Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Burada sunulan immunhistokimyasal karakterizasyon ve oreksin peptid lokalizasyonu için protokoller, oreksin reseptörleri, ve bağırsak ve normal ve diyet kaynaklı obezitenin beyni endokannabinoid reseptörleri (IO) Yetişkin zebra balığı modelleri kullanarak immunoperixidaz ve çift immünofluorescence yöntemleri.

Abstract

İmmunohistokimya (ıHC), etiketli antikorlar içeren doku bölümlerinde hedef antijenlerin saptanması ile ilgili son derece hassas ve spesifik bir tekniktir. Bu, her adımın optimizasyonunun optimum spesifik sinyali elde etmek için çok önemli olduğu çok adımlı bir süreçtir. IHC aracılığıyla, belirli biyomarkerlerin dağıtımı ve lokalizasyonu, evrimsel koruma hakkında bilgi açığa çıkarılabilir. Dahası, ıHC, obezite gibi patolojik koşullarda biyomarkerlerin ifade ve dağıtım değişikliklerinin anlaşılması için izin verir. IFC, ağırlıklı olarak immünofluorescence tekniği, Yetişkin zebra balığı 'de, fizik olarak kullanılan moleküllerin organizasyonunu ve dağıtımını algılamak için kullanılabilir, ancak standart bir IFC Protokolü estasblished değildir. Orexin ve Endokanabinoid, gıda alımı ve obezite patolojisinin kontrolünde yer alan iki yüksek oranda tüketmeli sistemlerdir. Burada bildirilen protokolleri oreksin peptid (Oxa), oreksin reseptör (Ox-2R) ve kanabinoid reseptör (CB1R) lokalizasyonu ve bağırsak ve beyin normal ve diyet kaynaklı obez (dıo) Yetişkin zebra balığı modellerinin içinde dağıtım hakkında bilgi almak için kullanılır. Ayrıca, immünoperoksidaz ve çift immünofluorescence için yöntemler, reaktifler, fiktasyon, parafin-katıştırma ve zebra balığı dokusunun cryoprotection hazırlanması ve endojen aktivite engelleme adım ve arka plan için hazırlama yöntemleri vardır karşı boyama. Parametrelerin tam kümesi önceki IHC deneylerinden elde edilir, hangi aracılığıyla biz immünofluorescence Oxs, Ox-2R ve CB1R dağılımı, yerelleştirme ve yetişkin zebra balığı ifade korunması anlayışı ile yardımcı olabilir göstermiştir Doku. Yüksek spesifik sinyal yoğunluğu ile ortaya çıkan görüntüler zebra balığı dağıtım, lokalizasyon ve spesifik biyokütörler evrimsel koruma, immünhistokimyasal çalışmalar için uygun hayvan modelleri olduğunu teyit yol açtı fizyolojik ve patolojik koşullar. Burada sunulan protokoller yetişkin zebrafish ıFC deneyler için tavsiye edilir.

Introduction

İmmünhistokimya (IHC), antijen-antikor etkileşimi1,2ile hücresel veya doku bileşenlerini (antigens) tanımlamak için kullanılan iyi kurulmuş bir klasik tekniktir. Bir doku içinde hedef biyomoleküllerin lokalizasyonu ve dağılımı tanımlamak için kullanılabilir. IHC doku bölümlerindeki antijenleri algılamak için immünolojik ve kimyasal reaksiyonlar kullanır3. Antijen-antikor etkileşimlerinin görselleştirme için kullanılan ana belirteçleri floresan boyalar (immünofluorescence) ve enzim-substrat renk reaksiyonları (immünoperoksidan), hem antikorlar4konjuate. Mikroskobik gözlem kullanarak etiket doku lokalizasyonu belirlemek mümkündür, hangi yaklaşık doku hedef antijen lokalizasyonu karşılık gelir.

Floresan veya kromojenik reaksiyonlar için protein algılamak için iki yöntem var: belirli birincil antikor doğrudan etiketli olduğu doğrudan algılama yöntemi; ve ikincil antikor etiket5,6,7taşır ederken primer antikor unconjuated olduğu dolaylı algılama yöntemi. Dolaylı Yöntem, çoğunlukla sinyal amplifikasyonu olan bazı avantajlara sahiptir. Dahası, diğer moleküler ve hücresel tekniklerin aksine, immünofluoresesans ile, hücreler ve dokular içinde ayırt edilen iki veya daha fazla proteinin dağılımı, lokalizasyonu ve koifadesini görselleştirmek mümkündür7. Kullanılan algılama yönteminin seçimi deneysel ayrıntılarına bağlıdır.

Bugüne kadar, ıHC yaygın olarak temel araştırmalarda biyomarkerlerin dağıtımını ve lokalizasyonunu ve insan biyolojik dokuda farklı proteinlerin genel profillerini omurgasızlar8' e kadar anlamak için güçlü ve temel bir araç olarak kullanılmaktadır. 9 , 10 ' dan fazla , 11. Teknik, normal ve değiştirilmiş hayvan organlarının ve farklı doku türlerinin çok sayıda protein ifadesinin bir haritasını görüntülemenize yardımcı olur ve fizyolojik ve patolojik değişikliklerle indüklenen ifadenin olası aşağı veya yukarı düzenlemesini gösterir. IHC en iyi sonuçları elde etmek için doğruluk ve doğru Yöntem seçimi gerektiren son derece hassas bir tekniktir12. Her şeyden önce, fiktasyon, çapraz reaktivite, antijen alımı ve antikorların duyarlılığı gibi birçok farklı faktör yanlış pozitif ve yanlış negatif sinyallere yol açabilir13. Antikor seçimi, ıHC 'deki en önemli adımlardan biridir ve antijen özgüllüğü ve soruşturma altında protein ve türe olan benzeşimine bağlıdır7.

Son zamanlarda, Yetişkin zebra balığı dokusunda orexin/ikiyüzretin ve endokannabinoid sistemlerinin üyelerini algılamak için ihc tekniği optimize edilmiştir. Biz temel olarak sabitleme, doku katıştırma iki farklı yaklaşımlar, bölümlenme ve montaj (hangi çözünürlüğü ve ayrıntı mikroskobik analiz sırasında etkileyebilir), ve engelleme (yanlış pozitireleri önlemek ve arka plan azaltmak için)14odaklı. Diğer önemli özellikler, bireysel ıHC protokollerinin antikor özgüllüğü ve seçicilik ve yeniden üretilebilirliği. Antikor özgüllüğü sağlamak için anahtar negatif kontroller (hiçbir primer antikorlar veya hedef proteinleri ifade değil bilinen doku dahil) kullanımı yanı sıra pozitif kontroller (hedef proteinleri ifade bilinen doku dahil)15 . IHC için antikorların seçimi kendi türlerine göre yapılır-özgüllük (onlar faiz antijeni ile reaksiyon olasılığı) ve kullanılan antijen-antikor bağlama algılama sistemleri4,5,6 ,7. İmmünoperoksidaz durumunda, reaksiyon rengi, genellikle diaminobenzidin (kahverengi)16, çökelme Kromojen seçimi ile belirlenir. Öte yandan, benmmunofluorescence, dondurulmuş doku bölümlerinde protein ifadesini görselleştiren ve kromojenik algılama sistemine göre çoklu proteinlerin kolay analizine olanak sağlayan bir fluorophor ile konjuke edilen antikorları kullanır 5 , 7' ye kadar.

