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Biochemistry

वयस्क ज़ेब्राफ़िश में Orexin और Endocannabinoid रिसेप्टर्स की पहचान इम्यूनोपर्क्सीडेज और इम्यूनोफ्लोरेसींस तरीकों का उपयोग

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

यहाँ प्रस्तुत इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विशेषता और orexin पेप्टाइड के स्थानीयकरण के लिए प्रोटोकॉल हैं, orexin रिसेप्टर्स, और आंत और सामान्य और आहार प्रेरित मोटापे के दिमाग में endocannabinoid रिसेप्टर्स (DIO) वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल का उपयोग कर इम्यूनोपेरिक्सीडास और डबल इम्यूनोफ्लोरेसीन तरीके।

Abstract

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एक अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट तकनीक है जो लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ ऊतक वर्गों में लक्ष्य प्रतिजनों का पता लगाने में शामिल है। यह एक बहुचरणी प्रक्रिया है जिसमें इष्टतम विशिष्ट संकेत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चरण का अनुकूलन महत्वपूर्ण होता है। आईएचसी के माध्यम से, विशिष्ट बायोमार्कर के वितरण और स्थानीयकरण का पता लगाया जा सकता है, विकासवादी संरक्षण के बारे में जानकारी का खुलासा किया जा सकता है। इसके अलावा, IHC अभिव्यक्ति और रोग की स्थिति में biomarkers के वितरण परिवर्तन की समझ के लिए अनुमति देता है, जैसे मोटापा. IHC, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक, संगठन और phylogenetically संरक्षित अणुओं के वितरण का पता लगाने के लिए वयस्क ज़ेब्राफ़िश में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक मानक IHC प्रोटोकॉल estasblished नहीं है. Orexin और endocannabinoid दो अत्यधिक संरक्षित प्रणाली भोजन का सेवन और मोटापे की विकृति के नियंत्रण में शामिल हैं. यहाँ रिपोर्ट प्रोटोकॉल orexin पेप्टाइड के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (OXA), orexin रिसेप्टर (OX-2R), और कैनाबिनोइड रिसेप्टर (CB1R) स्थानीयकरण और सामान्य और आहार प्रेरित मोटापे से ग्रस्त के मस्तिष्क में स्थानीय और वितरण (DIO) वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल. इसके अलावा इम्यूनोपर्क्सिडिडेज और डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तरीके बताए गए हैं, साथ ही अभिकर्मकों की तैयारी, स्थिरीकरण, पैराफिट-एम्बेडिंग, और जेब्राफ़िश ऊतक के क्रायोप्रोटेंस और एक अंतर्जात गतिविधि-ब्लॉकिंग चरण और पृष्ठभूमि के लिए तैयारी प्रतिस्ने का। मापदंडों का पूरा सेट पिछले IHC प्रयोगों से प्राप्त किया जाता है, जिसके माध्यम से हमने दिखाया है कि कैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस OXs, OX-2R, और CB1R वितरण, स्थानीयकरण, और वयस्क ज़ेब्राफ़िश में अभिव्यक्ति के संरक्षण की समझ के साथ मदद कर सकता है ऊतकों. अत्यधिक विशिष्ट संकेत तीव्रता के साथ जिसके परिणामस्वरूप छवियों पुष्टि करने के लिए नेतृत्व किया है कि ज़ेब्राफ़िश वितरण के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त पशु मॉडल हैं, स्थानीयकरण, और में विशिष्ट biomarkers के विकास संरक्षण शारीरिक और रोग की स्थिति. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफ़िश में IHC प्रयोगों के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

Introduction

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एक अच्छी तरह से स्थापित क्लासिक तकनीक है जिसका उपयोग एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन1,2द्वारा सेलुलर या ऊतक घटकों (एंटीजन) की पहचान करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग ऊतक के भीतर लक्षित जैव अणुओं के स्थानीयकरण और वितरण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। आईएचसी ऊतक अनुभाग3में एंटीजन का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजिकल और रासायनिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करता है . एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के दृश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य मार्कर में फ्लोरोसेंट रंग (इम्युनोफ्लोरेसेंस) और एंजाइम-सब्सट्रेट रंग प्रतिक्रियाएं (इम्युनोपेरॉक्सिडेस) शामिल हैं, दोनों एंटीबॉडी के लिए संयुग्मी4. सूक्ष्म अवलोकन का उपयोग लेबल ऊतक के स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए संभव है, जो लगभग ऊतक में लक्ष्य प्रतिजन के स्थानीयकरण से मेल खाती है.

प्रोटीन का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट या क्रोमोजेनिक प्रतिक्रियाओं के लिए दो विधियां मौजूद हैं: प्रत्यक्ष पता लगाने की विधि, जिसमें विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को सीधे लेबल किया जाता है; और अप्रत्यक्ष पहचान विधि , जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी अयुग्मित है जबकि द्वितीयक एंटीबॉडी में लेबल5,6,7होता है . अप्रत्यक्ष विधि कुछ लाभ है, जो मुख्य रूप से अपने संकेत प्रवर्धन है. इसके अलावा, अन्य आणविक और सेलुलर तकनीकों के विपरीत, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ, कोशिकाओं और ऊतकों के भीतरव्यक्त किए गए दो या दो से अधिक प्रोटीनों के वितरण, स्थानीयकरण, और सह-अभिव्यक्ति की कल्पना करना संभव है। उपयोग की गई डिटेक्शन विधि का चुनाव प्रयोगात्मक विवरण पर निर्भर करता है।

तारीख करने के लिए, IHC व्यापक रूप से biomarkers के वितरण और स्थानीयकरण और मानव से अकशेरुकी8करने के लिए जैविक ऊतक में विभिन्न प्रोटीन की सामान्य रूपरेखा को समझने के लिए एक शक्तिशाली और आवश्यक उपकरण के रूप में बुनियादी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, 9 , 10 , 11.इस तकनीक से बड़ी संख्या में सामान्य और परिवर्तित पशु अंगों और विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मानचित्र प्रदर्शित करने में मदद मिलती है, जो शारीरिक और रोग संबंधी परिवर्तनों से प्रेरित अभिव्यक्ति का संभावित डाउन या अप-विनियमन दर्शाता है। IHC एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है कि सटीकता और इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए तरीकों का सही विकल्प की आवश्यकताहै 12. सबसे पहले, इस तरह के निर्धारण के रूप में कई अलग अलग कारकों, पार प्रतिक्रिया, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, और एंटीबॉडी की संवेदनशीलता झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं13. एंटीबॉडी का चयन आईएचसी में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है और यह जांच के तहत प्रोटीन और प्रजातियों के प्रति प्रति प्रतिजन विशिष्टता और इसकी समानता पर निर्भर करताहै.

हाल ही में, हमने वयस्क जेब्राफ़िश ऊतक में orexin/hypocretin और endocannabinoid सिस्टम के सदस्यों का पता लगाने के लिए आईएचसी तकनीक को अनुकूलित किया है। हम निर्धारण पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है, ऊतक दो अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर embedding, अनुभागऔर बढ़ते (जो सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान संकल्प और विस्तार को प्रभावित कर सकते हैं), और अवरुद्ध (गलत सकारात्मक को रोकने और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए)14. अन्य महत्वपूर्ण विशेषताओं एंटीबॉडी विशिष्टता और चयनात्मकता और व्यक्तिगत IHC प्रोटोकॉल की पुन: उत्पादनक्षमता हैं. एंटीबॉडी विशिष्टता प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग है (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी या ऊतक है कि लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त नहीं करने के लिए जाना जाता है सहित) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक नियंत्रण (ऊतक है कि लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है सहित)15 . IHC के लिए एंटीबॉडी का चयन उनकी प्रजातियों-विशिष्टता के आधार पर किया जाता है (संभावना है जिसके साथ वे ब्याज के प्रतिजन के साथ प्रतिक्रिया) और एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी पहचान प्रणाली है कि4,5,6 प्रयोग किया जाता है ,7. इम्यूनोपर्ऑक्सिडेस के मामले में, प्रतिक्रिया का रंग वेग से पैदा क्रोमोजेन के चयन द्वारा निर्धारित किया जाता है, आमतौर पर डाइऐमिनोबेन्जिडीन (भूरे रंग)16। दूसरी ओर, मैंmmunofluorence जमे हुए ऊतक वर्गों में प्रोटीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मी एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है और क्रोमोजेनिक पता लगाने प्रणाली के संबंध में कई प्रोटीन के आसान विश्लेषण के लिए अनुमति देता है 5 , 7.

