Summary
Detta protokoll beskriver ett detaljerat förfarande för ombildning och odling av mänskliga stamceller härledda nervceller som tidigare var differentierade från neurala progenitorer in vitro för flera veckor. Förfarandet underlättar Imaging-baserade analyser av neuriter, synapser, och sena uttrycker neuronala markörer i ett format som är förenligt med ljusmikroskop och hög innehåll screening.
Abstract
Neuroner åtskilda i tvådimensionell kultur från mänskliga pluripotenta stamceller-härledda neurala stamceller (NPCs) utgör ett kraftfullt modellsystem för att utforska sjukdomsmekanismer och utföra hög innehåll screening (HCS) att förhöra sammansatta identifiera gen Mutations fenotyper. Men med mänskliga celler övergången från NPC till funktionella, mogna neuron kräver flera veckor. Synapser börjar vanligen bildas efter 3 veckors differentiering i enskiktslager kultur, och flera neuron-specifika proteiner, till exempel den senare uttrycker Pan-neuronala markör Neun, eller lagret 5/6 cerebral kortikala neuron markör CTIP2, börja uttrycka cirka 4-5 veckor efter differentiering. Denna långa differentierings tid kan vara oförenlig med optimala odlingsförhållanden som används för små volymer, multi-well HCS-plattformar. Bland de många utmaningar är behovet av väl följs, jämnt distribuerade celler med minimal cell kluster, och kultur förfaranden som främjar långsiktig lönsamhet och funktionell synaps mognad. En metod är att skilja nervceller i en stor volym format, sedan replate dem vid en senare tidpunkt i HCS-kompatibla multi-brunnar. Vissa stora utmaningar när man använder denna replating tillvägagångssätt gäller reproducerbarhet och cellernas lönsamhet, på grund av stressande störningar i dendritiska och axonala nätverk. Här visar vi en detaljerad och tillförlitlig förfarande för enzymatiskt resuutgifterna Human inducerad pluripotenta stamceller (hipsc)-härledda nervceller efter deras differentiering för 4-8 veckor i en stor volym format, överföra dem till 384-väl i mikrotiterbrunnarna och odlade dem i ytterligare 1-3 veckor med utmärkt cellöverlevnad. Detta återskapande av mänskliga nervceller inte bara tillåter studiet av synapsen församling och mognad inom två veckor från att replating, men också möjliggör studier av neurit förnyelse och tillväxt kon egenskaper. Vi ger exempel på skalbara analyser för neuritogenesis och synaptogenes med en 384-well plattform.
Introduction
Human pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda nervceller är alltmer relevanta inom områdena grundforskning, läkemedelsutveckling, och regenerativ medicin. Arbetsflöden och förfaranden för att optimera sin kultur och underhåll, och förbättra effektiviteten av differentiering i specifika neuronala subtyper, utvecklas snabbt1,2. För att förbättra nyttan och kostnadseffektiviteten av mänskliga stamceller-härledda neuroner som modellsystem mottagliga för hög innehållsanalyser i Drug discovery och Target validering, är det lämpligt att minska den odlings tid som krävs för att generera mogna, funktionella nervceller, samtidigt bibehålla maximal robusthet, reproducerbarhet, och fenotyp relevans. Även om 3-dimensionell Organoid kulturer driver genombrott i neuroutveckling forskning3, 2-dimensionella enskiktslager kulturer är särskilt förenliga med automatiserade Imaging-baserade applikationer på grund av deras minimala vävnad tjocklek.
Anpassningen av avbildningsbaserade screeningmetoder till modeller av mänskliga neurologiska och neuroutvecklingsrelaterade sjukdomar står dock inför en stor utmaning. Den långvariga tidsram över vilken människans nervsystem mognar in vivo kräver förlängd tid i kulturen för att rymma naturliga program av genuttryck och uppnå neuronala mognad.
En praktisk konsekvens av den långa neuronala differentierings program är att upprätthållandet av hipsc-härledda enskiktslager kulturer måste upprätthållas i många veckor för att uppnå adekvat synaps mognad. Under denna tid, neurala progenitorer som förblir odifferentierade fortsätta att dela. Dessa kan snabbt överodla kulturen och tillskriva näringsinnehållet som krävs för att upprätthålla livskraftiga postmitotiska neuroner. Kraftigt dividera neurala stamceller (NPCs) kan också konkurrera med nervceller för tillväxt substrat. Detta kan göra sådana kulturer föremål för problem med dålig vidhäftning, ett tillstånd olämpligt för Imaging-baserade analyser. Dessutom, många utredare tycker att ju mindre kulturen volymen, desto större är svårigheten att upprätthålla friska populationer av differentierade neuroner tillräckligt länge för att Observera de sena stadierna av neuronala differentiering. Med andra ord, analyser av synapsen mognad med hög innehåll screening (HCS) metoder kan vara mycket utmanande för människa-härledda nervceller.