İmmünoperoksidaz tekniği, ikincil antikor biotin, bir bağlayıcı molekül bir kromojenik muhabir molekül [avidin-biotin kompleksi (ABC)], boyama sinyalinin amplifikasyon lider işe yeteneğine konjugated olduğunu. ABC Reporter yöntemi ile, enzim peroksidaz, 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) ile tepki verir, enzim ikincil antikor bağlayan bir yoğun kahverengi renkli boyama üreten, daha sonra sıradan bir ışık mikroskobu ile analiz edilebilir. ABC boyama, biotin için avidin yüksek yakınlık nedeniyle, hızlı ve optimum reaksiyon üretir, primer antikor reaktivite siteye bağlı birkaç ikincil antikorlar ile. Bu kromojenik algılama yöntemi, sinyalin densitometrik analizini sağlar ve kahverengi sinyal düzeylerinin protein ifade seviyeleri18ile korelasyon temelinde yarı nicel veriler sunar.

İmmünofluoresesans teknikleri ile, farklı fluorokrotların benzersiz dalga boylarında ışık yayması yeteneği nedeniyle çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak algılanması mümkündür, ancak spektral çakışmayı en aza indirmek için florokromlarla 'i dikkatle seçmek önemlidir 5. dahası, farklı ev sahibi türlerin primer antikorların kullanımı çapraz reaktivite ile ilgili zorlukları en aza indirir. Bu durumda, her türe özgü ikincil antikor primer antikor yalnızca bir tür tanır. Floresan gazeteciler, Alexa Fluor boyalar gibi ticari türevleri de dahil olmak üzere küçük organik moleküllerdir.

Birçok hayvan modelleri özellikle fizyolojik ve patolojik koşulları anlamak için kullanılır. Bugüne kadar, evrim boyunca birçok metabolik yol tarafından temin edilir. Bu nedenle, zebra balığı gibi model organizmalarda IHC çalışmaları, patolojik ve patolojik olmayan koşulların Yaratılış ve bakımı hakkında bilgi verebilir17. Bu raporun bir amacı, Yetişkin zebra balığı doku üzerinde gerçekleştirilebilecek IHC protokolleri göstermek ve dağılım ve lokalizasyonu Oxa, Ox-2R ve CB1R ayrıntılı görüntüleri elde etmek için kullanılan periferik ve merkezi düzeylerde. Ayrıca, Yetişkin zebrafish periferik ve merkezi dokularda iki büyük ıHC dolaylı yöntemlerin uygulanması için protokoller olduğunu bildirdi. Açıklanan dolaylı Yöntem, hangi ikincil bir antikor floresan boya (immünofluorescence yöntemi) veya enzim muhabiri (immünoperoksidan yöntemi) konjuli durumlarda sinyal amplifikasyon için izin verir. Hem kromojenik ve floresan algılama yöntemleri avantajları ve dezavantajları sahip. Bu protokolde bildirilen ıHC kullanımı, özellikle immünofluorescence, Yetişkin zebrafish, yaygın olarak farklı fizyolojik ve patolojik koşullar arasında gelişen evrimsel sistemleri incelemek için kullanılan bir hayvan modeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. immünoperoksidaz Protokolü

Not: zebra balığı tarafından elde edildi Prof. Omid Safari (balıkçılık bölümü, doğal kaynaklar ve Çevre Fakültesi, Ferdowsi meşhad Üniversitesi, meşhad, Iran)10.