इम्यूनोपर्क्सिडास तकनीक में, माध्यमिक एंटीबॉडी बायोटिन के लिए संयुग्मी है, एक linker अणु एक क्रोमोजेनिक रिपोर्टर अणु की भर्ती करने में सक्षम [avidin-बायोटिन जटिल (एबीसी)], धुंधला संकेत के प्रवर्धन के लिए अग्रणी. एबीसी रिपोर्टर विधि के साथ, एंजाइम peroxidase 3,3'-diaminobenzidine (DAB) के साथ प्रतिक्रिया करता है, एक तीव्रता से भूरे रंग का दाग जहां एंजाइम माध्यमिक एंटीबॉडी को बांधता है, जो तब एक साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण किया जा सकता उत्पादन. एबीसी धुंधला, biotin के लिए avidin की उच्च आत्मीयता के कारण, एक तेजी से और इष्टतम प्रतिक्रिया पैदा करता है, कुछ माध्यमिक प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की साइट से जुड़ी एंटीबॉडी के साथ. इस क्रोमोजेनिक का पता लगाने विधि संकेत के densitometric विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के साथ भूरे रंग के संकेत के स्तर के सहसंबंध के आधार पर अर्द्ध मात्रात्मक डेटा प्रदान18.

इम्यूनोफ्लोरेसींस तकनीकों के साथ, विभिन्न फ्लोरोक्रोम्स की अद्वितीय तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश का उत्सर्जन करने की क्षमता के कारण एक साथ कई प्रोटीन का पता लगाना संभव है, लेकिन वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए ध्यान से फ्लोरोक्रोम्स का चयन करना महत्वपूर्ण है 5. इसके अलावा, विभिन्न मेजबान प्रजातियों में प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग क्रॉस-प्रतिक्रिया से संबंधित कठिनाइयों को कम करता है। इस मामले में, प्रत्येक प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी केवल एक प्रकार के प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानता है। फ्लोरोसेंट पत्रकारों ऐसे एलेक्सा फ्लोर रंगों के रूप में वाणिज्यिक डेरिवेटिव, सहित छोटे कार्बनिक अणु हैं।

कई पशु मॉडल विशेष शारीरिक और रोग की स्थिति को समझने के लिए उपयोग किया जाता है। आज तक, यह स्थापित किया गया है कि कई चयापचय रास्ते विकास के दौरान संरक्षित कर रहे हैं. इसलिए, आईएचसी अध्ययन जैसे जेब्राफ़िश जैसे मॉडल जीवों में रोग विज्ञान औरगैर-रोगकी स्थितियों की उत्पत्ति और रखरखाव के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। यह IHC प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऊतक पर किया जा सकता है और वितरण और OXA, OX-2R, और परिधीय और केंद्रीय स्तर पर CB1R के स्थानीयकरण की विस्तृत छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल वर्णन करने के लिए इस रिपोर्ट का एक उद्देश्य है. इसके अलावा रिपोर्ट वयस्क ज़ेब्राफ़िश के परिधीय और केंद्रीय ऊतकों में दो प्रमुख IHC अप्रत्यक्ष तरीकों के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल हैं. वर्णित अप्रत्यक्ष विधि है, जो उन मामलों में संकेत प्रवर्धन की अनुमति देता है जहां एक द्वितीयक एंटीबॉडी एक फ्लोरोसेंट डाई (प्रतिरक्षा रोग विधि) या एंजाइम रिपोर्टर (इम्युनोपर्ऑक्सिडेस विधि) के लिए संयुग्मी है। दोनों क्रोमोजेनिक और फ्लोरोसेंट का पता लगाने के तरीकों के फायदे और नुकसान के अधिकारी. इस प्रोटोकॉल में रिपोर्ट IHC का उपयोग है, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस, वयस्क ज़ेब्राफ़िश में, एक पशु मॉडल व्यापक रूप से सिस्टम है कि विकासवादी विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों में संरक्षित कर रहे हैं अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया.

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Protocol

1. इम्युनोपेरॉक्सिडस प्रोटोकॉल

नोट: जेब्राफ़िश प्रो Omid सफारी (मछली पालन विभाग, प्राकृतिक संसाधन और पर्यावरण के संकाय, Mashhad, Mashhad, ईरान के Ferdowsi विश्वविद्यालय)10द्वारा प्राप्त किए गए थे.