För att kringgå några av dessa problem, ett förfarande för resuspenering och återför ande tidigare differentierade hiPSC-härledda nervceller har använts. För det första, det tillåter studiet av neurit utväxt (eller, mer exakt, neurit förnyelse) i en population av fullt engagerade nervceller. För det andra, återplantering av tidigare differentierade neuroner från en stor volym format (som 10 cm plattor eller större), ner till små volym format (som HCS-kompatibla 96-eller 384-väl mikrotiter plattor) möjliggör en signifikant minskning av den totala odlings tiden i det lilla volym tillståndet. Detta underlättar studiet av synapsen församling och mognad under efterföljande veckor in vitro-.
Emellertid, den återplaning av mogna nervceller som redan har etablerat långa neuriter och en komplex anslutning nätverk presenterar flera utmaningar, varav en är den ibland höga och rörliga frekvensen av celldöd. Här beskriver vi ett replating förfarande som resulterar i utmärkt cellöverlevnad och reproducerbarhet. Vanligtvis, neuroner utsätts för proteolytiska enzymer för korta inkubationstider (typiskt ~ 3-10 min) för att lossa celler från underlaget före triturering. Denna korta proteolys tid används vanligtvis för att omlägga och passaging många typer av skiljande celler, inklusive icke-neuronala celler och odifferentierade stamceller4,5,6. Emellertid, för differentierade nervceller som bär långa, sammankopplade neuriter, det är viktigt att inte bara lossa celler från underlaget utan också att störa dendritiska och axonala nätverk för att isolera enskilda celler samtidigt minimera skador. Faktum är att en tjock meshwork av nervceller tenderar oftast att lossa från underlaget som ett enda ark, snarare än som enskilda celler. Om försiktighet inte vidtas för att lossa det tjocka nätet av neuriter, nervceller inte bara bli oåterkalleligt skadas under trituration, men många av dem misslyckas med att passera genom filtret används för att ta bort klumpar, vilket resulterar i dålig cell avkastning. Nedan beskriver vi en enkel modifiering av en allmänt använd proteasinkubations procedur för att motverka dessa svårigheter.
I protokollet som beskrivs nedan, neuroner inkuberas för 40-45 min med en mild proteas, såsom proteolytiska enzymet (t. ex., Accutase). Under de första 5-10 min efter tillsats av enzymet, lyfter neuronala nätverk bort från underlaget som ett ark. Inkubering med proteasen fortsätter för ytterligare 30-40 min innan du fortsätter med mild sönderdelning och filtrering. Denna extra inkubationstid hjälper till att säkerställa att nedbrytning av materialet slappnar av det intercellulära nätverket, vilket säkerställer att efterföljande sönderdelning ger en suspension av enskilda celler. Denna procedur maximerar likformigheten i cell fördelningen vid återplaning och minimerar celldöd. Vi har framgångsrikt tillämpat denna replating metod för att hipsc-härledda neuronala kulturer som genereras av olika differentiering protokoll7,8 och från olika rader av hipscs. Förfarandet är nominellt lämplig för användning med de flesta eller alla rader av stamceller härledda nervceller. Vi har konstaterat att en förlängd inkubationstid för proteas inte är absolut nödvändig för att återplantera kulturer från små format plåtar (t. ex. 35 mm diameter). men, som vi visar här, det ger en betydande fördel när återplaning från stora diameter plattor (t. ex., 10 cm diameter eller större), förmodligen för att neuriter i sådana plåtar kan förlänga mycket långa processer och bildar en tätt sammankopplade array.
Här visar vi denna metod och kortfattat illustrera dess tillämpning i analyser för tidig neuritogenes och för synapsen mognad, vilket innebär klustring av pre-och postsynaptiska proteiner längs dendriter och axoner, följt av deras senare colocalization på synaptiska platser. Exemplen belyser de fördelar som detta protokoll erbjuder för att bevara cellernas lönsamhet och reproducerbarhet. Först, det tillåter utredare att studera tidiga steg i mänskliga neuritogenes. Den experimentella inställningen liknar de vanligaste primära kulturerna av gnagare kortikala eller Hippocampus nervceller, där celler extraheras från sena foster eller tidig postnatal hjärna, dissocierade av sönderdelning efter mild proteasbehandling, och får initiera neuriter eller att återskapa neuriter som avskiljdes i förfarandet9,10. Liknar sådana gnagare primära nervceller, hipsc-härledda nervceller börjar bilda eller regenerera sina neuriter inom några timmar efter att ha återfått, vilket möjliggör avbildning av tillväxt koner och påverkar morfologi i en miljö som är optimal för hög spatiotemporal avbildning med färre omgivande odifferentierade celler. Vi har observerat att påverkar utväxt är mer synkroniserad jämfört med de rörliga förseningar och olika utväxt priser sett när neuroner först börja skilja från en stamfader population. Dessutom, replating möjliggör analyser av nervceller uttrycker neuronala subtyp markörer som typiskt visas senare i neurala utveckling, såsom kortikala lagret 5/6 transkription Factor CTIP2 (kyckling äggalbumin uppströms promotor transkription faktor-interagerande protein 2), eller den pan-neuronala markören NeuN11. En särskilt användbar funktion i den replating tillvägagångssätt är att synaptogenes vinning inom en tidsram kompatibel med HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentierings period före
- Differentiera nervceller på 10 cm rätter, med hjälp av ett protokoll av val7,8 tills neuroner har bildat ett tjockt nätverk med sina processer och uttrycker inte bara tidiga neuronala markörer som MAP2 eller TuJ1, men också sena markörer som Neun.
