Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

وترد هنا بروتوكولات للتوصيف المناعي وتوطين الببتيد أوريكسين، مستقبلات أوريكسين، ومستقبلات إندوكانابينويد في الأمعاء وأدمغة من السمنة الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO) نماذج حمار وحشي الكبار باستخدام المناعية ومزدوج وسائل الفلور المناعي.

Abstract

الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية حساسة للغاية ومحددة تشارك في الكشف عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة مع الأجسام المضادة المسماة. وهي عملية متعددة الخطوات حيث التحسين من كل خطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على إشارة محددة الأمثل. ومن خلال IHC، يمكن الكشف عن توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية المحددة، مما يكشف عن معلومات عن الحفظ التطوري. وعلاوة على ذلك، يسمح IHC لفهم التعبير وتوزيع التغيرات من المؤشرات الحيوية في الحالات المرضية، مثل السمنة. IHC، أساسا تقنية الفلور المناعي، يمكن استخدامها في حمار وحشي الكبار للكشف عن تنظيم وتوزيع الجزيئات المحفوظة في الحساسية، ولكن بروتوكول IHC القياسية ليست estasblished. أوريكسين وإندوكانابينويد هما نظامان مُحافظان بشدة على التحكم في تناول الطعام وأمراض السمنة. ذكرت هنا هي بروتوكولات تستخدم للحصول على معلومات حول الببتيد أوريكسين (OXA), مستقبلات أوريكسين (OX-2R), ومستقبلات القنب (CB1R) توطين وتوزيع في الأمعاء والدماغ من نماذج أسماك حمار وحشي الكبار الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO). كما تم وصف طرق للمناعة ومزدوج الفلور المناعي، فضلا عن إعداد الكواشف، والتثبيت، وتضمين البارافين، والحماية بالتبريد من أنسجة حمار وحشي والاستعداد لخطوة حجب النشاط الذاتية والخلفية مكافحة البقع. يتم الحصول على مجموعة كاملة من المعلمات من التجارب IHC السابقة، والتي من خلالها أظهرنا كيف يمكن أن يساعد الفلور المناعي في فهم OXs، OX-2R، وتوزيع CB1R، وتوطين، والحفاظ على التعبير في أسماك حمار وحشي للبالغين الانسجه. الصور الناتجة مع كثافة إشارة محددة للغاية أدى إلى تأكيد أن حمار وحشي هي نماذج الحيوانات المناسبة للدراسات المناعية الكيميائية للتوزيع، وتوطين، والحفاظ التطوري للعلامات الحيوية محددة في الظروف الفسيولوجية والمرضية. البروتوكولات المعروضة هنا ينصح لتجارب IHC في حمار وحشي الكبار.

Introduction

المناعية هي (IHC) هو أسلوب كلاسيكي راسخة تستخدم لتحديد مكونات الخلوية أو الأنسجة (المستضدات) عن طريق تفاعل الأجسام المضادة المستضد1،2. ويمكن استخدامه لتحديد توطين وتوزيع الجزيئات الحيوية المستهدفة داخل الأنسجة. IHC يستخدم التفاعلات المناعية والكيميائية للكشف عن المستضدات في أقسام الأنسجة3. وتشمل العلامات الرئيسية المستخدمة في تصور التفاعلات الأجسام المضادة المستضد الأصباغ الفلورسنت (الفلور وناعي) وتفاعلات لون الركيزة الانزيم (المناعية، وكلاهما مترافق مع الأجسام المضادة4. باستخدام المراقبة المجهرية من الممكن تحديد توطين الأنسجة المسماة، والذي يتوافق تقريبا مع توطين مستضد الهدف في الأنسجة.

توجد طريقتان لتفاعلات الفلورسنت أو الكرومية للكشف عن البروتين: طريقة الكشف المباشر، التي يتم فيها تسمية الأجسام المضادة الأولية المحددة مباشرة؛ وطريقة الكشف غير المباشر، التي يتم فيها unconjugated الأجسام المضادة الأولية في حين أن الأجسام المضادة الثانوية يحمل التسمية5،6،7. الأسلوب غير المباشر له بعض المزايا، والتي هي أساسا تضخيم الإشارة. وعلاوة على ذلك، وخلافا لغيرها من التقنيات الجزيئية والخلوية، مع الفلور المناعي، فمن الممكن لتصور التوزيع، والترجمة، وتعبير مشترك من اثنين أو أكثر من البروتينات معبرة بشكل تفاضلي داخل الخلايا والأنسجة7. يعتمد اختيار طريقة الكشف المستخدمة على التفاصيل التجريبية.

حتى الآن، IHC يستخدم على نطاق واسع في البحوث الأساسية كأداة قوية وأساسية لفهم توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية والتنميط العام للبروتينات المختلفة في الأنسجة البيولوجية من الإنسان إلى اللافقاريات8، 9 , 10 , 11. تساعد هذه التقنية على عرض خريطة للتعبير البروتيني في عدد كبير من الأعضاء الحيوانية الطبيعية والمتغيرة وأنواع الأنسجة المختلفة، مما يدل على احتمال انخفاض أو ارتفاع تنظيم التعبير الناجم عن التغيرات الفسيولوجية والمرضية. IHC هو تقنية حساسة للغاية تتطلب الدقة والاختيار الصحيح للأساليب للحصول على النتائج المثلى12. أولا وقبل كل شيء، يمكن أن تؤدي العديد من العوامل المختلفة مثل التثبيت، والتفاعل المتبادل، واسترجاع مستضد، وحساسية الأجسام المضادة إلى إشارات سلبية إيجابية كاذبة وكاذبة13. اختيار الأجسام المضادة هي واحدة من أهم الخطوات في IHC ويعتمد على خصوصية مستضد وتقاربه مع البروتين والأنواع قيد التحقيق7.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتحسين تقنية IHC للكشف عن أعضاء أنظمة أوريكسين /هيبوكرين وإندوكانابينويد في أنسجة حمار وحشي للبالغين. لقد ركزنا بشكل رئيسي على التثبيت، وتضمين الأنسجة باستخدام نهجين مختلفين، وتقسيم وتركيب (التي يمكن أن تؤثر على الدقة والتفاصيل أثناء التحليل المجهري)، وحجب (لمنع إيجابيات كاذبة والحد من الخلفية)14. الخصائص الهامة الأخرى هي خصوصية الأجسام المضادة والانتقائية وإمكانية استنساخ بروتوكولات IHC الفردية. مفتاح توفير خصوصية الأجسام المضادة هو استخدام الضوابط السلبية (بما في ذلك لا الأجسام المضادة الأولية أو الأنسجة التي يعرف أنها لا تعبر عن البروتينات المستهدفة) وكذلك الضوابط الإيجابية (بما في ذلك الأنسجة التي من المعروف أن تعبر عن البروتينات المستهدفة)15 . يتم اختيار الأجسام المضادة لIHC على أساس نوع محدد (احتمال أنها تتفاعل مع مستضد الفائدة) والأجسام المضادة المضادة للكشف عن أنظمة الكشف التي تستخدم4،5،6 7. في حالة مناعي، يتم تحديد لون رد الفعل عن طريق اختيار الكروموسومات المعجل، وعادة ثنائي أمينوبنزيدين (البني)16. من ناحية أخرى، يستخدم immunofluorescence الأجسام المضادة المترافقة مع فلوروفور لتصور التعبير البروتين في أقسام الأنسجة المجمدة ويسمح لتحليل سهلة من البروتينات متعددة فيما يتعلق نظام الكشف الكروموجينيك 5 , 7.