  1. ऊतक विच्छेदन
    1. बर्फ के पानी में पनडुब्बी द्वारा ज़ेब्राफ़िश बलिदान (5 भागों बर्फ / उन्हें सभी आंदोलन की समाप्ति तक छोड़ लो hypoxia द्वारा मौत सुनिश्चित करने के लिए.
    2. जल्दी से निम्नलिखित विच्छेदन विधि के साथ आंत और मस्तिष्क को दूर:
      1. एक कागज तौलिया पर मछली सूखी और यह एक विच्छेदन चटाई पर sagittally जगह है, आंख सॉकेट और पूंछ के मांसल भाग के अधर भाग अवरुद्ध.
      2. आंत के लिए: त्वचा में कटौती और ध्यान से मछली की ओर से त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों को हटाने जब तक आंतरिक अंगों दिखाई दे रहे हैं. इसे बाहर खींच शरीर गुहा से आंत निकालें।
      3. मस्तिष्क के लिए: एक उस्तरा ब्लेड के साथ सिर को हटा दें। संदंश के साथ खोपड़ी के अधर पक्ष से नरम ऊतक निकालें। खोपड़ी खोलें और मस्तिष्क के अधर पक्ष से हड्डी को हटा दें। मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष से त्वचा और खोपड़ी हड्डियों को निकालें। मस्तिष्क निकालें.
  2. ऊतक निर्धारण
    1. कमरे के तापमान (आरटी) में 3 एच के लिए फॉस्फेट बफर (पीबी, पीएच 7.4, 4 डिग्री सेल्सियस) में ताजा 4% पैराफॉर्मलडे (पीएफए) में विसर्जन द्वारा विच्छेदन ऊतकों को ठीक करें।
      1. नाह2पीओ4भ्2ओ के 1.755 ग्राम और 4.575 ग्राम ना2एचपीओ4 के 450 एमएल आसुत जल (डीएच2ओ) में घोलकर, और 7.4 के पीएच को नाह 1छ की आवश्यक राशि के साथ समायोजित करें।
      2. एक गर्मी की थाली पर आंदोलन द्वारा 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के 100 एमएल में 4 ग्राम पीएफए भंग 4% पीएफए की तैयारी करें। जब 60 डिग्री सेल्सियस का तापमान प्राप्त हो जाए, तो एक स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए NaOH 1N की 2-4 बूँदें जोड़ें। आरटी पर वाम पीएफए 4% और पीएच को नियंत्रित करते हैं। पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
        नोट: 4-6 से अधिक ज के लिए ऊतक निर्धारण ओवरफिक्सेशन का कारण बन सकता है, जो एंटीबॉडी-एपिटोप बाइंडिंग को सीमित करता है। निर्धारण का समय ऊतक के आकार पर निर्भर करता है।
  3. ऊतक एम्बेडिंग
    1. 0.1 एम पंजाब (पीएच 7.4) में विसर्जन द्वारा, प्रत्येक 5 मिनट के लिए ऊतकों कुल्ला 5x।
    2. शराब में बाद में विसर्जन द्वारा ऊतकों निर्जलीकरण 70% (6 मिनट), 80% (6 मिनट), 95% (5 मिनट), 95% (5 मिनट), 100% (1 मिनट), और 100% (1 मिनट).
    3. 100% शराब में विसर्जन द्वारा ऊतकों को स्पष्ट करें:xylene (1:1) 10 मिनट के लिए, फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene में 2x.
    4. पैराफिन मोम (56 डिग्री सेल्सियस) के साथ ऊतकों को दो बार 1 एच प्रत्येक के लिए पैराफिन में प्रत्यक्ष विसर्जन द्वारा घुसपैठ।
    5. कमरे के तापमान (आरटी) पर पैराफिन ब्लॉक में ऊतकों को एम्बेड करें और अनुभागिंग तक आरटी पर स्टोर करें।
  4. ऊतक काटने
    1. ऊतकों को एक माइक्रोटोम के साथ 8 डिग्री मीटर मोटाई के साथ कोरोनल या सैगिटल वर्गों में काटें, और पानी पर चिपकने वाले कांच की स्लाइडों पर वैकल्पिक श्रृंखला में वर्गों को इकट्ठा करें और 38 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों के साथ स्लाइड सूखी रात भर.
  5. ऊतक खंडों का अपाफ़िनीकरण और पुनर्जलीकरण
    1. 5 मिनट के लिए xylene में विसर्जन द्वारा वर्गों dewax और 3 मिनट के लिए xylene में विसर्जन के बाद.
    2. आगे की स्लाइड्स में विसर्जन के द्वारा वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें शराब 100% II (1 मिनट), 100% मैं (1 मिनट), 95% (1 मिनट), 75% (1 मिनट), 50% (1 मिनट), फिर dH2O (5 मिनट) में स्लाइड रखें।
      नोट: पूरी तरह से प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले वर्गों dewax. यदि अनुभागों में अभी भी पैराफिन के निशान हैं, तो 5 मिनट या उससे अधिक के लिए xylene में एक अतिरिक्त विसर्जन करें।
  6. एंटीजन पुनः प्राप्ति
    1. अधिक से अधिक शक्ति पर 5 मिनट के लिए समाधान में स्लाइड immersing और एक माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग द्वारा साइट्रेट बफर (0.01 एम, पीएच 6.0) के साथ वर्गों का इलाज।
    2. वर्गों शांत करते हैं.
    3. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति को पूरा करने के लिए अधिकतम शक्ति पर माइक्रोवेव में 5 मिनट के चक्र को दोहराएँ।
      1. साइट्रेट बफर (0.01 एम, पीएच 6.0) को डी एच 2 ओ के 100 एमएलमें 2.10 ग्राम और डीएच 2 के 200 एमएल में सोडियम साइट्रेट के 5.882 ग्राम को भंग करके 2 एच2ओ मिक्स सोडियम साइट्रेट (0.01 एम) को साइट्रिक एसिड (0.01 एम) के साथ 1:4 पी अनुपात में समायोजित किया गया है। 6 HCl 0.1N का उपयोग कर.
  7. अंतर्जात peroxidase अवरुद्ध
    1. एक विलायक प्रतिरोधी कलम के साथ स्लाइड पर ऊतक क्षेत्र का सीमांकन.
    2. वर्गों कुल्ला 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, tris-बफर नमकीन समाधान (टीबीएस) (0.1 एम, पीएच 7.3) के साथ।
      1. 0ण्1 म टीबीएस को भंग करके तैयार की जाए, जिसमें 12.1 ग्राम का ट्रिजमा बेस तथा 9 ह 2 घट2हे में नौक्ल का 9 ह तथा एचसीएल 0ण्1छ के साथ पी एच 7-3 को समायोजित करें।
    3. आरटी में 5 मिनट के लिए 0.75% एच2ओ2 के समाधान में स्लाइड विसर्जन द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि ब्लॉक।
      1. तैयार करें 0.75% एच2हे2 समाधान भंग 5 एमएल 30% H2O2 में 195 एमएल dH2O.
        नोट: ndogenous एंजाइमों IHC अभिकर्मकों के साथ प्रतिक्रिया और झूठी सकारात्मक परिणाम उपज कर सकते हैं. इसके अलावा, अत्यधिक संवहनी ऊतक कई अंतर्जात peroxidase व्यक्त करते हैं, जो तीव्र गैर-विशिष्ट धुंधला और पृष्ठभूमि स्तर का कारण बन सकता है। 0.75% एच2ओ2 क्वेन्च अंतर्जात peroxidase के साथ उपचार और काफी nonspecific पृष्ठभूमि कम कर देता है.
  8. गैर-विशिष्ट का अवरोध बिंदी एनजी साइटों और ऊतक permebilization
    1. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करने के लिए आरटी में 30 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीसेरम (एनआरएस) युक्त बफर को अवरुद्ध करने वाले टीबीएस/0.4% ट्राइटन (टीबीएस-टी) के साथ ऊतक वर्गों को इनक्यूबेट करें।
      1. टीबीएस के 100 एमएल में ट्राइटन एक्स-100 के 0.4 एमएल को भंग करके 0.4% ट्राइटन तैयार करें।
      2. 0.4% ट्राइटन एक्स-100 (सामान्य सीरम के 1 एमएल + 8.2 एमएल टीबीएस + 0.8 एमएल 0.48 Triton X-100) युक्त टीबीएस में 1% सामान्य सीरम भंग करके अवरुद्ध बफर टीबीएस-टी समाधान तैयार करें।
        नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान के आधार पर पशु सीरम की प्रजातियों का चयन करें (उदा., जब एक बकरी विरोधी rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर, सामान्य बकरी सीरम का उपयोग करें).
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक ऊष्मायन
    1. टीबीएस-टी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी में एक आर्द्र बॉक्स में रात भर वर्गों को इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों दाग:
      1. OX-2R के खिलाफ बकरी एंटीबॉडी पतला 1:200, जो प्रोटीन के सी-टर्मिनल पहचानता है.
      2. OX-A पतला 1:200 [orexin-A (C-19)] के खिलाफ बकरी एंटीबॉडी, जो प्रोटीन के सी-टर्मिनल को पहचानता है।
        नोट: सुनिश्चित करें कि प्राथमिक एंटीबॉडी ब्याज के जैव अणु के साथ प्रतिक्रिया करता है। परिभाषित करें कि जैव अणु के किस एपिटोप के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी जीन संरेखण का उपयोग करके प्रतिक्रिया करता है। उदाहरण के लिए, ओएक्स-ए ए ए ए ए को मानव ओएक्स-ए (O43612) के a50-100 के बीच मैप किया गया है जबकि OX-2R एपिटोप को मानव के सी-टर्मिनल में अंतिम 50 ए के पास मैप किया गया है।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक ऊष्मायन
    1. 0.1 एम टीबीएस (पीएच 7.3) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    2. बायोटिनलेट्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी और खरगोश एंटी-गोट इम्यूनोग्लोबुलिन (एच + एल) के साथ आरटी में 1.5 एच के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें, फिर टीबीएस-टी में 1:100 को पतला करें।
      नोट: टेस्ट और पृष्ठभूमि की कमी की अनुमति देता है कि इष्टतम कमजोर पड़ने खोजने के लिए दोनों प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न कमजोर पड़ने लगता है।
  11. पेरोक्सिडस अभिक्रिया
    1. 0.1 एम टीबीएस (पीएच 7.3) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    2. 1 एच के लिए avidin-बायोटिन जटिल (एबीसी) के साथ वर्गों इनक्यूबेट करें।
      1. टीबीएस के 5 एमएल में घटक बी की दो बूंदों के बाद घटक ए की दो बूंदों को जोड़ने एबीसी समाधान तैयार करें।
    3. 0.1 एम टीबीएस (पीएच 7.3) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    4. क्रोमोजेन सब्सट्रेट 3,3'-diaminobenzidine-4 (DAB) के साथ वर्गों का इलाज करें।
      1. DAB समाधान को जोड़ने के लिए तैयार करें DAB क्रोमोगेन की एक बूंद (लगभग 30 डिग्री सेल्सियस) को DAB diluent के 1 एमएल को ध्यान केंद्रित, और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण.
        नोट: उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट एबीसी समाधान तैयार करें और जटिल को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि स्थिर एविडिन/बायोटिन बाइंडिंग के लिए अनुमति न दें। ताजा DAB काम कर समाधान तैयार, ऊतक वर्गों के लिए लागू होते हैं, और रंग उपयुक्त है जब तक विकसित. जब क्रोमोजेनिक प्रतिक्रिया एपिटोप साइटों को भूरे रंग में परिवर्तित करती है और सिग्नल की तीव्रता इमेजिंग के लिए उपयुक्त होती है, तो अगले चरण पर जाएं। DAB विकास के समय कुछ सेकंड से 10 मिनट के लिए भिन्न हो सकते हैं. OX-A और OX-2R 1, 2 मिनट के लिए पर्याप्त है। देखभाल के साथ DAB संभाल, के रूप में यह कैंसरकारी है.
  12. ऊतक निर्जलीकरण और बढ़ते
    1. DAB प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 0.1 एम टीबीएस (पीएच 7.3) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए सभी वर्गों 3x कुल्ला।
    2. आगे की स्लाइड्स में शराब में विसर्जन द्वारा वर्गों निर्जलीकरण 50% (2 मिनट), 75% (2 मिनट), 95% (2 मिनट), 100% मैं (2 मिनट), 100% द्वितीय (2 मिनट).
    3. xylene 10 मिनट प्रत्येक में विसर्जन 2x द्वारा स्लाइस स्पष्ट करें.
    4. DPX (dibutyl phthalate xylene) हिस्टोलॉजी के लिए mountant के साथ वर्गों माउंट, स्लाइड करने के लिए बढ़ते मीडिया की दो बूँदें जोड़ने और coverslips के साथ धीरे धीरे टॉपिंग.
      नोट: निर्जलीकरण के दौरान शराब की सांद्रता बढ़ाने में ऊतक के विसर्जन के बाद से ऊतक के प्रवेश और शराब के साथ पानी के प्रतिस्थापन में परिणाम, एक सटीक निर्जलीकरण समय निर्धारित करते हैं और ऊतकों को निर्जलित नहीं करते हैं। ऊतक स्पष्ट और किसी भी अतिरिक्त या शेष शराब को दूर करने के लिए निर्जलीकरण के बाद xylene में विसर्जन प्रदर्शन करते हैं।
  13. नियंत्रण
    1. 1-1-12 खंडों को दोहराएँ, प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर और/या प्राथमिक एंटीबॉडी या द्वितीयक एंटीबॉडी आईजीजी को टीबीएस (ऋणात्मक नियंत्रण) द्वारा प्रतिस्थापित करना।
    2. दोहराएँ अनुभाग 1-1-12 सापेक्ष पेप्टाइड की अधिकता के साथ प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को पूर्व-अवशोषित करना (100 मिलीग्राम पेप्टाइड/1 एमएल पतला एंटीसेरम)।
    3. सकारात्मक नियंत्रण (उदा., माउस ऊतक) के रूप में विभिन्न ऊतकों का उपयोग करते हुए अनुभाग 1.1-1.12 दोहराएँ.
      नोट: शुरू करने से पहले शीघ्र ही, ताजा सभी बफ़र्स तैयार करें। ध्यान से वर्गों के आसपास एक पिपेट या फिल्टर कागज के साथ प्रत्येक कदम पर अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें, हमेशा वर्गों गीला रखते हुए.
  14. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
    1. लगातार प्रकाश रोशनी के तहत और एक ही आवर्धन पर एक डिजिटल कैमरे से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डिजिटल छवियों का अधिग्रहण.
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के धुंधला तीव्रता का एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें).
      1. OX-A या OX2-R सकारात्मकता के सूचकांकों का मूल्यांकन करने के लिए .lif या .tiff फ़ाइल स्वरूप में कैप्चर की गई छवियों को खोलें.
      2. उपाय के तहत बटन का चयन करें और मैनुअल Countiएनजीपर क्लिककरें। माउस पर क्लिक करके सकारात्मक कोशिकाओं पर एक निशान रखकर स्क्रीन से सीधे दाग सेल प्रोफाइल की संख्या की गणना करें।
      3. प्रतिरक्षा संकेत घनत्व (ऑप्टिकल घनत्व, ओडी) कीमात्रा निर्धारित करने के लिए ब्याज (आरओआई) क्षेत्र (3 x 103 डिग्री 2 ) के क्षेत्र का चयन करें।
      4. शून्य को पृष्ठभूमि के मान के रूप में असाइन करने के लिए विश्लेषित प्रतिबिंब (उच्च धनात्मक) और कम से कम तीव्रता (नकारात्मक) के साथ पिक्सेल निर्धारित करें (अर्थात, ऊतक का एक भाग जो दागी कोशिकाओं से रहित है)।
      5. अवशोषण के लघुगणकीय पैमाने पर काम करके ओडी का आकलन करें। डिजिटल छवि विश्लेषण में, DAB पिक्सेल तीव्रता सबसे हल्का (0 मान) से lightest (255 मान) छाया के लिए पर्वतमाला.
      6. OD निम्न में से एक हिस्टोग्राम plotting द्वारा निर्धारित करें: लॉग10(255/I), जहाँ "मैं" पिक्सेल तीव्रता मान प्रोग्राम द्वारा दिए गए और पृष्ठभूमि घटाकर निर्धारित है।
        नोट: स्थायी और स्थिर इम्यूनोपर्क्साइडस प्रतिक्रिया का किसी भी समय एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया जा सकता है। आसन्न वर्गों से एक ही सेल की डबल गिनती से बचने के लिए वैकल्पिक अनुभाग पर लेबल कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन.