-
Ändra halva mediet val var 4 dagar under neuronala differentierings processen.
Obs: mer omfattande eller frekventa medium förändringar späda viktiga trofiska faktorer, och kunde ogilla mognad.- För iPSC-härledda WT126 neuroner, Använd följande odlingssubstrat efter differentiering: 5 mL 100x N2-tillägg, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL laminin, 200 μM askorbinsyra, 1 μM dibutyryl-cAMP och 10 mL SM1 för 500 mL Dulbecco ' s modifierade Eagle ' s medium/ näringsämnes blandningen F-12 (DMEM/F12). Gradvis, med hjälp av halv-Media förändringar, ersätta med neurala basal medium (tabell över material) och samma kosttillskott.
- För iPSC-härledda CVB WT nervceller, Använd följande efter differentiering odlingssubstrat: 500 mL neural basal ett medium (tabell över material) och 500 ml DMEM/F12 medium med 2 μg/ml laminin, 10 ml glutamin tillägg (tabell över material), 0,75 mg/mL natriumbikarbonat, 5 mL minsta essentiella medium (MEM) icke-essentiella aminosyror, 0,2 mM askorbinsyra, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 och 10 mL 100x N2-tillägg.
2. beläggning Multiwells
- Dagen för att replera, belägga med poly-L-Ornithine (PLO). Lös PLO i sterilt vatten för att göra en stamlösning (10 mg/mL). Förvara detta lager vid-20 ° c. Späd PLO 1:100 i vatten för att ge en koncentration på 50 μg/mL vid beläggning av glas och 1:1000 (10 μg/mL) vid beläggning av plast.
- Applicera beläggningen direkt på mål plattorna. Använd den mängd beläggning som är lämplig för plattans storlek (dvs. för en 24-vält platta applicera 500 μL av PLO-lösning per brunn).
- Låt plattorna sitta i mörker över natten vid rumstemperatur.
- Hämta belagda plåtar på dagen för att replating och överföra till en steril biosäkerhets skåpet.
- Aspirera PLO-lösningen och skölj två gånger med sterilt vatten.
- Späd laminin (1,15 mg/mL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 1:400 spädning.
Anmärkning: Tina laminin vid 4 ° c och Lägg snabbt till PBS för att undvika aggregering av laminin och ojämn beläggning. - Aspirera sterilt vatten och applicera 500 μL laminin-beläggning på brunnar som tidigare bestruket med PLO.
- Placera plattorna i en inkubator på 37 ° c i minst 4-6 h. Använd längre inkuberingar, upp till 16 timmar, för glasytor. Använd konsekventa inkubationstider.
3. replating differentierade neuroner
- Skölj plattan av differentierade neuroner med PBS en gång försiktigt. Skingra PBS försiktigt ner väggen på plattan, och inte direkt på cellerna, för att undvika att störa dem.
- Försiktigt aspirera PBS, är noga med att undvika att röra cellerna direkt utan att aspirera från kanten av skålen medan tippa den mot forskaren.
- Applicera minst 1 mL av det proteolytiska enzymet (tabell över material) per 10 cm platta och returnera celler till inkubator. Lägg till något högre volymer om vävnads odlingsrummet uppvisar en hög Avdunstningshastighet på grund av låg luftfuktighet.
- Inkubera celler med proteolytiska enzym för 40-45 min för att lossa dem från plattan och för att lossa dem från andra nervceller inom neuronala nätverk.
Anmärkning: Timing i detta steg är kritisk. Släckning proteasen för tidig sort kan leda till ökande celldöd efter att ha replating. Den proteolytiska enzym tillverkaren rekommenderar att temperaturer som är mycket lägre än 37 ° c användas med längre inkubationstider för passaging cell linjer (t. ex. över natten vid 4 ° c). Emellertid, hantering av nervceller vid 4 ° c bör undvikas, eftersom de ofta visar dålig överlevnad efter kall exponering. Tillverkaren anger också att en 60 min inkubation med enzymet vid 37 ° c leder till dess enzymatiska inaktivering. Men i författarnas erfarenhet, en 40-45 min inkubation av hiPSC-derived neuronala kulturer vid 37 ° c är tillräcklig för effektiv dissociation och utmärkt neuronala överlevnad vid återplanande. - Kontrollera nervceller på en fas-kontrast Mikroskop under inkubationstiden och tillåta proteas behandling för att fortsätta tills neurala nätverk helt lossnar från plattan och börjar bryta isär i mindre ark på kort skaka plattan under Mikroskop.