في تقنية مناعية، يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية بالبيوتين، وهو جزيء من الوصلات قادر على تجنيد جزيء مراسل كرومي المنشأ [مجمع فيفين-بيوتين (ABC)]، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة تلطيخ. مع طريقة مراسل ABC، يتفاعل الإنزيم البيروكسيديز مع 3،3'-ثنائيأمينو بنزيدين (DAB)، مما ينتج تلطيخ اللون البني بشكل مكثف حيث يرتبط الإنزيم بالأجسام المضادة الثانوية، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك بمجهر ضوء عادي. ABC تلطيخ، بسبب تقارب عالية من avidin للالبيوتين، وتنتج رد فعل سريع والأمثل، مع عدد قليل من الأجسام المضادة الثانوية تعلق على موقع التفاعل الأجسام المضادة الأولية. تسمح طريقة الكشف الزحيجية هذه بتحليل كثافة الإشارة، حيث توفر بيانات شبه كمية تستند إلى ارتباط مستويات الإشارة البني بمستويات التعبير البروتيني18.

مع تقنيات الفلور المناعي، يمكن الكشف المتزامن عن البروتينات المتعددة نظرًا لقدرة الفلوروكروم المختلفة على انبعاث الضوء على أطوال موجية فريدة من نوعها، ولكن من المهم اختيار الفلوروكروم بعناية لتقليل التداخل الطيفي 5- وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الأجسام المضادة الأولية في مختلف الأنواع المضيفة يقلل من الصعوبات المتعلقة بالتفاعل المتبادل. في هذه الحالة، كل الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع تعترف بنوع واحد فقط من الأجسام المضادة الأولية. المراسلون الفلورسنت هي جزيئات عضوية صغيرة، بما في ذلك المشتقات التجارية، مثل أصباغ أليكسا فلور.

وتستخدم العديد من النماذج الحيوانية لفهم الظروف الفسيولوجية والمرضية معينة. حتى الآن، ثبت أن يتم حفظ العديد من المسارات الأيضية على مدى التطور. ولذلك ، يمكن لدراسات IHC في الكائنات الحية النموذجية مثل حمار وحشي توفير نظرة ثاقبة في نشأة وصيانة الظروف المرضية وغير المرضية17. ومن أهداف هذا التقرير توضيح بروتوكولات IHC التي يمكن تنفيذها على أنسجة أسماك حمار وحشي للبالغين وتستخدم للحصول على صور مفصلة لتوزيع وتوطين OXA وOX-2R وCB1R على المستويين المحيطي والمركزي. كما أُبلغ عن بروتوكولات لتطبيق طريقتين رئيسيتين غير مباشرتين من أساليب IHC في الأنسجة المحيطية والمركزية لسمك حمار وحشي بالغ. ويوصف هو الأسلوب غير المباشر، الذي يسمح لتضخيم إشارة في الحالات التي يتم فيها اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى صبغة الفلورسنت (طريقة الفلور المناعي) أو مراسل الإنزيم (طريقة immunoperoxidase). وتملك كل من أساليب الكشف عن الكروموجينيك والفلورسنت مزايا وعيوب. وذكرت في هذا البروتوكول هو استخدام IHC، أساسا الفلور المناعي، في حمار وحشي الكبار، وهو نموذج الحيوان المستخدمة على نطاق واسع لدراسة النظم التي يتم حفظها التطورية عبر الظروف الفسيولوجية والمرضية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بروتوكول المناعة

ملاحظة: تم الحصول على سمكة الحمار الوحشي من قبل البروفيسور أوميد سفاري (قسم المصايد، كلية الموارد الطبيعية والبيئة، جامعة فردوسي مشهد، مشهد، إيران)10.