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल

  1. ऊतक विच्छेदन
    1. बलिदान और धारा 1.1 में वर्णित के रूप में जानवरों को विभाजित।
  2. ऊतक निर्धारण
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में 3 एच के लिए विसर्जन द्वारा आंत और मस्तिष्क को ठीक करें।
      1. 1.2.1 खंड के रूप में पंजाब और 4% पीएफए तैयार करें।
        नोट: निर्धारण का समय ऊतक के आकार पर निर्भर करता है। 4-6 एच से अधिक के लिए ऊतक निर्धारण ओवरफिक्सेशन का कारण बन सकता है, जो एंटीजन को मास्क करता है और एंटीबॉडी-एपिटोप बाइंडिंग को सीमित करता है।
  3. ऊतक एम्बेडिंग
    1. ऊतकों कुल्ला 3x 5 मिनट प्रत्येक के लिए, 0.1 एम पंजाब (पीएच 7.4) के साथ.
    2. क्रायोप्रोटकेंस के लिए, ऊतकों को पंजाब (0.1 एम, पीएच 7.4) में 20% सुक्रोज में स्थानांतरित करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर, ऊतकों को 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में 30% सुक्रोज में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त रात के लिए रखें।
    3. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक के एक ब्लॉक में ऊतकों को एम्बेड करें। ऐसा करने के लिए, तरल नाइट्रोजन का एक छोटा सा देवर तैयार, एल्यूमीनियम पन्नी ले, और यह आधे में कटौती करने के लिए एक पैन बनाने के लिए. OCT यौगिक से भरा ऊतकों युक्त पैन तरल नाइट्रोजन में डूबा हुआ है जब तक OCT यौगिक ठंडा है. जमे हुए ऊतकों को अनुभागन तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. ऊतक काटने
    1. जमे हुए ऊतक ब्लॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टैट में स्थानांतरित करें और 10 डिग्री मी के कोरोनल या सैगिटल खंडों में काट दें।
    2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयुक्त चिपकने वाला कांच स्लाइड पर वैकल्पिक सीरियल वर्गों में ऊतकों को एकत्र करें और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर करें।
      नोट: एक अंधेरे स्लाइड बॉक्स या स्लाइड बुक में -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस के बीच स्लाइड स्टोर करें।
  5. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों और ऊतक permeibilizzation के अवरुद्ध
    1. विलायक प्रतिरोधी कलम के साथ स्लाइड पर ऊतक क्षेत्र का सीमांकन करें।
    2. 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    3. 1% सामान्य गधा सीरम permebilization बफर पंजाब-ट्रिटन एक्स-100 0.3% (पीबी-टी) में भंग के साथ वर्गों इनक्यूबेट सेल झिल्ली permeabilize और गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए।
      1. ट्राइटन एक्स-100 0.3% 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के 100 एमएल में ट्राइटन एक्स-100 के 0.3 एमएल को भंग करने की तैयारी करें।
      2. अवरुद्ध समाधान भंग 1% सामान्य गधा सीरम पंजाब में 0.3% TritonX-100 युक्त तैयार करें.
        नोट: permebilization और अवरुद्ध बफ़र्स में इस्तेमाल सीरम के पशु प्रजातियों माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान पर निर्भर हैं.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ इनक्यूबेशन
    1. 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
      1. पीबी-टी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ आरटी में एक आर्द्र बॉक्स में रात भर वर्गों को इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के निम्नलिखित घोला जा सकता है: OX-2R पतला 1:100/rabbit एंटीबॉडी के खिलाफ बकरी एंटीबॉडी CB1R पतला 1:100, या OX के खिलाफ बकरी एंटीबॉडी-एक पतला 1:100/
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ इनक्यूबेशन
    1. 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    2. 1 के साथ आरटी में 2 एच के लिए वर्गों इनक्यूबेट 1) गधा विरोधी Rabbit Alexa Fluor 488-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी और गधा विरोधी बकरी एलेक्सा Fluor 594-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:100 पंजाब-टी में का मिश्रण; या 2) गधा विरोधी बकरी एलेक्सा फ्लोर 488-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी और गधा विरोधी Rabbit Alexa Fluor 594-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:100 पंजाब-टी में का मिश्रण.
      नोट: एक ही जानवर मेजबान में विकसित माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें। सामान्य सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी की एक ही प्रजाति के होने चाहिए (उदा., गधा और एक गधा सामान्य सीरम में विकसित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें). सेल permebilization बढ़ाने के लिए और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए डिटर्जेंट युक्त बफर अवरुद्ध के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को विलेप करें।
  8. ऊतक बढ़ते
    1. 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के साथ, 5 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 3x कुल्ला।
    2. पंजाब के 3 एमएल में डीएपीआई (4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनो) के साथ वर्गों को भंग करने के लिए तैयार किया गया है।
    3. बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप स्लाइड (सामग्री की तालिकादेखें )। यह जलीय बढ़ते मध्यम ऊतक नमूना और लंबी अवधि के उपयोग के लिए दाग स्थिर. फ्लोरोसेंट नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है। फ्लोरोफोरके जीवन को लम्बा करने के लिए, एक एंटीफेड बढ़ते माध्यम का उपयोग करें।
      नोट: एक अच्छा बढ़ते माध्यम चुनें. बढ़ते एजेंटों के सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक अपवर्तक सूचकांक (एनडी) है, जो कांच का अपवर्तक सूचकांक लगभग 1.5 होना चाहिए। यहाँ इस्तेमाल बढ़ते माध्यम एंजाइम और लिपिड निर्धारण के लिए तैयार नमूना के साथ विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, नमूना है कि शराब की एक आरोही श्रृंखला के साथ निर्जलित नहीं किया जाना चाहिए).
  9. नियंत्रण
    1. दोहराएँ अनुभाग 2.1-2.8, प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी omitting, या विशिष्ट कदम में प्रतिस्थापन प्राथमिक या माध्यमिक antisera पंजाब के साथ (ऋणात्मक नियंत्रण).
    2. दोहराएँ अनुभाग 2.1-2.8, सापेक्ष पेप्टाइड की एक अतिरिक्त के साथ प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को अवशोषित पूर्व (100 पेप्टाइड की मिलीग्राम/
    3. माउस मस्तिष्क (सकारात्मक नियंत्रण) के स्लाइस पर अनुभाग 2-1-2.8 दोहराएँ.
      नोट: शुरू करने से पहले शीघ्र ही, ताजा सभी बफ़र्स तैयार करें। वर्गों के चारों ओर एक पिपेट या फिल्टर पेपर के साथ प्रत्येक चरण पर ध्यान से तरल पदार्थ की अतिरिक्त निकालें, हमेशा अनुभाग को आर्द्र रखते हुए।
  10. छवि अधिग्रहण
    1. एक x-y-z motorized चरण, डिजिटल कैमरा, और अधिग्रहण और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे एनआईएस-एलिमेंट्स सी का निरीक्षण और प्रतिरक्षाीकृत वर्गों का विश्लेषण करने के लिए के साथ सुसज्जित एक confocal माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें। 5-20-40x उद्देश्यों का उपयोग कर डिजिटल छवियों को प्राप्त करें।
    2. एक कम आवर्धन असेंबल रचना करने के लिए उपलब्ध चैनलों में से प्रत्येक में कम आवर्धन (10x या 20x उद्देश्य) पर प्रत्येक अनुभाग की छवियों को ले लो, पूरे क्षेत्र के एक सिंहावलोकन प्रदान करने के लिए स्थानीयकरण और OX-2R/ शारीरिक सह-अभिव्यक्ति। विश्लेषण से पहले अधिकतम इसके विपरीत और ओवरले करने के लिए फ्लोरोसेंट छवियों को सामान्य।
    3. ब्याज के क्षेत्र भर में छवियों के धारावाहिक जेड-स्टैक ले लीजिए। ऊतक की मात्रा को कवर करने के लिए 1-1.8 डिग्री उ के फोकल चरणों के साथ छह फोकल विमानों (जेड-चरण) के माध्यम से छवियों को प्राप्त करें जिसमें ओएक्स-2R/CB1R कोअभिव्यक्ति को पीले पाण्डक के रूप में देखा जाता है। प्रत्येक चैनल के लिए इस संग्रह करने के लिए (लाल, हरे, नीले) अलग से, एक $ मोटरीकृत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके.
    4. दस पुनरावृत्तियों के आवेदन द्वारा छवियों को deconvolve करने के लिए एक इमेजिंग deconvolution सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें और एक एकल अधिकतम प्रक्षेपण छवि में धारावाहिक विमानों छवियों पतन.
    5. एडोब फोटोशॉप 6.01 (एडोब सिस्टम्स, सैन जोस, सीए) का उपयोग करप्रकाश और इसके विपरीत के लिए माइक्रोग्राफ समायोजित करें।
      नोट: आगे पृष्ठभूमि को कम करने के लिए अवलोकन के दौरान deconvolution कदम प्रदर्शन करते हैं। photobleaching को रोकने के लिए प्रकाश के लिए स्लाइड जोखिम सीमित करें।
  11. छवि विश्लेषण
    1. प्रत्येक जानवर के हित के सभी क्षेत्र को कवर करके ऑक्स-2R/CB1R कोअभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण वैकल्पिक 10 डिग्री मीटर मोटी वर्गों (द र् 5 पशु प्रति समूह) पर निष्पादित करें।
    2. छवि विश्लेषण के एक semiautomated प्रणाली के साथ पीले सकारात्मक puncta की संख्या के रूप में OX-2R/CB1R coexpression की मात्रा निर्धारित करें। Imagins सॉफ्टवेयर विस्तार के एक उच्च स्तर प्रदान कर सकते हैं, विभिन्न फ्लोरोसेंट जांच के बीच ओवरलैप के क्षेत्रों के बारे में मात्रात्मक डेटा के साथ.
    3. दो चैनलों में संकेत तीव्रता के लिए दहलीज उपकरणों का उपयोग करके puncta मात्रा. .liff, .tiff, या .pg छवियाँ फ़ाइल खोलें और छवि-थ्रेशहोल्डका चयन करें. ऑटो सेटिंग या मैनुअल विधि का चयन करें और सभी दाग puncta चयनित कर रहे हैं जब तक थ्रेसहोल्ड को विनियमित. पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड प्राप्त करने के लिए कोई इम्यूनोलेबल ऑब्जेक्ट नहीं है जो छवि के किसी क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता के वितरण का विश्लेषण करें। इस पृष्ठभूमि को प्रत्येक छवि के लिए अलग-अलग निर्धारित करें. प्रोग्राम तब पृष्ठभूमि मान के लिए पिक्सेल तीव्रता की आधार रेखा सेट करपृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड निकालता है।
    4. विश्लेषण का चयन करें-माप और मापा जा करने के लिए मानकों का चयन (पंचक तीव्रता न्यूनतम, अधिकतम और मतलब मूल्यों; संख्या /
    5. प्रत्येक अनुभाग के लिए 4 --स्टैक में ऊतक की मात्रा के साथ पीले समय की गणना, सबसे अच्छा ध्यान विमान के लिए तुरंत ऊपर या नीचे ढेर का उपयोग कर. विश्लेषण से आउट-की-फोकस क्षेत्रों को शामिल न करें।
      नोट: आसन्न वर्गों से एक ही कोशिकाओं की डबल गिनती से बचने के लिए वैकल्पिक अनुभाग पर लेबल कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन.

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Representative Results

इम्युनोपेरॉक्सिडेस अभिरंजन के प्रतिनिधि आंकड़े चित्र 1 और चित्र 2में दर्शाए गए हैं। वयस्क जेब्राफ़िश के पेट में ओएक्स-ए और ओएक्स-2 आर वितरण के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ने ओएक्स-ए और ओएक्स-2 आर के विभिन्न स्थानीयकरण साइटों और डीआईओ जेब्राफ़िश की आंतों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति में वृद्धि को दिखाया। ओएक्स-ए के लिए एक तीव्र भूरे रंग का धुंधला मध्य और पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में देखा गया (चित्र 1क, ए1)। ओएक्स-ए के इम्यूनोएक्सप्रेशन ने विभिन्न आंत की तुलना में स्पष्ट संकेत दिए हैं, जो मध्य आंत की ओर पूर्ववर्ती से कम हो जाते हैं (चित्र 1 ख, बी1)। नकारात्मक नियंत्रण पृष्ठभूमि के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था और OX-A संकेत की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए (चित्र 1E) . क्रोमोजेन DAB के लिए लंबे समय तक जोखिम पृष्ठभूमि तीव्रता में वृद्धि हुई (चित्र 1D) . इसी प्रकार के परिणाम डीईओ और नियंत्रण आहार जेब्राफिश की आंत में ओएक्स-2 आर इम्यूनोएक्सप्रेशन के लिए देखे गए (चित्र 2) । DIO वयस्क ज़ेब्राफ़िश में एक वृद्धि हुई OX-A संकेत के साथ अन्य आंतों की तुलना में OX-2R की अतिअभिव्यक्ति के साथ था (चित्र 2B, B1)।

इम्यूनोफ्लोरेसींस का उपयोग करते हुए, इम्यूनोपर्क्सिडस विश्लेषण द्वारा प्राप्त आंकड़ों की पुष्टि की गई, नियंत्रण के संबंध में वयस्क डीआईओ जेब्राफ़िश के पेट में ओएक्स-ए और ओएक्स-2 आर अभिव्यक्ति की वृद्धि अंतर्निहित (चित्र 3)। इसके अलावा, डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके, एंडोक्नाबिनोइड रिसेप्टर सीबी1आर की अभिव्यक्ति और इसके सह-स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्राप्त करना संभव था, जिसमें आंत-ए या ओएक्स-2 आर के साथ आंत और नियंत्रण आहार के मस्तिष्क और डीओओ वयस्क जेब्राफ़िश शामिल थे। इम्यूनोफ्लोरेसींस का लाभ यह है कि यह प्रतिरक्षा रूपविज्ञान तकनीक की तुलना में ऊतक आकृति विज्ञान के बारे में कम प्रदान की गई जानकारी के साथ एक अधिक विस्तृत संकेत देता है। इम्यूनोफ्लोरेसी विधि का उपयोग करके, हमने पहले आंत और मस्तिष्क 10 दोनों मेंओएक्स-2 आर और सीबी1आर के बीच शारीरिक संबंध निर्धारित किए हैं।

इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों का सटीक विश्लेषण नियंत्रण आहार जेब्राफ़िश की तुलना में डीआईओ वयस्क जेब्राफ़िश के पेट में ओएक्स-2आर/सीबी1आर सह-स्थानीयकरण की वृद्धि को दिखाता है (चित्र 3 बी, सी)। इसी प्रकार की स्थिति विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में देखी गई, जैसे पृष्ठीय टेलीनसेफेलॉन, हाइपोथैलेमस (पार्श्वीय, अधर, और पृष्ठीय क्षेत्र), ऑप्टिक टेकटम, टोरस पार्श्विस, और निम्न पालि के विसरना नाभिक (चित्र 4)। नकारात्मक (चित्र 5क, ख) और धनात्मक (माउस मस्तिष्क ) ( चित्र5ब्) नियंत्रणों का उपयोग पृष्ठभूमि के संदर्भ के रूप में और सीबी1आर तथा ओएक्स-2आर संकेतों की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए किया गया था।

इसके अलावा, ओएक्स-ए/सीबी1आर के साथ डबल इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा, यह हाइपोथैलेमस के ऑर्साइनर्जिक न्यूरॉन्स में देखा गया था कि ओएक्स-ए फ्लोरोसेंट सिग्नल की वृद्धि के साथ सह-स्थानीयकरण में वृद्धि हुई थी (चित्र 6)। इन परिणामों से पता चलता है कि कैसे डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस शारीरिक रूप से संरक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति की पहचान करने में मदद कर सकते हैं, लक्ष्य प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण, और उनके वितरण और /

Figure 1
चित्र ााालः आवयो बनाम नियंत्रण आहार वयस्क जेब्राफिश की आंतों में ओरेक्सिन इम्यूनोलोकीकरण। (ए) ओएक्स-ए इम्यूनोरेक्टिविटी नियंत्रित आहार जेब्राफ़िश की मध्य आंत की कोशिकाओं में। (A1) डीआईओएस जेब्राफ़िश की मध्य आंत की कोशिकाओं में ओएक्स-ए इम्यूनोरेक्टिविटी। (बी) ओएक्स-ए इम्यूनोरेक्टिविटी नियंत्रण आहार जेब्राफ़िश की पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में। (बी1) डीओडब्ल्यू जेब्राफ़िश की पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में ओएक्स-ए इम्यूनोरेक्टिविटी। (ए1, बी1) DIO ज़ेब्राफ़िश के मध्यस्थ और पूर्ववर्ती आंत के विभिन्न ऊतक compartement में OX-एक सकारात्मक कोशिकाओं की वृद्धि. (C) डीओ जेब्राफ़िश की पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में ओएक्स-ए इम्यूनोरेक्टिविटी। (डी) डी ए बी के लंबे समय तक संपर्क के बाद ओएक्स-ए के लिए इम्यूनोपेरॉक्साइड प्रतिक्रिया। (ई) नकारात्मक नियंत्रण. स्केल बार: 50 डिग्री (ए, ए, ए1, बी, बी1); 100 डिग्री (सी, डी, ई)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: DIO बनाम नियंत्रण आहार वयस्क जेब्राफ़िश की आंत में Orexin 2 रिसेप्टर इम्यूनोलोकेशन। (ए) ओएक्स-2 आर इम्यूनोरेक्टिविटी को नियंत्रित आहार जेब्राफ़िश की मध्य आंत की कोशिकाओं में। (A1) डीआईओएस जेब्राफ़िश की मध्य आंत की कोशिकाओं में ओएक्स-2 आर इम्यूनोरेक्टिविटी। (बी) ओएक्स-2 आर इम्यूनोरेक्टिविटी नियंत्रण आहार जेब्राफ़िश की पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में। (बी1) डीओ जेब्राफ़िश की पूर्ववर्ती आंत की कोशिकाओं में ओएक्स-2 आर इम्यूनोरेक्टिविटी। (ए1, बी1) DIO ज़ेब्राफ़िश के मध्यस्थ और पूर्ववर्ती आंत के विभिन्न ऊतक compartement में OX-2R सकारात्मक कोशिकाओं की वृद्धि. स्केल बार: 50 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: डीआईओएस बनाम नियंत्रण वयस्क जेब्राफ़िश की आंतों में ओएक्स-ए (हरी)/सीबी1आर (लाल) और ओएक्स-2आर (लाल)/सीबी1आर (हरा) और उनके सह-स्थानीयकरण के साथ ओएक्स-2आर/सीबी1आर (पीला) का वितरण। (ए) ओएक्स-ए/सीबी1आर सह-अभिव्यक्ति नियंत्रण आहार वयस्क जेब्राफ़िश की आंत में। (बी) OX-2R/CB1R सह-अभिव्यक्ति नियंत्रण आहार ज़ेब्राफ़िश की आंत के भीतर। (सी) ओडीओ वयस्क जेब्राफ़िश की आंत के भीतर ओएक्स-2आर/सीबी1आर सह-अभिव्यक्ति। DIO ज़ेब्राफ़िश की आंत में OX-2R/CB1R सह-स्थानीयकरण (पीले डॉट्स) की वृद्धि। स्केल बार: 25 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: डीओआई ओ डी ओ बनाम नियंत्रण आहार वयस्क जेब्राफ़िश के मस्तिष्क कोरोनल वर्गों में ओएक्स-2आर (लाल) और सीबी1आर (हरा) और उनके सह-स्थानीयकरण के साथ ओएक्स-2आर/सीबी1आर (पीला) का वितरण। (ए) OX-2R/CB1R सह-अभिव्यक्ति नियंत्रण आहार ज़ेब्राफ़िश के टेलीनेसेफेलॉन में। (A1) डीआईओएस जेब्राफ़िश के टेलीनसेलॉन में ओएक्स-2आर/सीबी1आर सह-अभिव्यक्ति। (B) ओएक्स-2R/CB1R सह-अभिव्यक्ति हाइपोथैलेमस के पार्श्व, अधर और पृष् ठ क्षेत्र के भीतर, ऑप्टिक tectum, torus lateralis, नियंत्रण आहार जेब्राफ़िश के अवर दोज के फैलाना नाभिक (बी 1) OX-2R/CB1R सह-अभिव्यक्ति, पार्श्व, और हाइपोथैलेमस, ऑप्टिक टेकम, टोरस पार्श्विस के पृष्ठीय क्षेत्र, और डीआईओ जेब्राफ़िश के अवर पालि के विसरित नाभिक। (ग) नियंत्रण आहार जेब्राफ़िश में ओएक्स-2आर/सीबी1आर (पीला) की सह-अभिव्यक्ति दर्शाने वाले ऑप्टिक टेकम का उच्च आवर्धन। (सी1) DIO ज़ेब्राफ़िश में OX-2R/CB1R (पीला) की सह-अभिव्यक्ति दिखा ऑप्टिक tectum के उच्च आवर्धन। (घ) डीआईओ जेब्राफ़िश में ओएक्स-2आर/सीबी1आर (पीला) के वितरण और सह-अभिव्यक्ति को दर्शाने वाले ऑप्टिक टेकम का एक विशेष। डीएपीआई (नीला) नाभिक का मुकाबला करने के लिए प्रयोग किया जाता था। सीपी: केंद्रीय पश् चपश् य थैलेमिक नाभिक; Dd: पृष्ठीय; डीसी: केंद्रीय; डीएल: पार्श्व; डीएम: मध्यस्थ; डी पी: पृष्ठीय telencephalon के पीछे भाग; Hd: periventricular hypothalamus के पृष्ठीय क्षेत्र; Hv: परिवेत्तिकिर हाइपोथैलेमस का अधर क्षेत्र; एलएच: हाइपोथैलेमस का पार्श्व भाग; PGl: पार्श्व और PGm: मध्यस्थ preglomerular नाभिक; पीजीजेड: ऑप्टिक tectum के periventricular ग्रे क्षेत्र; TeO: ऑप्टिक tectum; टीएल: टोरस देशांतरीयता; Vd: अधर टेलीनसेफेलॉन का पृष्ठीय भाग. स्केल बार: 50 डिग्री (ए, ए1, सी, सी1); 250 डिग्री (बी और बी1); 25 डिग्री मी (डी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: OX-2R और CB1R प्रोटीन अभिव्यक्ति और ज़ेब्राफ़िश और माउस हिप्पोकैम्पस के वयस्क मस्तिष्क में विशिष्टता. (ए) सापेक्ष पेप्टाइड के साथ पूर्व अवशोषण द्वारा ओएक्स-2आर का नकारात्मक नियंत्रण। (ठ) सापेक्ष पेप्टाइड के साथ पूर्व अवशोषण द्वारा सीबी1आर का नकारात्मक नियंत्रण। (ग) माउस के हिप्पोकैम्पस में ओएक्स-2आर/सीबी1आर का सकारात्मक नियंत्रण। पीजीजेड: ऑप्टिक tectum के periventricular ग्रे क्षेत्र; TeO: ऑप्टिक tectum. स्केल बार: 100 डिग्री मी (ए, बी); 250 डिग्री मी (सी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: डीओओ बनाम नियंत्रण आहार वयस्क जेब्राफ़िश के हाइपोथैलेमिक कोरोनल वर्गों में ओएक्स-ए (हरी) और सीबी1आर (लाल) और उनके सह-स्थानीयकरण के साथ ओएक्स-ए/सीबी1आर (पीला) का वितरण। (A) OX-A/CB1R सह-अभिव्यक्ति नियंत्रण आहार ज़ेब्राफ़िश के हाइपोथैलेमस में (A1) उच्च आवर्धन दिखा OX-A/CB1R सह-अभिव्यक्ति पार्श्व hypothalamus के भीतर. OX-A/CB1R सह-अभिव्यक्ति का विवरण जो एक putative आसन्न स्थानीयकरण को OX-A/CB1R या सह-स्थानीयकरण और उसी कक्ष में OX-A/CB1R के ओवरलैप दर्शाता है। (B) ओडीओ जेब्राफ़िश (बी1) के हाइपोथैलेमस में ओएक्स-ए/सीबी1आर सह-अभिव्यक्ति पार्श्व हाइपोथैलेमस के भीतर बढ़ी हुई ओएक्स-ए/सीबी1आर सह-अभिव्यक्ति को दर्शाता है। OX-A/CB1R सह-अभिव्यक्ति का विवरण जो एक putative आसन्न स्थानीयकरण को OX-A/CB1R या सह-स्थानीयकरण और उसी कक्ष में OX-A/CB1R के ओवरलैप दर्शाता है। एल एच: हाइपोथैलेमस का पार्श्व भाग। स्केल बार: 50 डिग्री (ए, बी); 25 डिग्री मी (ए1, बी1)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

नमूना तैयारी

आईएचसी में नमूना तैयार करना पहला महत्वपूर्ण कदम है। एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल सेल आकारिकी, ऊतक वास्तुकला, और antigenicity के रखरखाव के लिए अनुमति देता है. इस चरण के लिए सही ऊतक संग्रहण , निर्धारण, और अनुभागीकरण22,23की आवश्यकता होती है . निर्धारण का उद्देश्य ऊतक को संरक्षित करना और ऊतक एंजाइमों या सूक्ष्मजीवों की क्रिया को कम करना है। विशेष रूप से, निर्धारण कदम सेलुलर घटकों और जैव अणुओं को बरकरार रखता है, ऑटोलिसिस और सेल घटकों के स्थानांतरण को रोकता है (जैसे एंटीजन और एंजाइमों के रूप में), निम्नलिखित प्रक्रियाओं के प्रतिकूल प्रभाव के खिलाफ सेलुलर सामग्री स्थिर, और 4,7,24को इम्यूनोस्टेनिंग की सुविधा प्रदान करता है .

अनुभाग से पहले, ऊतक तैयार किया जाता है और पैराफिन embedding (immunoperoxidase विधि) या cryopreserved के माध्यम से संरक्षित किया जाता है (cryomedia में फ्रीजिंग, कई इम्यूनोफ्लोरेसींस तरीकों में)। संरक्षण विधि निर्धारण के प्रकार7के साथ जुड़ा हुआ है. निर्धारण और संरक्षण के बाद, ऊतकों को एक माइक्रोटोम द्वारा कटा हुआ होता है यदि पैराफिन में एम्बेडेड हो, या क्रायोमीडिया में एम्बेडेड होने पर क्रायोस्टैट द्वारा। ऊतक ों को आम तौर पर 8-10 डिग्री मीटर की मोटाई रेंज में कटा हुआ है और स्लाइड पर रखा जाता है। इम्यूनोपर्क्सिडास दाग के लिए, नमूने के लिए एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए एपिटोप को बेनकाब करने के लिए अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें डेपराफिनाइजेशन और एंटीजन रिट्रीअल25,26शामिल हैं। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि अधिनिर्धारण एपिटोप मास्किंग का कारण बन सकता है, जबकि अंडरफिक्सेशन भारी धार धुंधला के साथ कोई सकारात्मक संकेत के लिए थोड़ा पैदा कर सकता है।

अवरुद्ध और पृष्ठभूमि में कमी

इम्यूनोपर्क्सिडास विधि में, बायोटिन के लिए एविडिन की उच्च आत्मीयता पृष्ठभूमि धुंधला के तेजी से उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। इसके अलावा, के बाद से avidin-बायोटिन प्रतिक्रिया अपरिवर्तनीय है, पृष्ठभूमि18,27नहीं हटाया जा सकता है. IHC के दौरान, उच्च पृष्ठभूमि भी अंतर्जात ऊतक biotines के लिए nonspecific बाध्यकारी द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. हाइड्रोफोबिक और आयनिक बातचीत (जैसे कोलेजन और अन्य संयोजी ऊतकों जैसे उपकला और एडिपोसाइट्स द्वारा उत्पादित), साथ ही अंतर्जात एंजाइम गतिविधि, पृष्ठभूमि धुंधला के प्रमुख कारण हैं। अंतर्जात बायोटिन या एंजाइमों और हाइड्रोफोबिक बाइंडिंग को एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले कम से कम किया जाना चाहिए, जिसे डिटर्जेंट के अलावा प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि ट्राइटन एक्स-100, अवरुद्ध बफर्स28में।

अवरुद्ध बफ़र्स में 0.3%-0.4% Triton X-100 का उपयोग भी ऊतक वर्गों में एंटीबॉडी के पूर्ण permebilization के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, हालांकि एंटीबॉडी एक प्रतीक के लिए अधिमानी रूप से विशिष्ट हैं, गैर विशिष्टप्रोटीन पर साइटों के लिए आंशिक बाध्यकारी संभव है, उच्च पृष्ठभूमि 29 धुंधला करने के लिए अग्रणी. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग लक्ष्य प्रतिजन30के संकेत को छुपा सकती है . गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए, नमूने गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाशील साइटों को ब्लॉक करने वाले एक बफ़र के साथ इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। सामान्य अवरुद्ध बफ़र्स सामान्य सीरम या गोजातीय सीरम एल्बुमिन30शामिल हैं । अवरुद्ध सीरम की प्रजातियों माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान के रूप में ही होना चाहिए. यह सबसे अच्छा ऊष्मायन समय निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है। अवरुद्ध बफर में सामान्य सीरम की एकाग्रता एक और महत्वपूर्ण दृढ़ संकल्प31है. इसके अलावा, पृष्ठभूमि धुंधला को खत्म करने के लिए, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के इष्टतम कमजोर पड़ने का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, ऊष्मायन समय को तापमान के अलावा सावधानी से चुना जाना चाहिए (यानी, समय में वृद्धि अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन, समय कम अगर आरटी पर) और पता लगाने प्रणाली।

एंटीबॉडी पसंद

आईएचसी दाग के लिए एंटीबॉडी का चयन महत्वपूर्ण है और प्रयोगात्मक परिणाम32को प्रभावित कर सकता है . यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंटीबॉडी उचित रूप से जवाब देगा, इसके द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप पर विचार किया जाना चाहिए। लक्ष्य प्रोटीन और उसके कार्य, ऊतक और subcellular स्थानीयकरण को समझना, और क्या यह पोस्ट-अनुवाद संशोधनों से गुजरना एंटीबॉडी के चुनाव का निर्धारण करने में मदद कर सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम एक विशिष्ट संकेत के साथ संगत एक न्यूनतम स्तर पर पृष्ठभूमि और विशिष्टता रखने के लिए प्राथमिक/माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता का परीक्षण है। इसके अलावा, यह प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी संगतता और प्राथमिक एंटीबॉडी की क्षमता की पुष्टि करने के लिए प्रजातियों प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है अपने मूल अनुरूपता में प्रतिजन लक्ष्य पहचान करने के लिए. प्राथमिक एंटीबॉडी विकल्प के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम जीन संरेखण है. यह सुनिश्चित करता है कि प्राथमिक एंटीबॉडी ब्याज के जैव अणु के साथ प्रतिक्रिया करता है और जानकारी प्रदान करता है जिसके बारे में एक विशिष्ट पशु मॉडल में एंटीबॉडी द्वारा epitope मान्यता प्राप्त है. जीन संरेखण भी epitopes कि विकासवादी संरक्षित कर रहे हैं पहचानने में सक्षम एंटीबॉडी चुनने की संभावना प्रदान करता है.

नियंत्रण

एंटीबॉडी की विशिष्टता को स्पष्ट करने के लिए, एक महत्वपूर्ण पहलू नियंत्रण का प्रदर्शन है, जो विशिष्ट धुंधला का पता लगाने की अनुमति देता है। नियंत्रण में शामिल हैं: मैं) एक ऊतक एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रतिजन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है; ii) एक ऊतक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रतिजन व्यक्त नहीं करने के लिए जाना जाता है; पप पप) प्राथमिक एंटीबॉडी की चूक या एक विशिष्ट पेप्टाइड के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के अवशोषण से यह पुष्टि होती है कि द्वितीयक एंटीबॉडी अन्य ऊतक घटकों14,33के साथ परस्पर प्रतिक्रिया नहीं करता है।

IHC तकनीक में, कई कदम समस्याओं को अंतिम धुंधला प्राप्त करने से पहले पैदा कर सकता है. मजबूत पृष्ठभूमि धुंधला और nonspecific लक्ष्य प्रतिजन धुंधला अंतर्जात बायोटिन या प्राथमिक / माध्यमिक एंटीबॉडी पार प्रतिक्रिया और गरीब एंजाइम गतिविधि या प्राथमिक एंटीबॉडी शक्ति के कारण हो सकता है, क्रमशः. पृष्ठभूमि धुंधला और nonspecific बंधन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन से पहले अंतर्जात एंजाइमों अवरुद्ध द्वारा रोका जा सकता है. सामान्य सीरम का उपयोग करना गैर-विशिष्ट अन्योन्यक्रियाओं को अवरोधित करने का सबसे अच्छा तरीका है30. ब्लॉकिंग बफ़र का चुनाव उपयोग की गई खोज की विधि पर निर्भर करता है। इसके अलावा, एक ऊतक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में लक्ष्य प्रतिजन की अभिव्यक्ति की कमी के लिए जाना जाता है पृष्ठभूमि दाग34की मात्रा निर्धारित करने के संदर्भ के रूप में कार्य कर सकते हैं. नकारात्मक नियंत्रण में क्रोमोजेनिक या फ्लोरोसेंट संकेत का जमाव गैर विशिष्ट धुंधला की उपस्थिति की पुष्टि करता है। इसके अलावा, अपर्याप्त अवरुद्ध समय अवरुद्ध एक उच्च पृष्ठभूमि की ओर जाता है, जबकि अत्यधिक अवरुद्ध एक कम संकेत35की ओर जाता है.

इम्यूनोपर्क्सिडास धुंधला में, ऊतक में अंतर्जात peroxidase की उपस्थिति भूरे रंग की पृष्ठभूमि जमाव का एक और कारण है। एच2व्2 के साथ उपचार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन से पहले अंतर्जात पेरोक्सिडस36,37को रोकता है . इसके विपरीत, इम्यूनोफ्लोरेसेंस में, स्व-प्रवाह की पीढ़ी में स्थिरीकरण एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए, सबसे अच्छा निर्धारण विधि, निर्धारण का समय, और ऊतकों की तैयारी सावधानी से चुना जाना चाहिए। आईएचसी का एक और महत्वपूर्ण कदम प्राथमिक एंटीबॉडी का सत्यापन है। एक एंटीबॉडी मान्य माना जाता है अगर यह एक विशेष ऊतक या सेल / subcellular घटकों में एक सुसंगत और विशिष्ट धुंधला पैटर्न पैदा करता है और यदि एक विशिष्ट पेप्टाइड के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के पूर्व अवशोषण धुंधला38उपज नहीं है . इम्यूनोफ्लोरेसींस में, गैर-विशिष्ट बाइंडिंग तीन रंग फ्लोरोसेंट डिटेक्टरों के तहत समान फ्लोरोसेंट तीव्रता से पता चलता है, जबकि संकेत विभिन्न फ्लोरोसेंट संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है के बाद से चर रहा है। IHC ऊतक तैयारी और एंटीबॉडी धुंधला के इन पहलुओं को दाग मुद्दों पर काबू पाने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए.

IHC, हालांकि एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक, कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है और कई कारकों पर निर्भर39. महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक औपचारिकता निर्धारण है, जो पोस्ट-अनुवाद संशोधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बदल सकता है। दूसरी ओर, औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों को कमरे के तापमान पर लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, जबकि जमे हुए ऊतकों को केवल -80 डिग्री सेल्सियस पर एक वर्ष तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इसके अलावा, जमे हुए ऊतकों बर्फ क्रिस्टल के गठन से क्षतिग्रस्त हो सकताहै, जो subcellular विवरण IHC 40,41दाग बदलने को प्रभावित कर सकते हैं. हमारे अध्ययन के बारे में, सबसे कठिन पहलू ज़ेब्राफ़िश अणुओं के खिलाफ विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी मिल रहा था. हालांकि ज़ेब्राफ़िश संरचना के एक अत्यधिक संरक्षित डिग्री के साथ एक वैध पशु मॉडल के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया है, बहुत कुछ एंटीबॉडी विकसित किया गया है कि विशिष्ट प्रोटीन और ज़ेबराफ़िश में अन्य अणुओं को पहचान सकते हैं. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यह पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण और जीन संरेखण द्वारा एंटीबॉडी विशिष्टता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है.

आईएचसी विधियों में बढ़ती रुचि के कारण अत्यधिक विशिष्ट इम्यूनोस्टेनिंग का विकास हुआ है जो खोजी अध्ययनोंमें 42की सहायता कर सकता है . IHC विशिष्ट आणविक मार्करों की उपस्थिति और विभिन्न रोगों में उनके परिवर्तन की पहचान करने के लिए बढ़ती आवृत्ति के साथ इस्तेमाल किया जा रहा है। यहाँ सचित्र दो दृष्टिकोण, इम्यूनोपर्क्सिडेज और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, संबंधित फायदे और नुकसान43है। इम्यूनोपर्क्सिडेज तकनीक में इस्तेमाल किए जाने वाले पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, कोशिकाओं और ऊतकों के उच्च संकल्प के लिए अनुमति दे सकते हैं और लक्ष्य प्रोटीन44,45के वितरण और मात्रा के बारे में विवरण प्रकट कर सकते हैं। हालांकि, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसींस के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि पैराफिन एंटीजेनिकिटी को मुखौटा कर सकता है और गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट46का कारण बन सकता है। दूसरी ओर, पीएफए-फिक्स्ड ऊतक का क्रायोसेक्शन अंतर्जात एंटीजेनिकिटी को संरक्षित करता है और गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट में कमी करता है। यहां तक कि अगर cryosections की तकनीकी गुणवत्ता बहुत पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक की तुलना में कम कर रहे हैं, वे IHC तकनीक47का उपयोग कर मान्य परिणाम प्राप्त कर सकते हैं.

इसके अलावा, जबकि पैराफिन embedding बेहतर morphological विवरण को बरकरार रखता है, cryopservation बेहतर एंजाइम और प्रतिजन अभिव्यक्ति को बरकरार रखता है, और अधिक विस्तृत इम्यूनोस्टेनिंग के लिए अग्रणी. इम्यूनोफ्लोरेसींस तकनीक दो या तीन विभिन्न जैव अणुओं का समकालीन पता लगाने की भी अनुमति देती है, संभावित बातचीत का खुलासा करती है, जैसा कि ऑर्क्सिन और एंडोक्नाबिनोइड सिस्टम10के लिए हमारे पिछले काम में दिखाया गया है। विशिष्ट जैव अणुओं के वितरण और स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों में, आईएचसी न केवल विशिष्ट रूपात्मक अभिव्यक्ति और अणुओं और प्रोटीन के वितरण के निर्धारण की अनुमति देता है, बल्कि मात्रात्मक प्रदर्शन करने की संभावना भी प्रदान करता है विश्लेषण.

इम्यूनोफ्लोरेसींस का उपयोग करते हुए जैव अणुओं के सह-वितरण और सह-अभिव्यक्ति को भी और समझा जा सकता है , साथ ही संभव बातचीत और विभिन्न रोगों के मामलों में उनके परिवर्तन48. Confocal माइक्रोस्कोपी, पिछले 20 वर्षों के दौरान, अक्सर स्तनधारी मस्तिष्क में कई प्रोटीन के सेलुलर और subcellular वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी भी इस तरह के प्रोटीन, organelles, और अन्य जैविक पदार्थ के रूप में ब्याज की विशिष्ट संरचनाओं के दृश्य (फ्लोरोफोर या फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग) की अनुमति देता है; इस तरह के संकेतों का उपयोग स्थिर और जीवित जैविक प्रणालियों दोनों में विशिष्ट उपकोशिकीय संरचनाओं की छवि के लिए किया जा सकताहै . विशिष्ट कोशिका डिब्बों में जैव अणुओं के संभावित न्यूनाधिक समारोह उनकी अभिव्यक्ति पैटर्न के दृश्य के माध्यम से पता लगाया जा सकता है, जबकि ऊतकों के भीतर प्रोटीन संकेतन की भूमिका neuroanatomic वितरण के माध्यम से खुला हो सकता है चयापचय एंजाइम अभिव्यक्ति या रिसेप्टर्स.

प्रस्तुत तकनीकी काम IHC दृष्टिकोण परिचय, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस, दो अत्यधिक संरक्षित प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए, orexin और endocannabinoid, एक वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल में. विशेष रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसी तरीकों का उपयोग लक्ष्य ऊतकों में विशिष्ट प्रोटीन के वितरण, सापेक्ष राशि, और शारीरिक बातचीत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। पीएफए-फिक्स्ड ऊतकों का क्राइओप्रोमेंटेशन तेजी से गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील अत्यधिक संवेदनशील प्रोटीन को बेहतर बनाए रखता है। इसके अलावा, cryopservation बेहतर प्रतिजन और antigenicity की रक्षा के लिए सोचा है, और यह पोस्ट अनुवाद संशोधित प्रोटीन और डीएनए के अध्ययन के लिए अनुमति देता है.

यहां तक कि अगर जमे हुए ऊतकों (पराफिन-एम्बेडेड वर्गों की तुलना में) मोटा होता है, जो ऊतक आकृति विज्ञान को विस्तार से देखने की क्षमता में बाधा डालता है, confocal माइक्रोस्कोपी महान विस्तार में नमूना दृश्य के लिए अनुमति देता है और इमेजिंग क्षमताओं को बढ़ाता है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग धुंधला तीव्रता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, और संकेत का घनत्वात्मक विश्लेषण मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। यह सह-स्थानीयकरण के क्षेत्रों को देखकर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के साथ फ्लोरोक्रोम संकेत स्तर के सहसंबंध निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। यह काम वर्णन करता है और प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश में महत्वपूर्ण प्रोटीन के विकास संरक्षण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखाता है. आईएचसी का उपयोग, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसिस, वयस्क जेब्राफ़िश में इस पशु मॉडल की उपयोगिता को उजागर करने में मदद कर सकता है, जो अत्यधिक संरक्षित जैव अणुओं की अभिव्यक्ति और वितरण का अध्ययन करता है, साथ ही साथ संभव परिवर्तन ों को प्रकट करता है मानव फिजियोपैथोलॉजी से संबंधित विभिन्न रोग स्थितियां।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Sannio विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

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जैव रसायन अंक 148 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोपर्ऑक्सिडेस ऑर्क्सिन रिसेप्टर एंडोकैनाबिनोइड रिसेप्टर जेब्राफ़िश मस्तिष्क जेब्राफ़िश आंत
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Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

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