- Släcka proteasaktiviteten med 5 mL färskt DMEM-medium per 1 mL proteas i 10 cm plattan för att stoppa matsmältningen. Försiktigt triturera celler mot plattan 5-8 gånger för att störa nätverket, med hjälp av serologiska pipetter. Var noga med att inte tillämpa för mycket tryck när triturating, som differentierade nervceller är bräckliga. Använd inte en P1000 spets, eftersom slutet är för skarp och smal, och därmed kan skira eller skada nervceller.
- Applicera lösning med celler genom en cell SIL med 100 μm diameter mesh i en ny 50 mL koniskt rör droppe för droppe.
- Skölj SIL med ytterligare 5 mL färskt DMEM-medium, efter att cellerna har filtrerats igenom.
- Spinn celler i bänkskiva centrifug vid 1 000 x g i 5 min.
- Returnera koniskt rör till biosäkerhets skåpet och aspirera det mesta av mediet och lämna runt 250 μL för att säkerställa att cellerna behåller fukt.
- Omsuspendera cellerna varsamt i 2 mL färskt DMEM-medium. Pipettera inte pelleten mot sidan av röret. Istället, försiktigt Invertera koniska 2-3 gånger och passera celler genom slutet av en 5 mL serologiska Pipettera att ta bort dem.
- Applicera 10 μL resuspenderade neuroner på kanten av en hemocytometer.
- Tillsätt 8-10 μl trypan-blått till dropp-celler för att bedöma cellernas lönsamhet under det här återfjädrande steget. Applicera 10 μL av denna blandning på hemocytometern eller andra automatiska cell räknare. Bedöma som livskraftiga de celler som är fas ljusa och utesluta trypan blå färg.
- Bestäm mängden livskraftiga celler/mL, och Förbered att späda ut innehållet i det koniska röret enligt önskad celltäthet.
- Tallrik ~ 10 000 celler per brunn för en 384-brunn tallrik; tallrik ~ 150000-200000 celler per brunn för en 24-brunn tallrik.
- Tillsätt färsk DMEM till det koniska röret av återsuspenderade celler för att uppnå lämplig utspädning och tillsätt ytterligare lämpliga kosttillskott såsom B27 och/eller BDNF, beroende på kraven för den specifika cellinjer.
- Luta försiktigt koniskt rör för att blanda 2-3 gånger.
- Aspirera laminin beläggning från 24-brunnen plattan, eller från 384-väl multispot plattan med en 16-kanals Pipettera och skölj en gång med PBS.
- Aspirera PBS med hjälp av en P1000 för 24-brunnen plattan, eller 16-kanals pipetten för 384-bra tallrikar.
- Applicera cell lösning på varje brunn i en siffra åtta rörelse för att undvika klumpar. Bordläggningen enhetlighet kan också optimeras med hjälp av automatiserade vätskehanterings anordningar.
Anmärkning: Tillsats av laminin till media med början 2-4 dagar efter återför ande också bidrar till att upprätthålla en homogen fördelning av cellerna. - Upprepa steg 3,19 och 3,20 för varje brunn.
- Returnera plattan till inkubator inställd på 37 ° c och 5% CO2.
- Efter 2 dagar, börja ändra halva mediet var 4 dagar med hjälp av den efter differentiering odlingssubstrat som beskrivs i avsnitt 1,2. Efter önskad mogning tid, Fix kulturer med 3,7% formaldehyd vid 37 ° c och fläcken celler enligt de experimentella kraven.
4. cellviabilitet som analyser efter
- Lägg till den tidiga celldöd reportern (vivafix: 0,5 μl av 50 μl stamlösning per 500 μl kulturmedia per brunn) efter en kort vortexa av stamlösningen.
- Bild levande och döda celler odlade på glas-botten multiwells, efter 20 min, utan någon tvättsteg, eftersom färgen fluorescerar bara en gång inne i cellerna, eller Fix och co-fläcken med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och/eller andra antikroppar före avbildning med hjälp av ett konfokalmikroskop.
5. immunofärgning
- Fix kulturer med 3,7% formaldehyd i PBS plus 120 mM sackaros för 20 min vid 37 ° c.
- Skölj och permeabilize med 0,2% Triton X-100 för 5 min vid rumstemperatur, och sedan blockera för 30 min med 2% bovint serum albumin (BSA).
- Aspirera BSA utan att skölja och inkubera i 1 h vid rumstemperatur med kanin anti-MAP2 antikropp 1:1000, mus anti-β3 tubulin (TuJ1) antikropp 1:2000, kyckling anti-NeuN antikropp (1:100) och råtta anti-CTIP2 antikropp (1:500), eller med mus anti-PSD95 ( 1:200), kanin anti-synapsin 1 (1:200) och Chicken anti-MAP2 antikropp för synaptisk färgning.
- Skölj med PBS och inkubera med Alexa fluor-konjugerade sekundära antikroppar plus DAPI för 45 min vid 37 ° c.
- Slutligen, tvätta två gånger med PBS före avbildning.
6. kalcium avbildning
- Infektera odlade celler med AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Salk Institutet för biologiska studier, GT3 Core Facility) vid 10 dagar efter återför ande och bild för att bedöma spontana kalcium transienter vid 3-4 veckor efter återför Ande.
7. bild anskaffning och-analys
Anmärkning: För närmare uppgifter om förvärvs systemet hänvisas till Calabrese et al.12.
- Använd en bildmodul för manuell eller automatiserad Bildinsamling och en bildanalysmodul, till exempel CellProfiler13, för morphometriska mätningar.
- Beräkna genomsnittlig längd av TuJ1 positiva neuriter och MAP2 positiva dendriter genom att mäta total längd per synfält dividerat med antalet neuroner (DAPI + MAP2 eller TuJ1 positiva celler) inom samma område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den replating av hiPSCs-härledda nervceller som har differentierats för flera veckor erbjuder flera fördelar. Men, koppla loss och replating differentierade nervceller som har långa, sammankopplade dendriter och axoner (figur 1A) kan resultera i en hög fraktion av oåterkalleligt skadade nervceller.
Som beskrivs i avsnittet protokoll, vi använde inkubering med ett proteolytiskt enzym för att lossa nervceller från underlaget. Typiskt, på grund av deras tjocka meshwork av neuriter (figur 1A), cellerna tenderar att lossa alla på en gång som en enda syncytial-liknande skikt, som ofta börjar flyta i brunnen (figur 1C). Detta händer ganska snabbt, och är kanske därför de flesta laboratorier tenderar att samla in cellerna efter bara 5 min av inkubation med deras proteolytiska enzym val, och att omedelbart bryta sönder arket av celler genom sönderdelning (Pipettera upp och ner). Emellertid, denna mekaniska manipulation verkar resultera i hög stress för nervceller. Vi anser att graden av stress kan vara proportionell mot det område som täcks av neuronala nätverk, eftersom vi finner att den uppenbara skadan från otillräcklig proteasinkubation är större för 10 cm eller större plattor än för 35 mm eller mindre plattor. Således, counterintuitively, fann vi att förlänga enzymatisk inkubation till 40-45 min minskar celldöd vid tidpunkten för cell dissociation (figur 1C) och möjliggör effektivare återhämtning av levande, friska celler som avger processer över timmar (figur 1B). Förmodligen, den utökade inkubationstiden med ett milt proteolytiskt enzym tillåter partiell nedbrytning av proteiner som starkt fäster celler och deras processer till varandra och till den extracellulära matrisen. Detta gör att resuspension processen att arbeta effektivt för att separera enskilda celler utan behov av alltför kraftig trituration.
För att kvantifiera effektiviteten hos det utökade enzym inkubations förfarandet utvärderade vi lönsamheten för suspenderade celler omedelbart efter triturering med trypan Blue (figur 1C), och senare vid 1, 3 och 7 dagar efter att ha återanvänt en tidig cell döds markör (figur 2). Omedelbart efter triturering indikerade trypan Blåfärgning att det var betydligt större celldöd efter en 5 min inkubation jämfört med en 45 min inkubation med det proteolytiska enzymet (figur 1C). De två iPSC linjer som vi använde för att illustrera denna observation var differentierade i nervceller från den neurala progenitorceller scenen med hjälp av olika protokoll, och visade i stort sett olika känslighet för replating förfarande. Kulturer från WT126 linje differentierade till NPC: er med hjälp av "Rosette urvalsmetoden"7 var känsligare för skador än kulturer differentierade från CVB WT24 linjen med hjälp av en snabb differentiering metod8. För båda linjerna var dock graden av omedelbar celldöd ungefär halverad med hjälp av det utökade enzym inkubations förfarandet.
Efter att ha återfått uppvisade kulturer en ungefärlig fördubbling av cellernas lönsamhet under efterföljande dagar med hjälp av det utökade enzym inkubations förfarandet, vilket bestäms av densiteten hos DAPI-positiva celler (figur 2B, graf till vänster). Dessutom resulterade den utökade enzym inkubationen i en lägre densitet av döda eller döende celler som detekterades med hjälp av ett Dye-uteslutnings-Kit (figur 2B, graf till höger). Andelen döda celler som detekterades med hjälp av lönsamhetsanalysen efter 24 timmar efter att ha återfått sin verkan var högre än den som sågs med trypan Blue omedelbart efter triturering. Detta återspeglar förmodligen ansamling av döda och döende celler under dessa första 24 h, även om det är också möjligt att genomförbarheten analysen känsligare upptäcker celldöd än trypan blå analysen. Döda celler fortsatte att upptäckas under 1-7 dagar efter replating (figur 2B). Den inledande bordläggningen densitet för både experimentella grupper (5 min och 45 min) var identisk och baserad på hemocytometern levande celler av den post-trituration cellsuspensionen. Viktigare, vid alla tidpunkter post-replating, antalet levande, friska celler var ungefär fördubblats efter 45 min enzym inkubation jämfört med 5 min inkubation. Dessa observationer bekräftades kvalitativt med hjälp av faskontrast mikroskopi för att övervaka cellmorfologi vid varje steg: innan de återplanterades, under replating, och efter att ha återfått (figur 1 och figur 2).
En av fördelarna med att återplantera hiPSC-härledda neuroner efter att de har differentiera i flera veckor är att de flesta av cellerna kommer att ha lämnat stamcellsstadiet och bli engagerade i en neuronala fenotyp vid tidpunkten för att replating. Övergångsfasen av neuronala differentiering från neurala stamceller äger rum under flera dagar, med större antal celler gradvis uttrycker tidiga neuronala markörer, såsom beta-III tubulin (detekteras av antikropp TuJ1) eller MAP2. Genuttryck utvecklas under flera veckor, så småningom resulterar i uttryck av sena steg Pan-neuronala markörer, såsom NeuN, eller cell-typ specifika markörer för kortikala neuroner såsom CTIP2. Därför, den replating av tidigare differentierade hiPSC-härledda nervceller tillåter en att studera tidiga och övergående neuronala händelser, såsom neurit initiering, i identifierade subtyper av nervceller. Figur 3 illustrerar den omedelbara närvaron av tidiga neuronala markörer i kulturer som var replated efter 4 veckors för differentiering i en större kultur maträtt. Observera att NeuN-och CTIP2-uttrycker nervceller är lätt att identifiera inom några dagar efter replating (figur 3). Egenskaper och timing av neuronala differentiering kan variera mellan hiPSC linjer. För WT 126 linje och CVB WT24 linjer som vi beskriver här, 85 ± 12% (n = 2) och 52 ± 11% (n = 5) av cellerna, respektive, uttryckt immunoreaktivitet för βiii-tubulin markören TuJ1 vid 4 dagar efter att ha återanvänt den utökade proteas inkubations förfarandet. För båda linjerna, 30-40% av cellerna, och 80-90% av nervceller också uttrycka lagret 5/6 neokortikala markör CTIP2. Förutom förbättrad lönsamhet, utökade proteasprotokollet också måttligt förstärkt neurit utväxt (genomsnittlig neurit längd per neuron), som visas i figur 4. Både total neurit längd (kvantifierad med antikropp Tuj1, som fläckar både axoner och dendriter; Figur 4 B, vänster graf) och Dendrit tillväxt (kvantifieras med hjälp av MAP2, som fläckar endast dendriter; Figur 4 B, mittgraf) gynnades vid användning av det utökade proteasinkubations förfarandet. Observera att grafen för DAPI-positiva (DAPI (+)) celler räknas i figur 2 är baserade på samma bildexempel som cellen räkna diagrammet i figur 4, men i figur 2 de kvantifierades med hjälp av en icke-automatiserad metod som biträds av Fiji Software, även i figur 4 de kvantifierades med hjälp av automatiserad bildanalys mjukvaruplattform cellprofiler. Dessa två bildanalysmetoder gav liknande resultat.
Replating är användbart inte bara för att studera neurit utväxt, men också att studera synapser eller andra senare visas biologiska egenskaper hos nervceller. Faktum är att efter bara en vecka efter replating vi Observera markörer för många presynaptiska och postsynaptiska proteiner dekorera neuronala dendriter i ett punktat mönster (figur 5a). Efter 4 veckor börjar vi också att upptäcka deras colocalization, vilket är en indikator på bildandet av funktionella synapser (figur 5A). Dessutom är elektrisk aktivitet från spontan depolarisering och synaptically drivna strömmar detekterbar med hjälp av kalcium avbildning (figur 5B) eller Multielektrod matriser (MEAS).
Figur 1 : Överlägsen bevarande av neuronala lönsamhet efter längre inkubering med proteolytiska enzymet för cell dissociation. (A) faskontrast bild av NPC-härledda neuroner differentierade för 3 veckor. Den inramade regionen i den vänstra bilden förstoras till höger. I detta skede nervceller har långa processer, som bildar en tjock meshwork. Skalstreck = 80 μm (vänster); 35 μm (höger). (B) utvalda bilder av hipsc-härledda neuroner vid 1 och 5 dagar efter replating. Skalstapel = 100 μm. (C) vänster: cellerna lossnar som ett enda ark inom några minuter efter initiering av proteasbehandling. Skalstapel = 200 μm. Höger: efter att sönderdelning celler räknas på hemocytometern innan de är replating. Grafer visar kvantifieringen av icke-viabla, trypan-blå positiva celler efter 5 min eller 45 min inkubation med proteolytiska enzymet för två olika linjer CVB WT24 (* * * p < 0,0003, ej parade t-test) och WT 126 (* * * p < 0,0001, ej ihopparad t-test). Värden representerar medelvärdet ± S. E. M av 4 individuella replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Neuronal livskraft efter flera dagar efter att ha replating. (A) bilder av WT126 NPC-derived neuroner vid 1 och 3 dagar efter återplaning med 5 min och 45 min proteas inkubering. Döende celler är märkta med den känsliga tidiga celldöd reporter. Motsvarande brightfield-bilder visas till vänster. Vissa cellulära skräp (blå pil) upptäcks vanligtvis efter att ha återfått, särskilt i 5 min-gruppen. Skalstreck = 150 μm. (B) bilder av CVB WT24 NPC-härledda kulturer vid 1, 3 och 7 dagar efter att ha replating med 5 min och 45 min proteas inkubation. Döende celler är märkta med den känsliga tidiga celldöd reporter (röd). Alla kärnor av levande och döende celler är märkta med DAPI (cyan). Den sammanslagna vita signalen representerar DAPI och VivaFix-positiva (+) celler. Några celler visar VivaFix färgning men saknar DAPI färgning (röda celler i den kombinerade bilden till höger); dessa är sannolikt celler som var döda i många timmar. Skalstreck: 25 μm. Höger graf visar kvantifiering av fraktionen av döda celler (VivaFix/DAPI) efter olika inkubationstid med det proteolytiska enzymet (5 min vs 45 min: * p < 0,05 1 d och * * * p < 0,001, 3 d; tvåvägsanova, följt av multicomparison Bonferroni post hoc test). Vänster graf visar förändringar i den totala CELLTÄTHETEN (# DAPI (+) celler för 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 för alla tidpunkter; tvåvägsanova, följt av multicomparison Bonferroni post hoc test). Alla värden visas som medelvärdet ± S. E. M av 3 replikat, med minst 1 500 celler gjorda per tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Detekterbart uttryck av sena Stadium neuronala markörer omedelbart efteratt ha återfått. Kulturer av CVB WT24 hiPSC-härledda celler avbildas 4 dagar efter att ha återtagit, med hjälp av 45 min proteasinkubering, från en 10 cm maträtt som hade differentierats från NPC scenen för 4 veckor. Exempel som visas färgas för Pan-neuronala markörer TuJ1, MAP2, eller NeuN; eller den djupa skikt kortikala pyramidala neuron markör CTIP2. Notera närvaron av omfattande neuriter, och det robusta uttrycket av TuJ1 och MAP2. Observera särskilt att en betydande del av nervceller också uttrycker sena scenen markörer NeuN och CTIP2. Scale bar = 16 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Neurit och Dendrit tillväxt över tid efter kortare och längre enzym inkubation under replating. (A) REPLATED CVB WT24 hipsc-härledda neuroner utvidga snabbt neuriter, som upptäcks med hjälp av antikropp Tuj1. Observera att den förlängda proteasinkubations tiden främjar neuritogenes. Skalstapel = 25 μm. (B) kvantifiering av neurit och Dendrit längd, under 1, 3 och 7 dagar efter återför ande med antingen 5 min eller 45 min proteas. Total neuritlängd kvantifierades från TuJ1 (βIII-tubulin) färgning; Dendrite-specifik färgning kvantifierades från MAP2 Färgnings SNF korrigerad för den totala CELLTÄTHETEN (höger graf). Alla värden visas som medelvärdet ± S. E. M av 3 replikat. Neurite längd 5 min vs 45 min: * p < 0,05 på 1 dag och 7 dagar, * * p < 0,01 på 3 dag; Dendrit längd 5 min vs 45 min: * * p < 0,01 på 1 dag och 3 dagar, inte betydande (NS) vid 7 dag; # DAPI (+) 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 för alla tidpunkter; tvåvägsanova, följt av multicomparison Bonferroni post hoc-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Synaptogenes och spontana kalcium transienter i differentierade hiPSC-härledda neuroner efter att ha återfått. (A) vänster: vid 4 veckor efter replating med hjälp av den utökade proteas inkubering protokollet, presynaptiska markör synapsin 1 är detekterbar i punktat kluster längs MAP2 positiva dendriter. Skalstreck = 5 μm. Höger: vald dendritiska regionen visar colocalization mellan presynaptiska och postsynaptiska kluster (gula pilen), en indikation på potentiellt aktiva synapser. Skalstreck = 1,5 μm. (B) vänster: hipsc-härledda nervceller infekterade med AAV8-syn-jGCaMP7f-wpre användes för att övervaka spontana kalcium transienter som drivs av nätverksaktivitet. Den brightfield bilden visas intill den bitars rendering av GCaMP7 fluorescens vid en enda tidpunkt i Time-lapse-serien. Skalstapel = 25 μm. färgade siffror indikerar de 4 valda cellerna där GCaMP7 fluorescens mättes över tiden, vilket visas i spåren till höger. Varje färgad spår motsvarar en cell. Asterisken pekar på tiden under den liveinspelning som bilden till vänster motsvarar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Arbetsflöde för att återskapa procedurer till kultur hipscs för hög innehåll screening och/eller detaljerade studier av differentiering och påverkar utväxt eller MEA inspelningar. Från en differentierad kultur av nervceller som odlas för 4 eller fler veckor i ett större format (t. ex. en 10 cm kultur skålen), neuroner inkuberas med ett proteas för 40-45 min, triturerades försiktigt att separera och Omsuspendera. Cellerna distribueras sedan till flera brunnar som är kompatibla med HCS, återplanterad på substrat som är kompatibla med avbildning tillväxt koner (gula pilen) eller andra strukturer, eller på flera brunnar lämpar sig för multielektrod array inspelningar. Skalstreck = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (från vänster till höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat en rättfram förfarande för resuspension och återskapande av mänskliga neuronala kulturer som optimerar lönsamheten, differentiering framgång, och subcellulär avbildning på ett sätt som är förenligt med hög innehåll screening plattformar, och andra analyser som är relevanta för läkemedels upptäckt. Figur 6 illustrerar det övergripande arbetsflödet och exempel på sådana program.
Även här fokuserade vi på hiPSC-härledda nervceller som är riktade mot en kortikal neuron öde, vi förväntar oss att denna metod bör vara lika tillämpliga på mänskliga embryonala stamceller härledda nervceller, och stamceller härledda nervceller riktade mot andra neuronala fenotyper14,15,16,17,18. Dessutom förutsätter vi att detta utökade proteasförfarande kan vara fördelaktigt för andra situationer som kräver resuspension av celler som har ett etablerat neurit meshwork, till exempel för FACS sortering eller Single-cell analyser av primära nervceller19 , 20.
Replating hiPSC-härledda neuroner ger en livskraftig modellsystem för att undersöka cellulära och molekylära mekanismer av många viktiga biologiska händelser. Till exempel kan detta förfarande underlätta detaljerade studier av mänskliga påverkar utväxt och tillväxt kon egenskaper, och jämförelse av resultaten till den omfattande kunskapsbas som byggts från årtionden av att studera andra arter, både ryggradsdjur och ryggradslösa djur. Vi finner att det replating förfarandet har gjort det är lättare att optimera villkoren för att generera större tillväxt koner som är väl lämpade för optisk utvärdering av subcellulära struktur och funktion (figur 6). Som jämförelse, tillväxt kottar mer typiskt observeras under den initiala differentieringen av nervceller från hiPSCs tenderar att vara liten och kompakt, och den täta utbud av icke-neuronala celler i sådana kulturer gör det svårt både att justera substrat villkor för att främja tillväxt kon sprider sig och till bild enskilda tillväxtkoner inom den komplexa vävnads miljön. Således, replating nervceller på en ny maträtt ger en "renare skiffer" som att Visa tillväxtkottar under goda avbildnings förhållanden.
Att återplantera är särskilt fördelaktigt när man använder plattformar för cellodling som lämpar sig för HCS eftersom det kraftigt minskar den totala tiden i vilken kulturer odlas i små volymer. De små arbets volymerna av de enskilda brunnar i 96, 384 eller 1536-väl flera brunnar (cirka 100, 50 och 5 mikroliter arbetsvolym, respektive) vanligtvis kräver frekvent (dvs., dagligen) Media förändringar för att motverka avdunstning och näringsämne utarmning. Frekventa medie byten är kostsamma, inte bara i termer av reagenser och arbetskraft, men de kan äventyra livskraften hos kulturer genom att späda konditionerade medier och genom att öka chanserna att celler lossnar från underlaget på grund av mekanisk turbulens. Replating av hipscs kan också underlätta inspelningen av fysiologiska aktivitet med hjälp av multielektrod arrayer21,22, eller levande avbildning av kulturer i analyser av dynamiska neuronala fenotyper23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete är en del av de nationella kooperativa omprogrammerade cell forskargrupper (NCRCRG) för att studera psykisk sjukdom och stöddes av NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det inledande arbetet stöddes också av NIH Grant NS070297. Vi tackar DRS. Carol Marchetto och fred Gage, den Salk Institute, för att tillhandahålla WT 126 linje av neurala stamceller, och DRS. Eugene Yeo och Lawrence Goldstein, UC San Diego för att tillhandahålla CVB WT24 linje av neurala stamceller. Vi tackar Deborah pre i laboratoriet för Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, för användbara diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