  1. Doku diseksiyonu
    1. Buz suyunda (5 parça buz/1 parça su, 4 °C) dalgıç ile zebrafi feda etmek; hipoksi tarafından ölüm sağlamak için tüm hareketin durdurulması kadar onları bırakın.
    2. Hızlı bir şekilde aşağıdaki diseksiyon yöntemi ile bağırsak ve beyin çıkarın:
      1. Bir kağıt havlusu üzerinde balık kuru ve bir kesme mat üzerinde sagittally yer, göz soketi ve kuyruk etli kısmının ventral parçası engelleme.
      2. Bağırsak için: cildi kesti ve iç organlar görünür olana kadar cilt ve altta yatan kas dikkatle balık tarafında çıkarın. Bağırsak Vücut boşluğundan dışarı uzanan çıkarın.
      3. Beyin için: baş bir jilet ile çıkarın. Forseps ile kafatasının ventral tarafında yumuşak doku çıkarın. Kafatası açın ve beynin ventral tarafında kemik çıkarın. Beyin dorsal tarafında cilt ve kafatası kemikleri çıkarın. Beyni çıkarın.
  2. Doku fikreme
    1. % 4 paraformaldeyde (PFA) fosfat tamponunun (PB, pH 7,4, 4 °C) Oda sıcaklığında (RT) 3 saat içinde daldırma ile diseksiyon dokularda düzeltin.
      1. Hazırlamak 0,1 M PB, NaH2Po4H2o ve 4,575 g Na2HPO4 içinde 450 mL distile su (DH2o), 1,755 g çözünerek ve bir pH için ayarlayın 7,4 gerekli miktarı ile NaOH 1n.
      2. 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4), bir ısı plakasında agitasyon ile 4 g PFA çözünme 4% PFA hazırlayın. 60 sıcaklığa ulaşıldığında, net bir çözüm elde etmek için 2-4 damla NaOH 1N ekleyin. Sol PFA 4% RT ve kontrol pH. PH 7,4 için ayarlayın.
        Not: fazla 4-6 h için doku fiks overfixation neden olabilir, hangi maskeler antijenler, antikor-epitope bağlayıcı sınırlama. Fikreme zamanı doku boyutuna bağlıdır.
  3. Doku Gömme
    1. 0,1 M PB 'de (pH 7,4) daldırma ile dokuları 5 dk için beş dakika durulayın.
    2. Alkol% 70 (6 dk),% 80 (6 dak),% 95 (5 dak),% 95 (5 dak),% 100 (1 dak) ve% 100 (1 dak) sonraki daldırma tarafından dokularda kurutmak.
    3. % 100 alkol: ksile (1:1) 10 dakika, daha sonra 5 dk için Ksilin içinde 2x daldırma tarafından dokulara açıklığa kavuşturmak.
    4. Parafin balmumu ile dokulara sızmak (56 °C) iki kez 1 saat her biri doğrudan daldırma parafin.
    5. Dokuları parafin bloklarında oda sıcaklığında (RT) katıştırın ve sekeme kadar RT 'de saklayın.
  4. Doku kesimi
    1. Dokuları Microtome ile 8 μm kalınlığında koronal veya sagittal bölümlere kesebilir ve alternatif serisindeki bölümleri su üzerinde yapışkan cam kaydırakları üzerine toplayıp 38 °C ' de ısıtılmış şekilde toplar.
    2. 37 °C ' de bir gecede bölümlere sahip slaytlar kurulayın.
  5. Doku bölümlerinin deparaffinization ve rehidrasyon
    1. 3 dakika boyunca Ksilin içinde daldırma tarafından takip 5 dakika boyunca Ksilin içinde daldırma tarafından bölümleri dewax.
    2. Bölümleri, alkol 100% II (1 dak),% 100 ı (1 dak),% 95 (1 dak),% 75 (1 dak),% 50 (1 dak), sonra da slaytları dH2O 'ya (5 dk) yerleştirin.
      Not: reaksiyonu başlatmadan önce bölümleri tamamen arındırın. Bölümler hala parafin izleri varsa, 5 dakika veya daha fazla için ksilon ek bir daldırma gerçekleştirin.
  6. Antijen alımı
    1. Çözüm içinde slaytlar daldırma ve maksimum güç 5 dakika için bir mikrodalga fırında Isıtma tarafından sitrat tampon (0,01 M, pH 6,0) ile bölümleri Treat.
    2. Bölümleri soğumaya bırakın.
    3. Antijen alımı tamamlamak için maksimal güç mikrodalga içinde 5 dk döngüsü tekrarlayın.
      1. (0,01 M, pH 6,0) 2,10 g sitrik asit, dH2o ve 5,882 gr sodyum sitrat, DH2o, 200 ml içinde, bir 0,01 m) ile, sitrik asit (0,01 metre) ile bir 100 oranı ve pH ayarlamak için hazırlama 6 HCl 0.1 N kullanarak.
  7. Endojen peroksidaz engelleme
    1. Solvent geçirmez kalemle slaytlardaki doku alanını demarcate.
    2. 3 kez, 5 dk her, Tris-tamponlu tuz çözeltisi (TBS) (0,1 M, pH 7,3) ile bölmeler durulayın.
      1. 0,1 M TBS 'yi 12,1 g trizma tabanı ve 9 gr NaCl 'yi, 950 mL dH2O ile hazırlayın ve pH 7,3 ile HCL 0.1 n ile ayarlayın.
    3. 0,75% H2O2 ' de RT 'de 5 dk 'da bir çözelti içinde slayt daldırma ile endojen peroksidaz etkinliğini engelleyin.
      1. 0,75% H2o2 çözeltisi 5 ml% 30 h2o2 ' sini 195 ml 'de DH2o 'ya hazırlayın.
        Not: ndojen enzimler ıFC reaktifler ile reaksiyon verebilir ve yanlış pozitif sonuçlar verir. Dahası, son derece vaskülarized dokular birçok endojen peroksidaz ifade, hangi yoğun nonspesifik boyama ve arka plan seviyeleri yol açabilir. % 0,75 H2O2 ile tedavi endojen peroksidaz quenches ve belirgin nonspesifik arka plan azaltır.
  8. Spesifik olmayan engelleme bindi ng siteleri ve doku geçirgen
    1. Spesifik olmayan bağlayıcı siteleri engellemek için RT 'de 30 dakika süreyle primer antiserum (NRS) içeren TBS/0,4% Triton (TBS-T) engelleme tamponunu içeren doku bölümlerini kulbe etmek.
      1. 0,4% Triton ' ü, 100 mL 'lik TBS 'de 0,4 mL Triton X-100 ' ı çözerek hazırlayın.
      2. 0,4% Triton X-100 (1 mL normal serum + 8,2 mL TBS + 0,8 mL, 0,48 Triton X-100) içeren TBS 'de% 1 normal serum sökerek engelleyici tampon TBS-T çözümünü hazırlayın.
        Not: ikincil antikor ana bilgisayara bağlı olarak hayvan serumu türünü seçin (örneğin, bir keçi Anti-tavşan ikincil antikor kullanırken, normal keçi serumu kullanın).
  9. Primer antikor ile doku inkübasyon
    1. TBS-T ' l a seyreltilmiş primer antikorlarla Aşağıdaki primer antikor ile bölümler leke:
      1. OX-2R seyreltilmiş 1:200 karşı keçi antikor, protein C-terminali tanır.
      2. OX-A seyreltilmiş 1:200 [orexin-A (C-19)], protein C-terminali tanıyan karşı keçi antikor.
        Not: birincil antikor ilgi biyomolekül ile tepki emin olun. Primer antikor gen hizalamasını kullanarak tepki veren biyomolekül hangi epitopu ile tanımlayın. Örneğin, Ox-a epitopu, insan Ox-a (O43612) aa 50-100 arasında eşleştirilmiştir ise Ox-2R epitopu C-Terminal insan son 50 AA yakın eşleştirilmiştir.
  10. İkincil antikor ile doku inkübasyon
    1. 0,1 M TBS (pH 7,3) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    2. 1,5 h için bölümler kulbinın RT biyotinlenmiş ikincil antikor ve tavşan Anti-keçi immünoglobulin ile (h + L) Biotin ile konjuate, daha sonra TBS-T 1:100 seyreltilme.
      Not: test ve arka planda azalma sağlayan optimum seyreltme bulmak için hem primer hem de ikincil antikorların farklı seyreltmeleri bulmak.
  11. Peroksidaz reaksiyonu
    1. 0,1 M TBS (pH 7,3) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    2. Avidin-biotin kompleksi (ABC) ile bölümleri 1 saat boyunca kulbin.
      1. İki damla bileşen A 'nın ardından 5 mL TBS 'de iki damla B bileşeni ekleyerek ABC çözümünü hazırlayın.
    3. 0,1 M TBS (pH 7,3) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    4. Bölümleri Kromojen substrat 3, 3 '-diaminobenzidin-4 (DAB) ile tedavi edin.
      1. DAB çözeltisi (yaklaşık 30 μL) DAB Kromojen bir damla ekleyerek hazırlamak 1 mL DAB seyreltilmeye konsantre ve kullanmadan önce iyi karıştırın.
        Not: kullanmadan önce ABC çözümünü en az 30 dakika hazırlayın ve istikrarlı avidin/biotin bağlayıcılığı için izin verilinceye kadar kompleksi 4 °C ' de tutun. Taze DAB çalışma çözümünü hazırlayın, doku bölümlerine uygulayın ve renk uygun olana kadar geliştirin. Kromojenik reaksiyon epitopu siteleri kahverengi bir renge dönüştürdüğünde ve sinyalin yoğunluğu görüntüleme için uygun olduğunda, bir sonraki adıma geçin. DAB geliştirme zamanlaması birkaç saniyeden 10 dakikaya kadar değişebilir. OX-A ve OX-2R için 1, 2 dakika yeterlidir. Kanserojen olduğu için DAB 'i dikkatli bir şekilde tutur.
  12. Doku dehidrasyon ve montaj
    1. DAB reaksiyonu durdurmak için 0,1 M TBS (pH 7,3) ile her biri 5 dakika boyunca 3x tüm bölümleri durulayın.
    2. Alkol% 50 (2 dak),% 75 (2 dak),% 95 (2 dak),% 100 ı (2 dak),% 100 II (2 dak) sonraki slaytlar daldırma tarafından bölümler kurutmak.
    3. Her biri 10 min ksilen 2x daldırma tarafından dilimleri açıklığa kavuşturmak.
    4. Medyeler için DPX (Dibutil ftalat Ksilol) mountant ile bölümleri monte edin, slaytlara iki damla montaj ortamı ekleyerek ve yavaşça kaplarla Tepesi yapın.
      Not: dehidrasyon sırasında alkolün artan konsantrasyonlarda doku daldırma nedeniyle alkol doku ve alkol ile su değiştirme, kesin bir dehidrasyon zaman belirlemek ve dokuları susuz yok. Dokusunu açıklığa kavuşturmak ve herhangi bir aşırı veya kalan alkol kaldırmak için dehidrasyon sonra Ksilin içinde daldırma gerçekleştirin.
  13. Denetim
    1. Birincil antikor ve/veya TBS (negatif kontroller) tarafından primer antikor veya ikincil antikor IgG yerine, 1.1 – 1.12 bölümlerini tekrarlayın.
    2. Tekrar bölümler 1.1 – 1.12 bağıl peptid fazlası ile her primer antikor ön emici (100 mg peptid/1 mL seyreltilmiş antiserum).
    3. Farklı dokuları pozitif kontrol (örn. fare dokusu) kullanarak 1,1 – 1.12 bölümleri tekrarlayın.
      Not: başlamadan hemen önce tüm arabellekleri taze hazırlayın. Her adımda bir pipet veya filtre kağıdı ile her aşamada aşırı sıvısı dikkatle çıkarın, her zaman bölümler ıslak tutmak.
  14. Görüntü edinme ve analiz
    1. Dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir mikroskop kullanarak sürekli ışık aydınlatması ve aynı büyütme altında dijital görüntüler elde etmek.
    2. Görüntüleme yazılımını kullanarak boyama yoğunluğunun yarı nicel analizini gerçekleştirin (bkz. malzeme tablosu).
      1. OX-A veya OX2-R pozitifliğinin indekslerini değerlendirmek için yakalanan görüntüleri. lif veya. tiff dosya biçiminde açın.
      2. Ölçü altında düğmesini seçin ve manuel countingtıklayın. Fareyi tıklatarak pozitif hücrelere bir işaret koyarak doğrudan ekrandan lekelenmiş hücre profilinin sayısını say.
      3. Bağışıklık sinyali yoğunluğunu (optik yoğunluk, OD) ölçmek için bir ilgi alanı (YG) alanını (3 x 103 μm2) seçin.
      4. En yüksek yoğunluklu (yüksek pozitif) ve en az yoğunluk (negatif) ile piksel belirlemek için (yani, lekeli hücrelerin yoksun doku bir kısmı) arka plan değeri olarak sıfır atamak için analiz edilmiş görüntü içinde.
      5. Emilme Logaritmik ölçeği üzerinde çalışarak OD değerlendirmek. Dijital görüntü analizinde, DAB piksel yoğunluğu en koyu (0 değeri) en hafif (255 değer) gölgesinde değişmektedir.
      6. Aşağıdaki histogram çizerek OD belirleyin: günlük10(255/i), burada "ı" program tarafından verilen ve arka plan çıkararak belirlenen piksel yoğunluğu değeridir.
        Not: kalıcı ve istikrarlı immünoperoksidaz reaksiyonu, herhangi bir zamanda parlak alan mikroskobu altında analiz edilebilir. Bitişik bölümlerden aynı hücrenin çift sayımını önlemek için diğer bölümde etiketli hücrelerin sayımını gerçekleştirin.