  1. تشريح الأنسجة
    1. التضحية بسمك حمار وحشي عن طريق الغمر في الماء المثلج (5 أجزاء الجليد / 1 جزء من الماء، 4 درجة مئوية)؛ تركها حتى وقف جميع الحركة لضمان الموت عن طريق نقص الأكسجة.
    2. إزالة الأمعاء والدماغ بسرعة مع طريقة التشريح التالية:
      1. تجفيف الأسماك على منشفة ورقية ووضعها sagittally على حصيرة تشريح، ومنع الجزء البطني من مقبس العين وجزء لحمي من الذيل.
      2. للأمعاء: قطع الجلد وإزالة بعناية الجلد والعضلات الكامنة من جانب السمك حتى الأعضاء الداخلية مرئية. إزالة الأمعاء من تجويف الجسم تمتد بها.
      3. للدماغ: قم بإزالة الرأس بشفرة حلاقة. إزالة الأنسجة الرخوة من الجانب البطني من الجمجمة مع ملقط. فتح الجمجمة وإزالة العظام من الجانب البطني من الدماغ. إزالة الجلد وعظام الجمجمة من الجانب الظهري من الدماغ. انزع يُفكّر الدماغ
  2. تثبيت الأنسجة
    1. إصلاح الأنسجة تشريح عن طريق الغمر في الطازجة 4٪ شبه رسمية (PFA) في العازلة الفوسفات (PB، ودرجة الحموضة 7.4، 4 درجة مئوية) لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      1. إعداد 0.1 M PB عن طريق حل 1.755 ز من NaH2PO4H2O و 4.575 ز من Na2HPO4 في 450 مل من الماء المقطر (dH2O)، والتكيف مع درجة الألف ة 7.4 مع كمية الداو 1N اللازمة.
      2. إعداد 4٪ PFA حل 4 غرام من PFA في 100 مل من 0.1 M PB (درجة البعد الأدنى 7.4) عن طريق التحريض على لوحة الحرارة. عندما يتم التوصل إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية، إضافة 2-4 قطرات من NaOH 1N للحصول على حل واضح. غادر PFA 4٪ في RT والسيطرة على ح . ضبط رقم الولل إلى 7.4.
        ملاحظة: قد يؤدي تثبيت الأنسجة لأكثر من 4-6 ح إلى التثبيت الزائد، الذي يخفي المستضدات، والحد من الربط بين الأجسام المضادة والجسم. وقت التثبيت يعتمد على حجم الأنسجة.
  3. تضمين الأنسجة
    1. شطف الأنسجة 5X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، عن طريق الغمر في 0.1 M PB (رقم الألف الأوص 7.4).
    2. يجفف الأنسجة عن طريق الغمر اللاحق في الكحول 70% (6 دقائق)، 80% (6 دقائق)، 95% (5 دقائق)، 95% (5 دقائق)، 100% (1 دقيقة)، و100% (1 دقيقة).
    3. توضيح الأنسجة عن طريق الغمر في الكحول 100٪: الزيلين (1:1) لمدة 10 دقيقة، ثم 2X في الزيلين لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    4. تتسلل الأنسجة مع شمع البارافين (56 درجة مئوية) مرتين لمدة ساعة لكل من الغمر المباشر في البارافين.
    5. تضمين الأنسجة في كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة (RT) وتخزينها في RT حتى تقسيم.
  4. قطع الأنسجة
    1. قطع الأنسجة إلى أجزاء الإكليلية أو القوس مع سمك 8 ميكروم مع ميكروتومي، وجمع المقاطع في سلسلة بديلة على الشرائح الزجاجية لاصقة على الماء وتسخينها في 38 درجة مئوية.
    2. جفف الشرائح مع أقسام في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. إزالة البارافينة وترطيب الأنسجة
    1. إزالة الشمع المقاطع عن طريق الغمر في الإكسلين لمدة 5 دقائق تليها الغمر في الإكسلين لمدة 3 دقائق.
    2. ترطيب المقاطع عن طريق الشرائح اللاحقة الغمر في الكحول 100٪ الثاني (1 دقيقة)، 100٪ 1 (1 دقيقة)، 95٪ (1 دقيقة)، 75٪ (1 دقيقة)، 50٪ (1 دقيقة)، ثم ضع الشرائح في dH2O (5 دقيقة).
      ملاحظة: إزالة الشمع تماما المقاطع قبل بدء رد الفعل. إذا كانت المقاطع لا تزال لها آثار البارافين، قم بإجراء غمر إضافي في الزيلين لمدة 5 دقائق أو أكثر.
  6. استرجاع مستضد
    1. علاج المقاطع مع العازلة سترات (0.01 M، ودرجة الحموضة 6.0) عن طريق غمر الشرائح في الحل والتدفئة في فرن الميكروويف لمدة 5 دقائق في أقصى قدر من الطاقة.
    2. دع الأقسام تبرد.
    3. كرر دورة 5 دقائق في الميكروويف في أقصى قدر من السلطة لإكمال استرجاع مستضد.
      1. إعداد العازلة سترات (0.01 M, pH 6.0) عن طريق حل 2.10 غرام من حامض الستريك في 100 مل من dH2O و 5.882 غرام من سيترات الصوديوم في 200 مل من dH2O. مزيج سيترات الصوديوم (0.01 M) مع حامض الستريك (0.01 M) في نسبة 1:4 من حيث الحجم وضبط pH إلى 6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 0.1N.
  7. حجب البيروكسيداز الذاتية
    1. انزع منطقة الأنسجة على الشرائح بالقلم المقاوم للمذيبات.
    2. شطف المقاطع 3 مرات، 5 دقيقة لكل منهما، مع الحل المالح ة (TBS) (0.1 M، ورقم الحموضة 7.3).
      1. إعداد 0.1 M TBS عن طريق حل 12.1 غرام من قاعدة trizma و 9 غرام من كلوريد الصوديوم في 950 مل من dH2O والتكيف مع رقم الألف 7.3 مع حمض الهيدروكلوريك 0.1N.
    3. منع نشاط بيروكسيديز الذاتية عن طريق الشرائح الغمر في حل 0.75٪ H2O2 لمدة 5 دقيقة في RT.
      1. إعداد 0.75٪ H2O2 حل حل 5 مل من 30٪ H2O2 في 195 مل من dH2O.
        ملاحظة: يمكن أن تتفاعل الإنزيمات النزجينة مع الكواشف IHC وتنتج نتائج إيجابية كاذبة. وعلاوة على ذلك، والأنسجة الوعائية للغاية تعبر عن العديد من peroxidase الذاتية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تلطيخ مكثفة غير محددة ومستويات الخلفية. العلاج مع 0.75٪ H2O2 يطفئ البيروكسيديز الذاتية ويقلل بشكل كبير من الخلفية غير محددة.
  8. حظر غير محدد احمد العنز مواقع ng والأنسجة
    1. احتضان أقسام الأنسجة مع TBS/0.4% Triton (TBS-T) حجب العازلة، التي تحتوي على المصل الأساسي (NRS)، لمدة 30 دقيقة في RT لمنع مواقع الربط غير محددة.
      1. إعداد 0.4٪ تريتون عن طريق حل 0.4 مل من تريتون X-100 في 100 مل من TBS.
      2. إعداد الحل العازلة حجب TBS-T عن طريق حل المصل العادي 1٪ في TBS تحتوي على 0.4٪ تريتون X-100 (1 مل من المصل العادي + 8.2 مل من TBS + 0.8 مل من 0.48 تريتون X-100).
        ملاحظة: حدد أنواع المصل الحيواني اعتمادا ً على مضيف الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، عند استخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب الماعز، استخدم مصل الماعز الطبيعي).
  9. حضانة الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية
    1. احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في مربع رطب في RT مع الأجسام المضادة الأولية المخفف في TBS-T. وصمة عار المقاطع مع الأجسام المضادة الأساسية التالية:
      1. جسم الماعز المضاد ضد OX-2R المخفف 1:200، الذي يعترف C-محطة من البروتين.
      2. الأجسام المضادة الماعز ضد OX-A المخفف 1:200 [أوريكسين-A (C-19)]، الذي يعترف C-محطة من البروتين.
        ملاحظة: تأكد من أن الأجسام المضادة الأساسية تتفاعل مع الجزيئات الحيوية من الفائدة. تحديد أي مثال للجزيء الحيوي يتفاعل الجسم المضاد الأساسي باستخدام محاذاة الجينات. على سبيل المثال، تم تعيين مثال OX-A بين aa 50-100 من OX-A الإنسان (O43612) في حين تم تعيين مثال OX-2R بالقرب من آخر 50 aa في المحطة الطرفية C من الإنسان.
  10. حضانة الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية
    1. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M TBS (حف 7.3).
    2. احتضان المقاطع لمدة 1.5 ساعة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية biotinylated والأرانب المضادة للماعز المناعية (H + L) مترافقمع مع البيوتين، ثم تمييع 1:100 في TBS-T.
      ملاحظة: اختبار والعثور على التخفيفات المختلفة من كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية للعثور على التخفيف الأمثل الذي يسمح الحد من الخلفية.
  11. تفاعل البيروكسيديز
    1. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M TBS (حف 7.3).
    2. احتضان الأقسام مع مجمع avidin-البيوتين (ABC) لمدة 1 ساعة.
      1. إعداد حل ABC مضيفا اثنين من قطرات من المكون A تليها اثنين من قطرات من المكون B في 5 مل من TBS.
    3. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M TBS (حف 7.3).
    4. علاج المقاطع مع الركيزة الكروموسومات 3،3'-ديامينوبنزيدين-4 (DAB).
      1. إعداد حل DAB إضافة قطرة واحدة (حوالي 30 ميكرولتر) من تركيز الكروموسومات DAB إلى 1 مل من الديونت DAB، وتخلط جيدا قبل الاستخدام.
        ملاحظة: إعداد حل ABC على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام والحفاظ على المجمع في 4 درجة مئوية حتى استخدامها للسماح لavidin مستقر / البيوتين ملزم. إعداد حل العمل DAB الطازجة، وتطبيق على أقسام الأنسجة، وتطوير حتى اللون هو المناسب. عندما يقوم رد الفعل الزني بتحويل مواقع البؤرة إلى لون بني وشدة الإشارة مناسبة للتصوير، انتقل إلى الخطوة التالية. قد يختلف توقيت تطوير DAB من بضع ثوان إلى 10 دقائق. لOX-A وOX-2R 1، 2 دقيقة كافية. التعامل مع DAB بعناية، كما أنها مسرطنة.
  12. جفاف الأنسجة وتركيبها
    1. شطف جميع المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M TBS (درجة البعد الأدنى 7.3) لوقف رد فعل DAB.
    2. يجفف الأقسام بالشرائح اللاحقة الغمر في الكحول 50٪ (2 دقيقة)، 75٪ (2 دقيقة)، 95٪ (2 دقيقة)، 100٪ I (2 دقيقة)، 100٪ II (2 دقيقة).
    3. توضيح الشرائح عن طريق الغمر 2X في الزيلين 10 دقيقة لكل منهما.
    4. جبل المقاطع مع DPX (ثنائي بوتيل الفثالات الزيلين) جبل للالأنسجة، مضيفا اثنين من قطرات من تصاعد وسائل الإعلام إلى الشرائح وتتصدر ببطء مع coverslips.
      ملاحظة: منذ الغمر الأنسجة في زيادة تركيزات الكحول أثناء الجفاف يؤدي إلى تغلغل الكحول في الأنسجة واستبدال الماء مع الكحول، وتحديد وقت الجفاف الدقيق وعدم الإفراط في تجفيف الأنسجة. قم بإغمر الإكسيلين بعد الجفاف لتوضيح الأنسجة وإزالة أي زيادة أو بقايا الكحول.
  13. عناصر التحكم
    1. كرر المقاطع 1.1-1.12، وحذف الأجسام المضادة الأولية و/أو استبدال الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة الثانوية IgG بواسطة TBS (الضوابط السلبية).
    2. كرر المقاطع 1.1-1.12 قبل امتصاص كل الأجسام المضادة الأولية مع فائض من الببتيد النسبي (100 ملغ من الببتيد / 1 مل من المصل المخفف).
    3. كرر المقاطع 1.1-1.12 باستخدام أنسجة مختلفة كتحكم إيجابي (مثل أنسجة الفأر).
      ملاحظة: تحضير كافة المخازن المؤقتة الطازجة، قبل وقت قصير من بدء التشغيل. قم بإزالة السوائل الزائدة بعناية في كل خطوة باستخدام ماصة أو ورقة تصفية حول الأقسام، مع الحفاظ على القطاعات رطبة دائمًا.
  14. الحصول على الصور وتحليلها
    1. الحصول على الصور الرقمية تحت إضاءة الضوء المستمر وفي نفس التكبير باستخدام المجهر مجهزة بكاميرا رقمية.
    2. إجراء تحليل شبه كمي لكثافة تلطيخ باستخدام برامج التصوير (انظر جدولالمواد).
      1. افتح الصور الملتقطة بتنسيق ملف .lif أو .tiff، لتقييم مؤشرات إيجابية OX-A أو OX2-R.
      2. حدد الزر تحت قياس وانقر على دليل Counting. عد عدد ملفات تعريف الخلايا الملون مباشرة من الشاشة عن طريق وضع علامة على خلايا إيجابية بالنقر على الماوس.
      3. حدد منطقة ذات اهتمام (3 x 103 ميكرومتر2)لتحديد كثافة الإشارات المناعية (الكثافة البصرية، OD).
      4. تحديد بكسل مع أعلى كثافة (عالية إيجابية) وأقل كثافة (سلبية) داخل الصورة التي تم تحليلها لتعيين الصفر كقيمة للخلفية (أي جزء من الأنسجة خالية من الخلايا الملطخة).
      5. تقييم OD من خلال العمل على مقياس اللوغاريتمي للامتصاص. في تحليل الصور الرقمية، تتراوح كثافة بكسل DAB من أغمق (قيمة 0) إلى أخف (255 قيمة) الظل.
      6. تحديد OD عن طريق رسم الرسم البياني التالي: سجل10(255/I)، حيث "أنا" هو قيمة كثافة بكسل التي قدمها البرنامج وتحديدها عن طريق طرح الخلفية.
        ملاحظة: يمكن تحليل رد فعل المناعة الدائمة ومستقرة تحت المجهر مشرق الميدان في أي وقت. قم بإجراء عد الخلايا المسماة في القسم البديل لتجنب الحساب المزدوج لنفس الخلية من المقاطع المجاورة.

2. بروتوكول الفلور المناعي

  1. تشريح الأنسجة
    1. التضحية وتشريح الحيوانات كما هو موضح في القسم 1.1.
  2. تثبيت الأنسجة
    1. إصلاح الأمعاء والدماغ عن طريق الغمر لمدة 3 ح في 4٪ PFA في 4 درجة مئوية.
      1. إعداد PB و 4٪ PFA كما هو الحال في القسم 1.2.1.
        ملاحظة: وقت التثبيت يعتمد على حجم الأنسجة. قد يؤدي تثبيت الأنسجة لأكثر من 4-6 ح إلى التثبيت الزائد، الذي يخفي المستضدات ويحد من الربط بين الأجسام المضادة.
  3. تضمين الأنسجة
    1. شطف الأنسجة 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M PB (حماة 7.4).
    2. للحماية من البرد، نقل الأنسجة إلى 20% السكروز في PB (0.1 M، ودرجة الألف 7.4) والحفاظ على بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ثم نقل الأنسجة إلى 30٪ السكروز في 0.1 M PB (درجة الألف 7.4) والحفاظ على ليلة إضافية في 4 درجة مئوية.
    3. تضمين الأنسجة في كتلة من درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) مركب. للقيام بذلك، وإعداد ديوار صغيرة من النيتروجين السائل، واتخاذ رقائق الألومنيوم، وقطع إلى نصفين لخلق مقلاة. المقلاة التي تحتوي على الأنسجة مليئة مجمع OCT يجب أن يكون انخفض في النيتروجين السائل حتى يتم تبريد مجمع OCT. يمكن تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى المقطعية.
  4. قطع الأنسجة
    1. نقل كتل الأنسجة المجمدة إلى كريوستات في -20 درجة مئوية وقطع في أقسام الإكليلية أو القوس من 10 ميكروم.
    2. جمع الأنسجة في أقسام تسلسلية بديلة على الشرائح الزجاج لاصقة مناسبة للكيمياء المناعية وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تخزين الشرائح بين -20 درجة مئوية و 4 درجة مئوية في مربع الشريحة الداكنة أو كتاب الشرائح.
  5. حجب مواقع الربط غير المحددة ونفاذ الأنسجة
    1. قم بإزالة منطقة الأنسجة على الشريحة بالقلم المقاوم للمذيب.
    2. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M PB (حماة 7.4).
    3. احتضان المقاطع مع 1٪ المصل الحمار الطبيعي الذائبة في العازلة بي بي -تريتون X-100 0.3٪ (PB-T) لمدة 30 دقيقة في RT لpermeabilize غشاء الخلية ومنع مواقع الربط غير محددة.
      1. إعداد تريتون X-100 0.3٪ حل 0.3 مل من تريتون X-100 في 100 مل من 0.1 M PB (pH 7.4).
      2. إعداد الحل حجب حل 1٪ المصل الحمار العادي في PB تحتوي على 0.3٪ تريتونإكس-100.
        ملاحظة: الأنواع الحيوانية من المصل المستخدمة في المخازن المؤقتة وحجب تعتمد على المضيف من الأجسام المضادة الثانوية.
  6. حضانة مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية
    1. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M PB (حماة 7.4).
      1. احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في مربع رطب في RT مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية المخفف في PB-T. يمكن استخدام الخليط التالي من الأجسام المضادة الأولية: الأجسام المضادة الماعز ضد OX-2R المخفف 1:100/rabbit الأجسام المضادة ضد CB1R المخفف 1:100، أو الأجسام المضادة الماعز ضد OX-A المخفف 1:100/أرنب ضد CB1 المخفف 1:100.
  7. حضانة مع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية
    1. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M PB (حماة 7.4).
    2. احتضان أقسام لمدة 2 ح في RT مع 1) مزيج من الحمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 488-مترافق الأجسام المضادة الثانوية والحمار المضادة للماعز اليكسا فلور 594-مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1:100 في PB-T; أو 2) مزيج من الحمار المضادة للماعز اليكسا فلور 488-مترافق الأجسام المضادة الثانوية والحمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 594-مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1:100 في PB-T.
      ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الثانوية المتقدمة في نفس المضيف الحيوان. يجب أن ينتمي المصل الطبيعي إلى نفس النوع من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، استخدام الأجسام المضادة الثانوية المتقدمة في الحمار ومصل حمار عادي). تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع حاجز حجب يحتوي على المنظفات لزيادة الخلايا permeabilization وتقليل الخلفية.
  8. تركيب الأنسجة
    1. شطف المقاطع 3X لمدة 5 دقيقة لكل منهما، مع 0.1 M PB (حماة 7.4).
    2. مكافحة البقع مع الصبغ النووي DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) أعدت حل 1.5 ميكرولتر من DAPI (1 ملغ / مل) في 3 مل من PB.
    3. شرائح التغطية مع تصاعد المتوسطة (انظر جدولالمواد). هذه المتوسطة المائي تصاعد استقرار عينة الأنسجة والبقع للاستخدام على المدى الطويل. يمكن تخزين عينات الفلورسنت في الظلام في 4 درجة مئوية. لإطالة عمر الفلوروفور، استخدم وسيطة تصاعد مضادة للتغذية.
      ملاحظة: اختر وسيلة تركيب جيدة. واحدة من أهم المعلمات من عوامل تصاعد هو مؤشر الانكسار (ND)، والتي ينبغي أن تكون حوالي 1.5، ومؤشر الانكسار من الزجاج. يمكن استخدام المتوسط المتصاعد المستخدم هنا خاصة مع عينة أعدت لتحديد اتمني ودهون (أي، عينة التي يجب أن لا تكون جافة مع سلسلة تصاعدي من الكحول).
  9. عناصر التحكم
    1. كرر المقاطع 2.1-2.8، وحذف الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية، أو استبدال في خطوة محددة antisera الأولية أو الثانوية مع PB (التحكم السلبي).
    2. كرر المقاطع 2.1-2.8، قبل امتصاص كل الأجسام المضادة الأولية مع فائض من الببتيد النسبي (100 ملغ من الببتيد / 1 مل من المصل المخفف).
    3. كرر المقاطع 2.1-2.8 على شرائح من الدماغ الماوس (التحكم الإيجابي).
      ملاحظة: تحضير كافة المخازن المؤقتة الطازجة، قبل وقت قصير من بدء التشغيل. قم بإزالة فائض السوائل بعناية في كل خطوة باستخدام ماصة أو ورقة تصفية حول الأقسام، مع الحفاظ دائمًا على رطوبة المقطع.
  10. الحصول على صورة
    1. استخدام المجهر البؤري مجهزة مرحلة بمحركات س-ي-ض، والكاميرا الرقمية، واكتساب وتحليل البرمجيات مثل NIS-عناصر C لمراقبة وتحليل المقاطع الملطخة بالمناعة. الحصول على الصور الرقمية باستخدام أهداف 5-20-40x.
    2. التقاط صور كل قسم عند التكبير المنخفض (10x أو 20x objective) في كل قناة من القنوات المتاحة لتكوين مونتاج تكبير منخفض، مما يوفر لمحة عامة عن المنطقة بأكملها لتسهيل توطين وتوثيق OX-2R/CB1R التشريحية التعبير المشترك. تطبيع الصور الفلورسنت إلى أقصى قدر من التباين وتراكب قبل التحليل.
    3. جمع تسلسل Z-مكدسات من الصور في جميع أنحاء منطقة الاهتمام. الحصول على الصور من خلال ست طائرات محورية (Z-step) مع خطوات بؤرية من 1-1.8 ميكرومتر لتغطية حجم الأنسجة التي يتم تصور هاكتعبير OX-2R/CB1R كعلامة صفراء. للقيام بهذه المجموعة لكل قناة (الأحمر والأخضر والأزرق) بشكل منفصل، باستخدام مجهر Z-بمحركات.
    4. استخدم برنامج إزالة الالتواء للتصوير لتصغير الصور من خلال تطبيق عشرة تكرارات وطي صور الطائرات Z التسلسلية في صورة عرض قصوى واحدة.
    5. ضبط الميكروغرافات للضوء والتباين باستخدام أدوبي فوتوشوب 6.01 (أدوبي سيستمز، سان خوسيه، كاليفورنيا).
      ملاحظة: تنفيذ خطوة إزالة الالتواء أثناء الملاحظة لتقليل الخلفية. الحد من التعرض للشريحة إلى الضوء لمنع photobleaching.
  11. تحليل الصورة
    1. إجراء تحليل كمي للتعبير المشترك OX-2R/CB1R على أقسام سميكة 10 ميكرومتر بالتناوب (ن = 5 الحيوانات لكل مجموعة) من خلال تغطية جميع المنطقة التي تهم كل الحيوانات.
    2. قياس التعبير المشترك OX-2R/CB1R كرقم من الأوبونتا الإيجابية الصفراء مع نظام شبه آلي لتحليل الصور. يمكن أن توفر برامج Imagins مستوى أعلى من التفاصيل، مع بيانات كمية فيما يتعلق بمناطق التداخل بين تحقيقات الفلورسنت المختلفة.
    3. تحديد قيمة الأداة باستخدام أدوات تحديد الحد الأدنى لكثافة الإشارة في القناتين. افتح ملف الصور .liff أو .tiff أو .jpg وحدد صورة- عتبة. حدد Auto Setting أو Method Manual ونظّم العتبة حتى يتم تحديد كل البقعة. تحليل توزيع كثافة بكسل في منطقة من الصورة التي لا تحتوي على أي الكائنات التي تحمل علامة مناعية للحصول على عتبة الخلفية. تحديد هذه الخلفية بشكل فردي لكل صورة. ثم يقوم البرنامج بإزالة عتبة الخلفية عن طريق تعيين خط الأساس لكثافة البكسل إلى قيمة الخلفية.
    4. حدد تحليل قياس وحدد المعلمات التي سيتم قياسها (الحد الأدنى من الحد الأدنى، الحد الأقصى والقيم المتوسطة؛ عدد/كثافة المناعي ة(
    5. عد على puncta الأصفر على طول حجم الأنسجة في 4 Z-المكدسات لكل قسم، وذلك باستخدام مداخن مباشرة فوق أو أدناه إلى أفضل مستوى التركيز. استبعاد المناطق الخارجة عن بؤرة التركيز من التحليل.
      ملاحظة: إجراء العد من الخلايا المسماة على مقطع بديل لتجنب العد المزدوج من نفس الخلايا من المقاطع المجاورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر البيانات التمثيلية لتلطيخ المناعة في الشكل 1 والشكل 2. تحليل الهيزوميكائي المناعي لتوزيع OX-A وOX-2R في القناة الهضمية للسمك الوحشي الكبار أظهرت مواقع توطين مختلفة من OX-A وOX-2R وزيادات في التعبير في الخلايا المعوية من دي ويدي زيبرافيش. لوحظت تلطيخ بني مكثف لOX-A في خلايا الأمعاء الوسطى والأمامية (الشكل1A، A1). أعطى التعبير المناعي لOX-A إشارات واضحة في الكومبرتمنتس المختلفة للأمعاء، وتناقص من الأمامي نحو الأمعاء الوسطى (الشكل1B، B1). وقد استخدمت السيطرة السلبية كمرجع للخلفية ولتأكيد خصوصية إشارة OX-A (الشكل1E). وأدى التعرض لفترات طويلة إلى الكروموسومات DAB في زيادة كثافة الخلفية (الشكل1D). ولوحظت نتائج مماثلة للمناعة OX-2R في الأمعاء من DIO والسيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي (الشكل2). ورافق زيادة OX-A إشارة في دي وزيبرافيش الكبار من قبل التعبير المفرط من OX-2R في غيرها من الكومات المعوية (الشكل2B، B1).

باستخدام الفلور المناعي، تم تأكيد البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل مناعي بيروسيداز، والكامنة وراء زيادة تعبير OX-A وOX-2R في القناة الهضمية من البالغين DIO حمار وحشي فيما يتعلق بالسيطرة (الشكل3). وعلاوة على ذلك، باستخدام الفلور المناعي المزدوج، كان من الممكن الحصول على معلومات حول التعبير عن مستقبلات إندوكانابينويد CB1R وتوطينها المشترك مع OX-A أو OX-2R في الأمعاء والدماغ من النظام الغذائي السيطرة وDIO حمار وحشي الكبار. ميزة الفلور المناعي هو أنه يعطي إشارة أكثر تفصيلا مع معلومات أقل توفيرا حول مورفولوجيا الأنسجة، بالمقارنة مع تقنية مناعية. باستخدام طريقة الفلور المناعي، قمنا في السابق بتحديد التفاعلات التشريحية بين OX-2R و CB1R في كل من القناة الهضمية والدماغ10.

وأظهر التحليل الدقيق للصور المناعية زيادة OX-2R/CB1R التوطين المشترك في القناة الهضمية من دي أو ب الكبار حمار وحشي مقارنة مع السيطرة على الحمية حمار وحشي (الشكل 3B, C). ولوحظ وضع مماثل في مناطق الدماغ المختلفة، مثل التيلال التورسي، تحت المهاد (الجانبية، البطينية، والمناطق التورسية)، وتكتوم البصري، وتراليس، ونواةمنتشرة من الفص السفلي (الشكل 4). السلبية (الشكل 5A ، B) والإيجابية (الماوس الدماغ) ( الشكل5C) واستخدمت الضوابط كمراجع للخلفية ولتأكيد خصوصية CB1R وOX-2R إشارات.

وعلاوة على ذلك، عن طريق الاحتواء المناعي المزدوج مع OX-A/CB1R، لوحظ في الخلايا العصبية أوريكسينرجيك من تحت المهاد أن هناك زيادة في التوطين المشترك يرافقه زيادة في إشارة الفلورسنت OX-A (الشكل6). وتبين هذه النتائج كيف يمكن أن يساعد الفلور المناعي المزدوج في تحديد التعبير البروتيني المحفوظة من الناحية الفسيولوجية، والتعريب المشترك للبروتينات المستهدفة، وتوزيعها و/أو تغيرات التعبير في مختلف الحالات المرضية.

Figure 1
الشكل 1: الأوريكسين المناعية في أمعاء DIO مقابل. السيطرة على النظام الغذائي الكبار حمار وحشي. (أ) OX-A المناعية في خلايا الأمعاء الوسطى من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي. (ألف1) OX-A المناعية في خلايا الأمعاء الوسطى من دي وdio حمار وحشي. (ب) OX-A المناعية في خلايا الأمعاء الأمامية من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي. (ب1) OX-A المناعية في خلايا الأمعاء الأمامية من دي وأي هبي حمار وحشي. (ألف1وباء1) زيادة الخلايا الإيجابية OX-A في أنسجة مختلفة من الأمعاء الوسطى والأمامية من دي إي دي وزيبرافيش. (C) OX-A المناعية في خلايا الأمعاء الأمامية من دي وأي هبي حمار وحشي. (د) تفاعل مناعي لOX-A بعد التعرض لفترات طويلة إلى DAB. (E) التحكم السلبي. مقياس شريط: 50 ميكروم(A، 1، B، B1)؛ 100 ميكرومتر (جيم، دال، هاء). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: Orexin 2 مستقبلات immunolocalization في الأمعاء من DIO مقابل. السيطرة على النظام الغذائي الكبار حمار وحشي. (أ) OX-2R المناعية في خلايا الأمعاء الوسطى من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي. (ألف1) OX-2R المناعية في خلايا الأمعاء الوسطى من دي وdio حمار وحشي. (ب) OX-2R المناعية في خلايا الأمعاء الأمامية من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي. (ب1) OX-2R المناعية في خلايا الأمعاء الأمامية من دي وdio حمار وحشي. (ألف1وباء1) زيادة الخلايا الإيجابية OX-2R في أنسجة مختلفة من الأمعاء الوسطى والأمامية من دي وdio حمار وحشي. شريط مقياس: 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توزيع OX-A (الأخضر)/CB1R (الأحمر) وOX-2R (الأحمر)/CB1R (الأخضر) والتعريب المشترك مع OX-2R/CB1R (الأصفر) في أمعاء DIO مقابل. (أ) OX-A/CB1R التعبير المشترك في الأمعاء من نظام غذائي السيطرة حمار وحشي الكبار. (ب) OX-2R/CB1R التعبير المشترك داخل الأمعاء من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي. (C) OX-2R/CB1R التعبير المشترك داخل الأمعاء من دي وdio الكبار حمار وحشي. زيادة OX-2R/CB1R التوطين المشترك (النقاط الصفراء) في الأمعاء من DIO حمار وحشي. شريط مقياس: 25 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توزيع OX-2R (الأحمر) وCB1R (الأخضر) وتوطينها المشترك مع OX-2R/CB1R (الأصفر) في أقسام الدماغ الإكليلية من DIO مقابل السيطرة على النظام الغذائي الكبار حمار وحشي. (أ) OX-2R/CB1R التعبير المشترك في telencephalon من حمار وحشي النظام الغذائي السيطرة. (ألف1) OX-2R/CB1R شارك في التعبير في تيلينسيفالون من دي دي وزيبرافيش. (ب) OX-2R/CB1R التعبير المشترك داخل الجانب، البطني ومنطقة دورسال تحت المهاد، وتيكتوم البصرية، وtorus lateralis، نواة منتشر من الفص السفلي من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي (B1) OX-2R/CB1R التعبير المشترك داخل الجانب، البطينية، و مناطق الظهرية من تحت المهاد، tectum البصرية، torus lateralis، ونواة منتشر من الفص السفلي من دي وزيبرافيش. (ج) تكبير أعلى من tectum البصرية تظهر التعبير المشترك من OX-2R/CB1R (الأصفر) في حمار وحشي النظام الغذائي السيطرة. (ج1) تكبير أعلى من tectum البصرية تظهر التعبير المشترك من OX-2R/CB1R (الأصفر) في حمار وحشي DIO. (D) خاص من tectum البصرية تظهر توزيع وتعبير مشترك من OX-2R/CB1R (الأصفر) في زيبرافيش DIO. تم استخدام DAPI (الأزرق) لمواجهة نوى البقعة. CP: نواة الثلامي الخلفي المركزي; DD: دورى; العاصمة: المركزية؛ الـ(بـرـيـلـيـر DM: وسيطة; [دب]: جزء خلفيّة من ال [تلنسفلون] [تورسل]; هد: منطقة دورسال تحت المهاد periventricular; Hv: منطقة البطين من تحت المهاد بيريفنتراكل; LH: الجزء الجانبي من تحت المهاد; PGL: الجانبية وPGm: نوى preglomerular المتوسطة; [بغز]: منطقة [بريفنتركل] رماديّة من ال [تكتوم] بصريّة; TeO: tectum البصرية; [تل]: [تورّوس] طوليّ; [فد]: جزء [دورسل] من ال [تلنسفلون] بطنيّة. مقياس شريط: 50 μm (A،1، C، C1)؛ 250 ميكرومتر (Bو B 1) ؛ 25 ميكرومتر (دال). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: OX-2R و CB1R التعبير البروتين وخصوصية في الدماغ الكبار من حمار وحشي وفرس النهر الماوس. (أ) السيطرة السلبية على OX-2R قبل الامتصاص مع الببتيد النسبي. (B) السيطرة السلبية على CB1R قبل الامتصاص مع الببتيد النسبي. (ج) السيطرة الإيجابية على OX-2R/CB1R في الحصين من الفأر. [بغز]: منطقة [بريفنتركل] رماديّة من ال [تكتوم] بصريّة; TeO: تيكتوم البصرية. مقياس شريط: 100 μm (A, B); 250 ميكرومتر (ج). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: توزيع OX-A (الأخضر) وCB1R (الأحمر) وترجمتهما المشتركة مع OX-A/CB1R (الأصفر) في الأقسام الإكليلية تحت المهاد من DIO مقابل التحكم في النظام الغذائي للكبار حمار وحشي. (أ) OX-A/CB1R التعبير المشترك في تحت المهاد من السيطرة على حمار وحشي النظام الغذائي (A1)ارتفاع التكبير تظهر OX-A/CB1R التعبير المشترك داخل تحت المهاد الجانبية. تفاصيل التعبير المشترك OX-A/CB1R الذي يظهر توطيناً مفترضاً متجاوراً لـ OX-A/CB1R أو التوطين المشترك والتداخل بين OX-A/CB1R في نفس الخلايا. (ب) OX-A/CB1R التعبير المشترك في تحت المهاد من دي دي أو زيبرافيش (B1)ارتفاع التكبير تبين زيادة OX-A/CB1R التعبير المشترك داخل تحت المهاد الجانبية. تفاصيل التعبير المشترك OX-A/CB1R الذي يظهر توطيناً مفترضاً متجاوراً لـ OX-A/CB1R أو التوطين المشترك والتداخل بين OX-A/CB1R في نفس الخلايا. [ل]: جزء جانبيّة من ال [هبتملمّوس]. مقياس شريط: 50 μm (A, B); 25 ميكرومتر(A 1، B1). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد عينة

يعد إعداد العينات الخطوة الحاسمة الأولى في IHC. بروتوكول موثوق به يسمح للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا، وبنية الأنسجة، ومكافحة الجينات. تتطلب هذه الخطوة جمع الأنسجة الصحيحة، والتثبيت، وتقسيم22،23. الغرض من التثبيت هو الحفاظ على الأنسجة والحد من عمل أنزيمات الأنسجة أو الكائنات الحية الدقيقة. على وجه الخصوص، تحافظ خطوة التثبيت على المكونات الخلوية والجزيئات الحيوية، وتمنع التحلل التلقائي وتحول مكونات الخلايا (مثل المستضدات والإنزيمات)، وتستقر المواد الخلوية ضد الآثار المنذرة للإجراءات التالية، و يسهل الصبغ المناعي4,7,24.

قبل تقسيم، يتم إعداد الأنسجة والحفاظ عليها من خلال البارافين التضمين (طريقة المناعية) أو cryopreserved (تجميد في cryomedia، في طرق الفلور المناعي متعددة). ويرتبط أسلوب الحفظ مع نوع التثبيت7. بعد التثبيت والحفظ، يتم تقطيع الأنسجة بواسطة ميكروتومي إذا كانت مدمجة في البارافين، أو عن طريق كريوستات إذا كانت مدمجة في كريوميديا. وعادة ما يتم تقطيع الأنسجة في نطاق سمك من 8-10 ميكروم وشنت على الشرائح. لتلوين المناعة، قد تتطلب العينة خطوات إضافية لكشف الأسطح لتغليف الأجسام المضادة، بما في ذلك إزالة البارافينية والمستضد المسترد25،26. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن التثبيت المفرط يمكن أن يسبب تجسيد االخانة، في حين أن التثبيت السفلي يمكن أن يسبب إشارة إيجابية قليلة أو معدومة مع تلطيخ الحافة الثقيلة.

حجب وخفض الخلفية

في طريقة مناعية بيروسيداز ، من المرجح أن يكون التقارب العالي من avidin للبيوتين مسؤولًا عن الإنتاج السريع لتلطيخ الخلفية. وعلاوة على ذلك، منذ رد فعل avidin-البيوتين لا رجعة فيه، لا يمكن إزالة الخلفية18،27. خلال IHC، يمكن أيضا أن تنتج خلفية عالية عن طريق الربط غير محددة إلى البيوتينات الأنسجة الذاتية. التفاعلات المسعورة والأيونية (مثل تلك التي تنتجها الكولاجين والأنسجة الضامة الأخرى مثل ظهارة وadipocytes)، فضلا عن نشاط الإنزيم الذاتية، هي الأسباب الرئيسية لتلطيخ الخلفية. يجب التقليل من البيوتين أو الإنزيمات الذاتية والربط ضد الهدر قبل تلطيخ الأجسام المضادة، والتي يمكن تحقيقها عن طريق إضافة المنظفات، مثل تريتون X-100، في المخازن العازلة الحجب28.

استخدام 0.3٪ -0.4٪ تريتون X-100 في المخازن المؤقتة حجب يسمح أيضا لpermeabilization كامل من الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الأجسام المضادة هي محددة بشكل تفضيلي لمثال واحد، والربط الجزئي إلى مواقع على البروتينات غير محددة من الممكن، مما يؤدي إلى تلطيخ خلفية عالية29. يمكن للربط غير محددة قناع إشارة مستضد الهدف30. للحد من تلطيخ الخلفية غير المحددة، يجب أن يتم احتضان العينات مع المخزن المؤقت الذي يمنع مواقع رد الفعل غير محددة. وتشمل المخازن العازلة الحجب العادي ة المصل العادي أو الدمفية المصل الزلال30. يجب أن تكون أنواع المصل الحجب هي نفس نوع مضيف الأجسام المضادة الثانوية. من المستحسن تحديد أفضل وقت الحضانة. تركيز المصل العادي في حاجز حجب هو آخر قرار مهم31. وعلاوة على ذلك، للقضاء على تلطيخ الخلفية، فمن المهم استخدام التخفيف الأمثل للأجسام المضادة الأولية والثانوية. وهكذا، يجب اختيار وقت الحضانة بعناية، بالإضافة إلى درجة الحرارة (أي زيادة الوقت إذا كان أداء في 4 درجة مئوية، وتقليل الوقت إذا كان في RT) ونظام الكشف.

اختيار الأجسام المضادة

اختيار الأجسام المضادة لتلطيخ IHC مهم ويمكن أن تؤثر على النتيجة التجريبية32. للتأكد من أن الأجسام المضادة سوف تستجيب بشكل مناسب، يجب النظر في مثال معترف بها من قبل ذلك. فهم البروتين المستهدف ووظيفته، والأنسجة وتوطين دون الخلايا، وما إذا كان يخضع لتعديلات ما بعد الترجمة يمكن أن تساعد على تحديد اختيار الأجسام المضادة. وثمة خطوة هامة أخرى هي اختبار تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية/الثانوية للحفاظ على الخلفية والتحديد عند مستوى أدنى متوافق مع إشارة محددة. وعلاوة على ذلك، من المهم التحقق من تفاعل الأنواع لتأكيد التوافق الأساسي والثانوي للأجسام المضادة وقدرة الأجسام المضادة الأولية على التعرف على هدف المستضد في التشكل الأصلي. خطوة هامة أخرى لاختيار الأجسام المضادة الأولية هي محاذاة الجينات. وهذا يضمن أن يتفاعل الجسم المضاد الأساسي مع الجزيئات الحيوية ذات الأهمية ويوفر معلومات حول أي مثال معترف به من قبل الأجسام المضادة في نموذج الحيوان المحدد. كما توفر محاذاة الجينات إمكانية اختيار الأجسام المضادة القادرة على التعرف على الأسطح التي يتم حفظها التطورية.

عناصر التحكم

لتوضيح خصوصية الأجسام المضادة، جانب مهم هو أداء الضوابط، والذي يسمح بالكشف عن تلطيخ معين. وتشمل الضوابط: '1' نسيج معروف بالتعبير عن المستضد كتحكم إيجابي؛ '1' نسيج معروف بتعبير عن المستضد باعتباره عنصر تحكم إيجابي؛ '1' نسيج معروف بتعبير عن المستضد باعتباره عنصر تحكم إيجابي؛ '1' نسيج معروف بتعبير عن المستضد باعتباره 2) نسيج معروف بعدم التعبير عن المستضد كتحكم سلبي؛ '3' إغفال الأجسام المضادة الأولية أو امتصاص الأجسام المضادة الأولية مع ببتيد معين لتأكيد أن الأجسام المضادة الثانوية لا تتقاطع مع مكونات الأنسجة الأخرى14،33.

في تقنيات IHC، يمكن أن تسبب عدة خطوات مشاكل قبل تحقيق تلطيخ النهائي. يمكن أن يكون سبب تلطيخ خلفية قوية ومستضد الهدف غير محددة من قبل البيوتين الذاتية أو الأجسام المضادة الأساسية / الثانوية عبر النشاط وضعف نشاط الإنزيم أو قوة الأجسام المضادة الأولية، على التوالي. يمكن منع تلطيخ الخلفية والربط غير المحدد عن طريق حجب الإنزيمات الذاتية قبل الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية. استخدام المصل العادي هو أفضل طريقة لمنع التفاعلات غير المحددة30. يعتمد اختيار المخزن المؤقت للحظر على أسلوب الكشف المستخدم. وعلاوة على ذلك، يمكن للأنسجة المعروفة بنقص التعبير عن مستضد الهدف كسيطرة سلبية بمثابة مرجع لتحديد كمية من تلطيخ الخلفية34. إن ترسب إشارة اللونية أو الفلورية في السيطرة السلبية يؤكد وجود تلطيخ غير محدد. وعلاوة على ذلك، يؤدي عدم كفاية حظر الوقت حجب إلى خلفية عالية، في حين أن الحجب المفرط يؤدي إلى إشارة منخفضة35.

في تلطيخ المناعة، وجود بيروكسيديز الذاتية في الأنسجة هو سبب آخر لترسب الخلفية البني. العلاج مع H2O2 قبل الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية كتل بيروكسيديز الذاتية36,37. على العكس من ذلك، في الفلور المناعي، والتثبيت يلعب دورا رئيسيا في توليد الفلور التلقائي. لتجنب الفلور التلقائي، يجب اختيار أفضل طريقة التثبيت، ووقت التثبيت، وإعداد الأنسجة بعناية. خطوة حاسمة أخرى من IHC هو التحقق من صحة الأجسام المضادة الأولية. يعتبر الجسم المضاد صالحاً إذا كان ينتج نمطتل ثابت ومحدد في نسيج معين أو مكونات خلية/دون خلوية معينة وإذا كان الامتصاص المسبق للأجسام المضادة الأولية بببتيد معين لا ينتج تلطيخ38. في الفلور المناعي، يظهر الربط غير المحدد كثافة فلورسنت مماثلة تحت ثلاثة أجهزة كشف فلورونية ملونة، في حين أن الإشارة متغيرة حيث يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلورسنت المختلفة. هذه الجوانب من إعداد الأنسجة IHC وتلطيخ الأجسام المضادة يجب معالجتها للتغلب على مشاكل تلطيخ.

IHC، على الرغم من تقنية بسيطة نسبيا، ويعرض بعض القيود وتعتمد على العديد من العوامل39. واحدة من النقاط الحاسمة هي تثبيت الشكلين، والتي يمكن أن تغير التعبير عن البروتينات المعدلة بعد الترجمة. من ناحية أخرى، يمكن تخزين الأنسجة الخالية من البارافين الثابتة في شكلين على المدى الطويل في درجة حرارة الغرفة، في حين أن الأنسجة المجمدة لا يمكن تخزينها إلا لمدة تصل إلى سنة واحدة عند -80 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتلف الأنسجة المجمدة من قبل تشكيل بلورات الثلج، والتي يمكن أن تؤثر على تفاصيل تحت الخلية تغيير تلطيخ IHC40،41. فيما يتعلق بدراساتنا، كان الجانب الأكثر صعوبة العثور على الأجسام المضادة الأولية محددة ضد جزيئات حمار وحشي. على الرغم من أن حمار وحشي قد تم الاعتراف كنموذج الحيوان صالحة مع درجة عالية من المحفوظة من البنية، وقد وضعت عدد قليل جدا من الأجسام المضادة التي يمكن أن تعترف بروتينات محددة والجزيئات الأخرى في حمار وحشي. للتغلب على هذه القيود، من المهم التحقق من خصوصية الأجسام المضادة عن طريق تحليل النشاف الغربي ومحاذاة الجينات.

وقد أدى الاهتمام المتزايد في أساليب IHC إلى تطوير مناعة محددة للغاية التي يمكن أن تساعد على الدراسات التحقيقية42. يتم استخدام IHC مع زيادة وتيرة لتحديد وجود علامات جزيئية محددة وتغيراتها عبر مختلف الأمراض. النهجان المبينان هنا، المناعي والفلورسنت المناعي، لديهما مزايا وعيوب كل منهما43. الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين، وتستخدم في تقنية المناعية، يمكن أن تسمح لدقة عالية من الخلايا والأنسجة وتكشف عن تفاصيل حول توزيع وكمية البروتينات المستهدفة44،45. ومع ذلك، فإن الأنسجة المضمّنة بالبارافين ليست مناسبة للفلور المناعي، حيث أن البارافين يمكن أن يخفي الضدية ويؤدي إلى فلوريغير محدد46. من ناحية أخرى، cryosection من الأنسجة الثابتة PFA يحافظ على antigenicity الذاتية ويؤدي إلى انخفاض في الفلورسنت غير محددة. حتى لو كانت الجودة التقنية للcryosections أقل بكثير من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين، فإنها يمكن أن تسفر عن نتائج صحيحة باستخدام تقنية IHC47.

وعلاوة على ذلك، في حين أن دمج البارافين يحافظ بشكل أفضل على التفاصيل المورفولوجية، فإن الحفظ بالتبريد يحافظ بشكل أفضل على الإنزيم والتعبير عن المستضد، مما يؤدي إلى تصبغ مناعي أكثر تفصيلاً. كما تسمح تقنية الفلور المناعي بالكشف المعاصر عن جزيئات حيوية مختلفة أو ثلاثة، مما يكشف عن التفاعلات المحتملة، كما هو موضح في عملنا السابق لأنظمة أوريكسين وإندوكانابينويد10. من بين التقنيات المستخدمة للكشف عن توزيع ومستويات الجزيئات الحيوية محددة، IHC يسمح ليس فقط تحديد التعبير المورفولوجي محددة وتوزيع الجزيئات والبروتينات، ولكن أيضا إمكانية لأداء الكمية تحليل.

باستخدام الفلور المناعي ، يمكن أيضا أن يكون التوزيع المشترك وتعبير مشترك للجزيئات الحيوية مفهومة كذلك ، فضلا عن التفاعلات المحتملة وتغيراتها في حالات الأمراض المختلفة48. وقد استخدمت في كثير من الأحيان المجهر البؤري، خلال السنوات ال 20 الماضية، لدراسة التوزيع الخلوي ودون الخلوي للعديد من البروتينات في الدماغ الثدييات. كما يسمح المجهر الفلوري أيضا ً بتصور (باستخدام الفلوروفوريأو أصباغ فلورسنت) لهياكل محددة ذات أهمية، مثل البروتينات والأعضاء وغيرها من المواد البيولوجية؛ ويمكن استخدام هذه الإشارات في كل من النظم البيولوجية الثابتة والحية لتصوير هياكل فرعية محددة49. يمكن استكشاف الوظيفة التشكيلية المحتملة للجزيئات الحيوية في مقصورات خلايا محددة من خلال تصور أنماط التعبير الخاصة بها، في حين أن دور إشارات البروتين داخل الأنسجة يمكن الكشف عنها عن طريق التوزيع العصبي للخلايا تعبير الإنزيم الأيضي أو المستقبلات.

يقدم العمل التقني المقدم نهج IHC، وأساسا الفلور المناعي، لدراسة نظامين محفوظة للغاية، أوريكسين وإندوكانابينويد، في نموذج حمار وحشي للبالغين. على وجه الخصوص، يمكن استخدام أساليب الفلور المناعي لتحديد توزيع، وكمية نسبية، والتفاعلات التشريحية لبروتينات محددة في الأنسجة المستهدفة. يحافظ الحفظ بالتبريد للأنسجة الثابتة PFA بشكل أفضل على البروتينات شديدة الحساسية المعرضة للتدهور السريع. وعلاوة على ذلك، يعتقد أن الحفظ بالتبريد يحافظ بشكل أفضل على المستضد ومضادات الجينات، ويسمح بدراسة البروتينات المعدلة بعد الترجمة والحمض النووي.

حتى لو كانت الأنسجة المجمدة (مقارنة بالأجزاء المدمجة بالبارافين) أكثر سمكاً، مما يعوق القدرة على مراقبة مورفولوجيا الأنسجة بالتفصيل، فإن المجهر البؤري يسمح بتصور العينة بتفصيل كبير ويعزز قدرات التصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الفلور المناعي للتحليل الكمي لكثافة تلطيخ، والتحليل الكثافة للإشارة يوفر بيانات كمية. وهذا يسمح لتحديد الارتباطات مستويات إشارة فلوروكروم مع مستويات التعبير البروتين من خلال النظر في مناطق التوطين المشترك. يصف هذا العمل ويوضح البروتوكولات التي يمكن استخدامها لدراسة الحفظ التطوري للبروتينات الهامة في سمك حمار وحشي الكبار. استخدام IHC، وأساسا الفلور المناعي، في حمار وحشي الكبار يمكن أن تساعد على تسليط الضوء على فائدة هذا النموذج الحيواني في دراسة التعبير المورفولوجي وتوزيع الجزيئات الحيوية المحفوظة للغاية، فضلا عن الكشف عن التعديلات المحتملة عبر اختلاف الظروف المرضية المرتبطة مع علم الامراض الفيزيائية البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016، جامعة سانيو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

الكيمياء الحيوية العدد 148 كيمياء مناعية المناعية البيروسيداز مستقبلات أوريكسين مستقبلات إندوكانابينويد حمار وحشي الدماغ أمعاء حمار وحشي
تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter