几个参与宿主免疫和氧化应激反应的基因候选体。
在该协议中,由细菌产生的 h2o2 与蠕虫的肠道细胞直接接触, 而不是其他必须跨越几个障碍的外源 ros 源.这确保了 H2o2被传递到肠道细胞;因此, 在蠕虫中观察到更有力的杀灭反应。使用荧光标记的细菌, 它被确定, 蠕虫必须暴露在病原体 30分钟, 完全定植肠道 15.建议使用少于1周的链球菌菌株条纹板, 以确保其活力和生产 H2o2的能力.此外, 链球菌菌株必须在微氧条件下生长, 才能获得最佳的 h2o2生产. L4 幼虫或1天的成年可用于此检测。实验中使用的所有蠕虫都必须具有相同的年龄和性别, 这一点至关重要。与年龄较大的雌雄同体相比, 更年轻的蠕虫往往死亡较慢。L4 动物更容易区分, 因为它们发育中的外阴在身体中部是可见的, 是与身体其他部位形成鲜明对比的明显补丁。同样重要的是, 没有大肠杆菌 op50 被转移到链球菌种子板。大肠杆菌杀灭板的污染会导致杀虫的衰减或教唆。为了避免污染, 有必要从大肠杆菌草坪上摘下蠕虫。在打分生存测试时, 建议观察咽部抽水、头部觅食行为和身体运动。为了确保蠕虫死亡, 建议轻轻地刺激鼻子、身体一侧或尾巴, 观察任何运动。
RNAi 喂养和蠕虫在缓解群的生存相结合, 以确定参与防御 h2o2 的候选人.利用对氧化应激反应转录因子进行编码的基因skn-1,说明了该基因对蠕虫对 h2o2 的生存要求. 因此, 这种检测可以适应筛选多个基因, 并确定氧化应激反应和免疫所需的潜在候选项。通过在表达大肠杆菌草坪的 RNAi 中加入年龄同步 L1 幼虫来实现蠕虫的 RNAi 喂养。在蠕虫同步协议中, 必须监测在漂白剂和氢氧化钠存在的情况下蠕虫角质层的裂解情况。成虫和幼虫的角质层会不断溶解, 而胚胎则被厚实的蛋壳部分保护。然而, 在氢氧化钠混合的存在下进行长时间的孵育可能会导致胚胎死亡。因此, 在漂白过程中, 定期在解剖显微镜下观察含有蠕虫的导管是非常重要的。同步协议中需要考虑的另一个步骤是维持被逮捕的 L1 幼虫。被捕的幼虫可在室温下在管式旋转器上保持5天。建议在孵化后1至2天内使用幼虫进行 RNAi 喂养。M9W 的长时间维护可能导致 dauer 阶段的形成。
最后, 利用一种表达 SKN-1 的转基因蠕虫与 GFP 融合, 监测在群存在的情况下氧化应激反应的激活情况。RNAi 显示, p38 MAPK 的成分是将 SKN-1BC:GFP 定位到肠道细胞细胞核所必需的。重要的是要使用这种菌株的 L3 或 L4 阶段来观察 SKN-1BC:GFP 的定位, 因为 SKN-1 的定位在成虫阶段往往会减少。为了更好地观察 SKY-1BC:GFP 的本地化, 建议使用 FITC 和 DAPI 筛选器设置将获得的图像重叠。由脂质素产生的自体荧光有助于观察蠕虫中的 SKN-1 定位。然而, 也有证据表明, 来自弱表达的 GFP 记者的信号被蠕虫肠道内各种来源发出的自动荧光所掩盖。自体荧光已被证明随着年龄的增长而增加, 并且在el. elegans27的肠道和子宫中最高。为了克服这个问题, 最近的一项研究利用三重波段 GFP 滤波器设置来监测 SKN-1BC:GP 在线虫28中的定位。此设置将 GFP 信号与自氟化分离, 分别在绿色和黄色通道中显示 GFP 和自荧光。
本协议中使用了线虫来研究宿主-病原体相互作用, 并确定由缓解群产生的 h2o2 是如何引起致病性的.更重要的是, 通过使用该模型, 可以研究h2o2 对内质网应力、线粒体损伤、线粒体吞噬、自体吞噬和氧化应激的影响. 此外, 还可以确定 h2o2 作为毒力因子的机制, 通过破坏细胞的核心过程来引起免疫反应.因此, 这种蠕虫被认为是一个强大的模型系统, 用于发现对宿主-病原体相互作用的新见解。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢王炳燕博士、德克萨斯大学牙科学院的 Gena Tribble 博士、Richard Lamont 博士 (路易斯维尔大学牙科学院) 和 Samuel Shelburne 博士 (MD Anderson 癌症中心) 提供了实验室和临床菌株。缓解组链球菌。我们还感谢基思·布莱克威尔博士 (哈佛医学院遗传学系) 的线虫菌株。最后, 我们感谢丹妮尔·加辛博士和她的实验室 (德克萨斯大学麦戈文医学院) 提供试剂和蠕虫来进行这项研究。一些蠕虫菌株是由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室 (P40 OD010440) 资助的 CGC 提供的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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