2. immünofluorescence Protokolü

  1. Doku diseksiyonu
    1. 1,1 bölümünde açıklandığı gibi hayvanları feda etmek ve incelemek.
  2. Doku fikreme
    1. 4 °C ' de% 4 PFA 'da 3 h için daldırma ile bağırsak ve beyin düzeltin.
      1. Bölüm 1.2.1 olarak PB ve% 4 PFA hazırlayın.
        Not: sabitleme süresi doku boyutuna bağlıdır. 4 – 6 h 'den fazla doku sabitleme, antijenleri maskeleyen ve antikor-epitope bağlayıcı sınırlamaları olan aşırı sabitleme neden olabilir.
  3. Doku Gömme
    1. 0,1 M PB (pH 7,4) ile 5 dakika her biri için 3 adet dokularda durulayın.
    2. Cryoprotection için, dokuları PB 'de% 20 sakaroz (0,1 M, pH 7,4) transfer edin ve gece 4 °c ' de tutun. Sonra, 0,1 M PB (pH 7,4) içinde% 30 sakaroz dokulara aktarmak ve 4 °c ek bir gece için tutun.
    3. En iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği bloğuna dokulara katıştırın. Bunu yapmak için, sıvı nitrojen küçük bir Dewar hazırlamak, alüminyum folyo almak ve bir Pan oluşturmak için yarısını kesti. Ekim bileşiği ile dolu dokulara içeren Pan EKIM bileşik soğutulur kadar sıvı azot daldırılmış olması gerekir. Dondurulmuş dokular-80 °C ' de bölünene kadar saklanabilir.
  4. Doku kesimi
    1. Dondurulmuş doku bloklarını-20 °C ' de bir kriyostat 'e aktarın ve 10 μm ' lik koronal veya sagittal bölümlerde keser.
    2. Alternatif seri bölümlerde, İmmünohistokimya uygun yapışkan cam kaydırakları üzerine dokular toplayın ve kullanım kadar-20 °C ' de saklayın.
      Not: siyah slayt kutusunda veya slayt kitabında-20 °C ile 4 °C arasında slaytlar saklayın.
  5. Nonspesifik bağlama siteleri ve doku geçirgen engelleme
    1. Bir solvent dayanıklı kalem ile slayt üzerinde doku alanı demarcate.
    2. 0,1 M PB (pH 7,4) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    3. Hücre membranı geçirgen ve nonspesifik bağlayıcı siteleri engellemek için RT 'de 30 dakika boyunca% 1 ' lik (PB-Triton X-100% 0,3) geçirgen tamponda çözünmüş normal eşek serumu ile bölümleri inkük.
      1. Triton X-100 0,3% 0,3 mL,% 100 M PB (pH 0,1) ' te,% 100 Triton X-' i hazırlamak.
      2. 0,3% TritonX-100 içeren PB cinsinden% 1 normal eşek serumu çözme engelleme çözümünü hazırlayın.
        Not: geçirgen ve engelleme tamponları kullanılan serum hayvan türleri ikincil antikor ana bağlıdır.
  6. Primer antikorların karışımı ile inkübasyon
    1. 0,1 M PB (pH 7,4) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
      1. PB-T ' l a seyreltilmiş primer antikorların karışımı ile RT 'deki nemli bir kutuda bir gecede bölümleri kulyın. Aşağıdaki primer antikorların karışımları kullanılabilir: OX-2R karşı keçi antikor 1:100/tavşan antikor karşı CB1R seyreltilmiş 1:100, veya keçi antikor OX-A seyreltilmiş 1:100/tavşan antikor karşı CB1R seyreltilmiş 1:100.
  7. İkincil antikorların karışımı ile inkübasyon
    1. 0,1 M PB (pH 7,4) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    2. 1 ile RT 2 h için bölümler inkük) eşek Anti-tavşan Alexa Fluor 488-konjuate ikincil antikor ve eşek Anti-keçi Alexa Fluor 594-konjuate ikincil antikor seyreltilmiş 1:100 PB-T bir karışımını; veya 2) bir karışımı eşek Anti-keçi Alexa Fluor 488-konjuli ikincil antikor ve eşek Anti-tavşan Alexa Fluor 594-konjuli ikincil antikor seyreltilmiş 1:100 PB-T.
      Not: aynı hayvan ev sahibi geliştirilen ikincil antikorlar kullanın. Normal serum ikincil antikor aynı türe ait olmalıdır (örneğin, eşek ve bir eşek normal serum geliştirilen ikincil antikorlar kullanın). Hücre geçirgenlik artırmak ve arka plan azaltmak için deterjan içeren tampon engelleme ile primer ve ikincil antikorlar seyreltmek.
  8. Doku montajı
    1. 0,1 M PB (pH 7,4) ile 5 dakika her biri için 3x bölümleri durulayın.
    2. Nükleer boya DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ile bölümler counterstain 1,5 μL DAPı (1 mg/mL) 3 mL PB içinde çözülme hazırlandı.
    3. Montaj ortamına sahip coverslip slaytlar (bkz. malzeme tablosu). Bu sulu montaj ortamı, uzun süreli kullanım için doku örneğini ve lekeleri stabilize eder. Floresan numuneler 4 °C ' de karanlıkta saklanabilir. Fluoroforların ömrünü uzatmak için, bir antifed montaj ortamı kullanın.
      Not: iyi bir montaj ortamı seçin. Montaj ajanlarının en önemli parametrelerinden biri, 1,5 civarında olması gereken refraktif indeksdir (nD), cam kırılma indeksidir. Burada kullanılan montaj ortamı özellikle enzim ve lipid tespitleri için hazırlanmış numune ile kullanılabilir (yani, artan bir alkol serisi ile susuz olmamalıdır örnek).
  9. Denetim
    1. 2.1 – 2.8, birincil veya ikincil antikor atlayarak veya özel adımda PB (negatif kontrol) ile birincil veya ikincil antiserumlarla yerine yineleyin.
    2. Tekrar Bölüm 2.1 – 2.8, önceden absorbe her primer antikor bağıl peptid aşırı (100 mg peptid/1 mL seyreltilmiş antiserum).
    3. Bölüm 2.1 – 2.8 fare beynin dilimleri üzerinde tekrarlayın (pozitif kontrol).
      Not: başlamadan hemen önce tüm arabellekleri taze hazırlayın. Her adımda bir pipet veya filtre kağıdı ile her aşamada dikkatle sıvı aşan çıkarın, her zaman bölüm nemli tutmak.
  10. Görüntü edinme
    1. Bir x-y-z motorlu sahne, dijital kamera ile donatılmış bir Konfokal mikroskop kullanın ve NIS-Elements C gibi satın alma ve görüntü analiz yazılımı gözlemleyip immünostize bölümleri analiz etmek. 5-20-40X hedeflerini kullanarak dijital görüntüler edinin.
    2. Düşük büyütme (10X veya 20X amaç) her bölümün görüntüleri almak için kullanılabilir her kanalın bir alt büyütme montaj oluşturmak için, lokalizasyon ve belgeleri OX-2R/CB1R kolaylaştırmak için tüm bölgenin bir genel bakış sağlayarak anatomik ortak ifade. Floresans görüntülerini analizden önce maksimum kontrast ve bindirmeye normalleştirin.
    3. İlgi alanı boyunca görüntülerin seri Z-yığınları toplayın. Ox-2R/CB1R ekspresyonları sarı puncta olarak görselleştirilen doku hacmini kapsayacak şekilde 1 – 1.8 μm odak adımlarına sahip altı odak düzleminden (Z-Step) görüntüleri edinin. Her kanal için bu koleksiyonu (kırmızı, yeşil, mavi) ayrı olarak, Z motorlu bir mikroskop kullanarak yapmak.
    4. On yineleme uygulaması ile görüntüleri deconvolve bir görüntüleme deconvolution yazılımı kullanın ve tek bir maksimum projeksiyon görüntü içine seri Z düzlemleri görüntüleri daraltma.
    5. Adobe Photoshop 6,01 (Adobe Systems, San Jose, CA) kullanarak ışık ve kontrast için mikrograflarının ayarlayın.
      Not: arka planı daha da azaltmak için gözlem sırasında deconvolution adımını gerçekleştirin. Photobleaching önlemek için ışık slayt pozlama sınırlayın.
  11. Görüntü Analizi
    1. Her hayvanın ilginin tüm bölgesini kapsayan, 10 μm kalınlığında (grup başına n = 5 hayvan) alternatif olarak Ox-2R/CB1R ekspresyonları 'un nicel analizini gerçekleştirin.
    2. Ox-2R/CB1R ekspresyonları 'u, yarı otomatik görüntü analizi sistemi ile sarı pozitif puan sayısı olarak ölçün. Imagins yazılımı, farklı floresan problar arasındaki örtüşme bölgeleri ile ilgili nicel verilerle daha yüksek ayrıntı düzeyi sağlayabilir.
    3. İki kanalda sinyal yoğunluğu için eşik araçları kullanarak puan ölçmek. . Liff,. tiff veya. jpg görüntüleri dosyasını açın ve Image – Thresholdöğesini seçin. Otomatik ayar veya manuel yöntem seçeneğini belirleyin ve tüm lekeli delik seçilinceye kadar Threshold 'u düzenleyin. Görüntünün bir alanında, arka plan eşiğini elde etmek için immünolablı nesneler içermeyen piksel yoğunlukları dağıtımını analiz edin. Her görüntü için bu arka planı tek başına belirleyin. Program daha sonra arka plan eşik piksel yoğunlukları arka plan değerine ayarlayarak kaldırır.
    4. Analiz et-ölçmek seçin ve ölçülecek parametreleri seçin (puncta yoğunluğu-minimum, maksimum ve ortalama değerler; immünolablı puncta sayısı/yoğunluğu).
    5. Her bölüm için 4 Z-yığınları içinde doku hacmi boyunca sarı puan saymak, en iyi odak düzlemine hemen yukarıda veya altında yığınları kullanarak. Odağı olmayan bölgeleri çözümden dışlayın.
      Not: bitişik bölümlerden aynı hücrelerin çift sayımını önlemek için diğer bölümde etiketli hücrelerin sayımı gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İmmünoperoksidaz boyama için temsili veriler Şekil 1 ve Şekil 2' de gösterilir. Yetişkin zebra balığı bağırsaklarında Ox-a ve Ox-2R dağılımı immunohistokimyasal Analizi Ox-a ve Ox-2R farklı yerelleştirme siteleri ve DIO zebra balığı bağırsak hücrelerinde ifade artışlar gösterdi. Medial ve anterior bağırsak hücrelerinde OX-A için yoğun bir kahverengi boyama görüldü (Şekil 1a, A1). OX-A ' d A k i bağışıklık ifadesi, farklı bağırsak bölmeleri içinde ön taraftaki medial bağırsakta azalan net sinyaller verdi (Şekil 1B, B1). Negatif kontrol arka plan için bir referans olarak kullanılan ve OX-A sinyalinin özgüllüğü onaylamak için (Şekil 1E). Kromojen DAB 'ye uzun süreli maruz kalma, arka plan yoğunluğunun artması ile sonuçlandı (Şekil 1D). Benzer sonuçlar, DIO bağırsak ve kontrol diyet zebra balığı içinde Ox-2R immünıflık için gözlendi (Şekil 2). IO yetişkin zebra balığı 'de bir artan Ox-A sinyali, diğer intestinal bölmeleri (Şekil 2B, B1) Ox-2R ' n i n aşırı ifadesiyle eşlik etti.

İmmünofluoresesans kullanarak, immünoperoksidaz analizi ile elde edilen veriler, kontrol (Şekil 3) ile ilgili yetişkin ZIO zebra balığı gut Ox-A ve Ox-2R ifade artışının altta yatan teyit edildi. Dahası, Çift immünofluorescence kullanarak, endokannabinoid reseptör CB1R ifade hakkında bilgi elde etmek mümkün ve Ox-A veya Ox-2R ve bağırsak ve kontrol diyet beyin ve zıs yetişkin zebrafish ile ortak lokalizasyonu. İmmünofluoresesans avantajı, immünoperoksidaz tekniği ile karşılaştırıldığında, doku morfolojisi hakkında daha az bilgi sağlayan daha ayrıntılı bir sinyal vermidir. İmmünofluorescence yöntemi kullanarak, daha önce gut ve beyin10Ox-2R ve CB1R arasında anatomik etkileşimleri belirledi.

İmmünofluorescent görüntülerin doğru analizi, kontrol diyet zebra balığı (Şekil 3B, C) ile karşılaştırıldığında DIO yetişkin zebra balığı bağırsakta Ox-2R/CB1R Co-yerelleştirme artış gösterdi. Benzer bir durum, dorsal telencephalon, hipotalamus (lateral, ventral ve dorsal bölgeler), optik tectum, torus lateralis ve inferior lob difüzör çekirdeği gibi farklı beyin bölgelerinde gözlenmiştir (Şekil 4). Negatif (Şekil 5A, B) ve pozitif (fare beyin) (Şekil 5c) kontrolleri arka plan için referanslar olarak kullanılan ve CB1R ve Ox-2R sinyallerinin özgüllüğü onaylamak için.

Dahası, OX-A/CB1R ile çift immünostasyon ile, hipotalamusun orexinerjik nöronlarının, OX-A flüoresan sinyalinin artması ile birlikte ortak lokalizasyon artışı olduğunu gözlemlenmiştir (Şekil 6). Bu sonuçlar, Çift immünofluoresesans fizyolojik olarak bulunan protein ifadesini, hedef proteinlerin ortak lokalizasyonu ve farklı patolojik koşullarda dağıtım ve/veya ifade değişikliklerini belirlemeye nasıl yardımcı olabilir gösterir.

Figure 1
Resim 1: Indio vs kontrol diyet yetişkin zebrafish bağırsaklarda orexin immunlokalizasyonu. (A) Ox-kontrol diyet zebrafish medial bağırsak hücrelerinde bir immünoreactivity. (A1) OX-ıO zebrafish medial bağırsak hücrelerinde bir immünoreactivity. (B) Ox-kontrol diyet zebrafish anterior bağırsak hücrelerinde bir immünoreactivity. (B1) OX-ıO zebrafish anterior bağırsak hücrelerinde bir immünoreactivity. (A1, B1) IO zebrafish medial ve anterior bağırsağın farklı doku bölmesi OX-A pozitif hücrelerin bir artış. (C) Ox-IO zebrafish anterior bağırsak hücrelerinde bir immünoreactivity. (D) DAB 'ye uzun süre maruz kaldıktan sonra Ox-A için immünoperoksidaz reaksiyonu. (E) negatif kontrol. Ölçek çubuğu: 50 μm (A, A1, B, b1); 100 μm (C, D, E). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Orexin 2 HıO vs kontrol diyet yetişkin zebrafish bağırsakta reseptör immunlokalizasyonu. (A) kontrol diyet zebrafish medial bağırsak hücrelerinde Ox-2R immünoreactivity. (A1) IO zebrafish medial bağırsak hücrelerinde OX-2R immünoreactivity. (B) kontrol diyet zebrafish anterior bağırsak hücrelerinde Ox-2R immünoreactivity. (B1) OX-2R ımdio zebrafish anterior bağırsak hücrelerinde immünoreactivity. (A1, B1) IO zebrafish medial ve anterior bağırsak farklı doku bölmeleri OX-2R pozitif hücrelerin bir artış. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 3
Şekil 3: Ox-A dağıtımı (yeşil)/CB1R (kırmızı) ve Ox-2R (kırmızı)/CB1R (yeşil) ve Ox-2R/CB1R (sarı) ile onların Co-YERELLEŞTIRME DIO vs. kontrol diyet yetişkin zebrafish bağırsaklarında . (A) kontrol diyet yetişkin zebrafish bağırsakta Ox-A/CB1R Co-ifade. (B) kontrol diyet zebrafish bağırsak içinde Ox-2R/CB1R Co-ifade. (C) Ox-2R/CB1R Co-ıfıo yetişkin zebrafish bağırsak içinde ifade. DIO zebrafish bağırsakta OX-2R/CB1R Co-yerelleştirme (sarı noktalar) bir artış. Ölçek çubuğu: 25 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 4
Şekil 4: Ox-2R (kırmızı) ve CB1R (yeşil) ve onların Co-lokalizasyonu Ox-2R/CB1R (sarı) ve beyin koronal bölümlerde ıMDIO vs kontrol diyet yetişkin zebrafish dağıtımı. (A) kontrol diyet zebrafish telencephalon Ox-2R/CB1R Co-ifade. (A1) OX-2R/CB1R Co-ıfıo zebrafish telencephalon içinde ifade. (B) lateral içinde Ox-2R/CB1R ortak ifade, hipotalamus ventral ve dorsal bölgesi, optik tectum, torus lateralis, kontrol diyet zebra balığı inferior lob diffuz çekirdeği (B1) Ox-2R/CB1R ortak ifade lateral içinde, ventral, ve Hipotalamus, optik tectum, torus lateralis dorsal bölgeleri ve ıNDIO zebrafish inferior lob diffik çekirdeği. (C) kontrol diyet zebrafish Ox-2R/CB1R (sarı) ortak ifade gösteren optik tectum yüksek büyütme. (C1) Optik tectum yüksek büyütme OX-2R/CB1R (sarı) ıDIO zebrafish içinde ortak ifade gösteren. (D) zıC zebrafish içinde Ox-2R/CB1R (sarı) dağıtım ve ortak ifade gösteren optik tectum belirli. DAPı (mavi) çekirdekleri karşı koymak için kullanıldı. CP: Merkezi posterior talamik çekirdeği; Dd: dorsal; DC: Merkezi; DL: lateral; DM: medial; DP: dorsal telencephalon posterior parçası; HD: periventriküler hipotalamus dorsal bölge; HV: periventriküler hipotalamus ventral bölge; LH: hipotalamus lateral parçası; PGl: lateral ve PGm: medial preglomerüler çekirdekler; PGZ: optik tektumun periventriküler gri bölgesi; TeO: optik tectum; TL: torus longitudinalis; Vd: ventral telencephalon dorsal parçası. Ölçek çubuğu: 50 μm (A, A1, c, c1); 250 μm (B ve B1); 25 μm (D). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: zebra balığı ve Mouse hipokampus 'un yetişkin beyninde Ox-2R ve CB1R protein ifadesi ve özgüllük. (A) Bağıl peptit ile ön EMILIMI ile Ox-2R negatif kontrol. (B) Bağıl peptit ile Pre-EMILIMI tarafından CB1R negatif kontrol. (C) fare Hippocampus Ox-2R/CB1R pozitif kontrol. PGZ: optik tektumun periventriküler gri bölgesi; Optik tectum. Ölçek çubuğu: 100 μm (A, B); 250 μm (C). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Ox-a (yeşil) ve CB1R (kırmızı) ve onların Co-lokalizasyonu Ox-a/CB1R (sarı) ile birlikte ıNDıO vs kontrol diyet yetişkin zebrafish hipotalamik koronal bölümlerde dağılımı. (A) yan hipotalamus içinde Ox-a/CB1R Co-ifade gösteren kontrol diyet zebra balığı (a1) yüksek büyütme hipotalamus içinde Ox-a/CB1R Co-ifade. Ox-a/CB1R veya Co-yerelleştirme ve aynı hücrelerde Ox-a/CB1R örtüşme bir sözde bitişik lokalizasyonu gösteren öküz-a/CB1R Co-ifade detay. (B) Ox-a/CB1R Co-ıfıo zebra balığı hipotalamus (b1) yüksek büyütme lateral hipotalamus içinde artan Ox-a/CB1R Co-ifade gösteren. Ox-a/CB1R veya Co-yerelleştirme ve aynı hücrelerde Ox-a/CB1R örtüşme bir sözde bitişik lokalizasyonu gösteren öküz-a/CB1R Co-ifade detay. LH: hipotalamus lateral parçası. Ölçek çubuğu: 50 μm (A, B); 25 μm (A1, B1). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Numune hazırlama

Örnek hazırlama, ıHC 'deki ilk kritik adımdır. Güvenilir bir protokol hücre morfoloji, doku mimarisi ve antigenicity bakımı için izin verir. Bu adım, doğru doku toplama, sabitleme ve bölüm22,23gerektirir. Sabitleme amacı doku korumak ve doku enzimleri veya mikroorganizmaların eylem azaltmak etmektir. Özellikle, sabitleme adım hücresel bileşenleri ve biomolecules korur, otoliz önler ve hücre bileşenlerinin kayması (örneğin, antijenler ve enzimler), aşağıdaki prosedürlerin anlamlı etkilere karşı hücresel malzemeleri stabilize, ve immunostizing kolaylaştırır4,7,24.

Sekülmeden önce, doku, parafin katıştırma (immünoperoksidaz yöntemi) veya ağaşlama (cryomedia 'da donma, multipl immünofluorescence yöntemlerde) ile hazırlanır ve korunur. Koruma yöntemi, sabitleme türü ile ilişkilidir7. Fiktasyon ve koruma sonra, dokuları bir Mikrotom tarafından parafin gömülü ise, ya da bir kriyostat tarafından bir cryomedia gömülür dilimlenir. Dokular genellikle 8-10 μm kalınlık aralığında dilimlenir ve slaytlar üzerine monte edilir. İmmünoperoksidaz boyama için, örnek deparafinizasyonda ve antijen retrieveal25,26dahil olmak üzere antikor bağlayıcı için epitelların maskesini çıkarmak için ek adımlar gerektirebilir. Overfixation epitopu maskeleme neden olabilir akılda tutulması gereken, underfixation ağır kenar boyama ile olumlu sinyal az neden olabilir iken.

Engelleme ve arka plan azaltma

İmmünoperoksidaz yönteminde, biotin için avidin yüksek benzeşme büyük olasılıkla arka plan boyama hızlı üretim sorumludur. Ayrıca, avidin-biotin reaksiyonu geri dönüşümsüz olduğundan, arka plan18,27kaldırılamaz. IHC sırasında, yüksek arka plan da endojen doku biotines için nonspesifik bağlayıcı tarafından üretilebilmektedir. Hidrofobik ve iyonik etkileşimler (örneğin kollajen ve epitelyum ve adipanosit gibi diğer bağ dokularının ürettiği gibi), endojen enzim aktivitesinin yanı sıra arka plan boyama önemli nedenleridir. Endoskopik biotin veya enzimler ve hidrofobik bağlama, antikor lekeleymeden önce minimize edilmelidir, bu da Triton X-100 gibi bir deterjanın eklenmesi ile engelleme tamponunda28olarak elde edilebilir.

Engelleme tamponlarında% 0.3-0,4% Triton X-100 kullanımı ayrıca antikorların doku bölümlerine tam olarak geçirilmesi için de izin verir. Ayrıca, antikorlar bir epitope için tercihen özel olmasına rağmen, nonspesifik proteinlerde sitelere kısmi bağlama mümkün, yüksek arka plan boyama29yol. Nonspesifik bağlamaları hedef antijen30sinyalini maskeleyebilir. Nonspesifik arka plan boyama azaltmak için, numuneler nonspesifik reaktif siteleri engelleyen bir tampon ile inkübe edilmelidir. Ortak engelleme tamponları normal serum veya sığır serum albümin30içerir. Engelleme serum türleri ikincil antikor ana bilgisayar ile aynı olmalıdır. En iyi inkübasyon süresini belirlemek için tavsiye edilir. Engelleyici tamponda normal serumun konsantrasyonunun başka bir önemli belirlenmesi31' dir. Ayrıca, arka plan boyama ortadan kaldırmak için, birincil ve ikincil antikorların optimum seyreltme kullanmak için çok önemlidir. Böylece inkübasyon süresi, sıcaklığa ek olarak dikkatli bir şekilde seçilmelidir (örn. 4 °C ' de performans gösteriyorsanız, RT 'de ise süreyi azaltın) ve algılama sistemi.

Antikor seçimi

IHC boyama için antikorların seçimi önemlidir ve32deneysel sonucu etkileyebilir. Antikor uygun şekilde cevap vereceğini sağlamak için, onun tarafından tanınan epitopu dikkate alınmalıdır. Hedef protein ve fonksiyon, doku ve hücre altı lokalizasyonu ve bunun sonrası translasyonel değişikliklerden ibaret olup olmadığını anlamak antikor seçimini belirlemeye yardımcı olabilir. Başka bir önemli adım, belirli bir sinyal ile uyumlu minimum düzeyde arka plan ve aspecificity tutmak için birincil/ikincil antikor farklı konsantrasyonlarda test etmektir. Dahası, birincil ve ikincil antikor uyumluluğunu onaylamak için türlerin reaktivitesini kontrol etmek ve primer antikor yeteneğini doğal konformasyondaki antijen hedefini tanımak önemlidir. Primer antikor seçimi için bir diğer önemli adım gen hizalama. Bu, primer antikor ilgi biyomolekül ile tepki verir ve hangi epitopu belirli bir hayvan modelinde antikor tarafından tanınan bilgi sağlar sağlar. Gen hizalama da evrimsel koruyucu olan epitoplar tanıma yeteneğine antikorlar seçme imkanı sağlar.

Denetim

Antikorların özgüllüğünü açıklığa kavuşturmak için, önemli bir yönü kontroller, belirli boyama tespiti sağlayan performansıdır. Kontroller şunlardır: i) pozitif bir kontrol olarak antijen ifade bilinen bir doku; ii) antijen negatif kontrol olarak ifade etmek için bilinen bir doku; III) ikincil antikor diğer doku bileşenleri ile crossreaksiyona olmadığını onaylamak için belirli bir peptid ile primer antikor veya emilimi birincil antikor ihmal,33.

IHC tekniklerinde, son boyama elde etmeden önce birkaç adım sorunlara neden olabilir. Güçlü arka plan boyama ve nonspesifik hedef antijen boyama endojen biotin veya primer/ikincil antikor çapraz reaktivite ve yoksul enzim aktivitesi veya primer antikor potens, sırasıyla neden olabilir. Primer antikor ile kuluçlanmadan önce endojen enzimleri engelleyerek arka planda boyama ve nonspesifik bağlama önlenebilir. Normal serum kullanarak nonspesifik etkileşimleri engellemek için en iyi yoldur30. Engelleme arabelleğinin seçimi, kullanılan algılama yöntemine bağlıdır. Dahası, negatif kontrol olarak hedef antijen ifadesi eksikliği bilinen bir doku arka plan boyama34miktarını belirlemek için referans olarak hareket edebilir. Negatif kontrolde kromojenik veya floresan sinyalinin birikmesi, spesifik olmayan lekanın varlığını doğrular. Ayrıca, yetersiz engelleme zaman engelleme yüksek bir arka planda yol açar, aşırı engelleme düşük sinyal35yol açar.

İmmünoperoksidaz boyama, dokuda endojen peroksidaz varlığı kahverengi arka plan birikimi başka bir nedenidir. H2O2 ile tedavi önce primer antikor blokları ile inkübasyon endojen peroksidaz36,37. Aksine, immünofluoresesasyon içinde, rejenasyonu otomatik luoresesans nesil önemli bir rol oynar. Otomatik osilasyon önlemek için, en iyi sabitleme yöntemi, sabitleme zamanı, ve dokuların hazırlanması dikkatle seçilmesi gerekir. IHC başka bir kritik adım birincil antikor doğrulama. Bir antikor belirli bir doku veya hücre/subcellular bileşenlerde tutarlı ve spesifik bir boyama deseni üretir ve belirli bir peptid ile birincil antikor ön emilimi boyama38vermezse geçerli kabul edilir. İmmunofluorescence içinde, spesifik olmayan bağlayıcı üç renk floresan dedektörleri altında benzer floresan yoğunluğu gösterir, farklı floresan konjunal ikincil antikorlar kullanılan bu yana sinyal değişken iken. IHC doku hazırlama ve antikor boyama bu yönleri boyama sorunları aşmak için ele alınmalıdır.

IHC, nispeten basit bir teknik olsa da, bazı sınırlamalar sunar ve39birçok faktörlere bağlıdır. Önemli noktalardan biri, post-çeviri değiştirilmiş proteinlerin ifadesini değiştirebilen formalin fikitasyonu. Öte yandan, formalin-sabit parafin-gömülü dokularda uzun süreli oda sıcaklığında depolanabilir, ancak dondurulmuş dokular sadece bir yıla kadar-80 °C ' de depolanabilir. Dahası, dondurulmuş dokular IHC boyama40,41değiştiren hücre altı ayrıntıları etkileyebilir buz kristalleri, oluşumu ile zarar görebilir. Çalışmalarımız ile ilgili olarak, en zor yönü zebra balığı moleküllerine karşı spesifik primer antikorlar bulmaktır. Zebra balığı son derece sağlam bir yapıya sahip geçerli bir hayvan modeli olarak tanınmasına rağmen, zebra balığı 'teki spesifik proteinleri ve diğer molekülleri tanıyabilir çok az antikorlar geliştirilmiştir. Bu sınırlamalar aşmak için, Batı Blot Analizi ve gen hizalama tarafından antikor özgüllüğü doğrulamak önemlidir.

IHC metotları artan ilgi araştırma araştırmaları42yardımcı olabilir son derece spesifik immünostatatif gelişimine yol açmıştır. IHC, belirli moleküler belirteçlerin varlığını ve farklı patolojiler üzerindeki değişikliklerini belirlemek için artan frekans ile kullanılmaktadır. Burada gösterilen iki yaklaşım, immünoperoksidaz ve immünofluoresesans, ilgili avantajları ve dezavantajları43var. İmmünoperoksidaz tekniğinde kullanılan parafin-gömülü doku, hücrelerin ve dokuların yüksek çözünürlüğüne izin verebilir ve hedef proteinlerin dağılımı ve miktarı44,45ile ilgili detayları ortaya çıkarabilir. Ancak, parafin-gömülü dokularda immünofluorescence için uygun değildir, çünkü panoninin antigenisite maskesi ve nonspesifik floresan46yol açabilir. Öte yandan, PFA-sabit dokusunun kriyokesit endojen antigenisite korur ve nonspesifik floresans bir azalma yol. Kriyobölümlerin teknik kalitesi parafin-gömülü dokudan çok daha düşüktür olsa bile,47IFC tekniği ile geçerli sonuçlar verebilir.

Ayrıca, parafin gömme daha iyi morfolojik ayrıntıları korur iken, ağoprezervasyon daha iyi enzim ve antijen ifadesi korur, daha ayrıntılı immünostatik yol. İmmünofluoresesans tekniği aynı zamanda iki veya üç farklı biomolaktülerin çağdaş olarak algılanmasını sağlar, oreksin ve endokannabinoid sistemleri için önceki çalışmalarımız olarak gösterildiği gibi olası etkileşimleri ortaya çıkarır10. Belirli biyolakküllerin dağıtımını ve düzeylerini algılamak için kullanılan teknikler arasında, ıHC sadece spesifik morfolojik ifade ve moleküllerin ve proteinlerinin dağılımının belirlenmesi değil, aynı zamanda niceliksel Analysis.

İmmünofluoresesans kullanarak, biyomoleküllerin kodağıtım ve koifadesinin yanı sıra, olası etkileşimler ve farklı patolojiler48durumlarda değişiklikleri de anlaşılabilir. Son 20 yıl boyunca Konfokal mikroskopisi, genellikle memelinin beynindeki sayısız proteinlerin hücresel ve hücre içi dağılımını incelemek için kullanılmıştır. Floresan Mikroskobu da, proteinlerin, organelleri ve diğer biyolojik madde gibi belirli ilgi yapılarının görselleştirilmesini (fluorophores veya floresan boyalar kullanarak) sağlar; Bu sinyaller, hem sabit hem de yaşayan biyolojik sistemlerde görüntü spesifik hücre içi yapıları49için kullanılabilir. Belirli hücre bölmeleri içinde biyomoleküllerin potansiyel modüle işlevi kendi ifade desenleri görselleştirme yoluyla keşfedilebilir, doku içinde protein sinyalizasyon rolü ise nöroanatomik dağılımı ile ortaya çıkabilir metabolik enzim ifadesi veya reseptörleri.

Sunulan teknik çalışmalar, Yetişkin bir zebra balığı modelinde iki yüksek düzeyde tutulmuş sistem, oreksin ve Endokanabinoid eğitimi için ihc yaklaşımlarını, esas olarak immünofluoresesans sunar. Özellikle, spesifik proteinlerin hedef dokularda dağılımı, bağıl miktarı ve anatomik etkileşimlerini belirlemek için immünofluoresesans yöntemler kullanılabilir. PFA-sabit dokuların ağçıklama hızlı bozulma duyarlı yüksek hassasiyetli proteinleri korur. Dahası, ağoprezervasyon daha iyi antijen ve antigenicity korumak için düşünülmektedir, ve post-çeviri modifiye protein ve DNA eğitimi için izin verir.

Dondurulmuş dokular (Parafin-gömülü bölümlere kıyasla) daha kalın olsa bile, doku morfolojisi ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeteneği engeller, Konfokal mikroskopi büyük ayrıntı örnek görselleştirme için izin verir ve görüntüleme yetenekleri geliştirir. Dahası, immünofluoresesans, boyama yoğunluğunun nicel analizi için kullanılabilir ve sinyalin densitometrik Analizi nicel veriler sağlar. Bu, ortak lokalizasyon alanlarına bakarak fluorochrom sinyal düzeylerinin protein ifade düzeyleriyle korelasyonlarını belirlemenizi sağlar. Bu çalışmada, Yetişkin zebrafisinde önemli proteinlerin evrimsel olarak korunması için kullanılabilecek protokoller açıklanmaktadır ve gösterilmektedir. IHC kullanımı, özellikle immünofluorescence, Yetişkin zebra balığı içinde morfolojik ifade ve yüksek oranda saklama biomolecules dağıtımı okuyan bu hayvan modelinin kullanışlılığı vurgulamak yardımcı olabilir, yanı sıra genelinde olası değişiklikler ortaya insan fizyopatolojisi ile ilişkili farklı patolojik koşullar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Acknowledgments

Bu çalışmada Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Sannio Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Biyokimya Sayı 148 immünhistokimya immünoperoksidaz oreksin reseptörü endokannabinoid reseptör zebra balığı beyin zebra balığı bağırsak
Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter