Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifisering av orexin og Endocannabinoid reseptorer i Adult sebrafisk bruke Immunoperoxidase og Immunofluorescence metoder

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Presentert her er protokoller for immunhistokjemiske karakterisering og lokalisering av orexin peptid, orexin reseptorer, og endocannabinoid reseptorer i tarmen og hjernen av normal og diett-indusert fedme (DIO) voksen sebrafisk modeller ved hjelp immunoperixidase og doble immunofluorescence metoder.

Abstract

Immunhistokjemi (IHC) er en svært følsom og spesifikk teknikk som er involvert i påvisning av mål antigener i vevs seksjoner med merket antistoffer. Det er en flertrinnsprosess der optimaliseringen av hvert trinn er avgjørende for å oppnå optimal bestemt signal. Gjennom IHC, distribusjon og lokalisering av spesifikke biomarkører kan oppdages, avslørende informasjon om evolusjonære bevaring. Videre tillater IHC for forståelsen av uttrykk og distribusjon endringer av biomarkører i patologiske tilstander, som fedme. IHC, hovedsakelig immunofluorescence teknikk, kan brukes i voksen sebrafisk for å oppdage organisering og distribusjon av phylogenetically bevarte molekyler, men en standard IHC protokoll er ikke estasblished. Orexin og endocannabinoid er to svært bevarte systemer involvert i kontroll av matinntak og fedme patologi. Rapportert her er protokoller som brukes til å innhente informasjon om orexin peptid (OXA), orexin reseptor (okse-2R), og cannabinoid reseptor (CB1R) lokalisering og distribusjon i tarmen og hjernen av normal og diett-indusert overvektige (DIO) voksen sebrafisk modeller. Også beskrevet er metoder for immunoperoxidase og dobbel immunofluorescence, samt utarbeidelse av reagenser, fiksering, parafin-embedding, og cryoprotection av sebrafisk vev og forberedelse til en endogene aktivitet-blokkering trinn og bakgrunn counterstaining. Det komplette sett av parametre er innhentet fra tidligere IHC eksperimenter, der vi har vist hvordan immunofluorescence kan hjelpe med forståelsen av OXs, okse-2R, og CB1R distribusjon, lokalisering og bevaring av uttrykk i voksen sebrafisk Vev. Det resulterer profilen med høylig spesifikk signal intensiteten smal avsats å bekreftelsen det sebrafisk er passende dyr modeller for immunhistokjemiske studier av distribusjon, lokaliseringen, og evolusjonær bevaring av spesifikk biomarkører inne fysiologiske og patologiske tilstander. Protokollene som presenteres her anbefales for IHC eksperimenter i voksen sebrafisk.

Introduction

Immunhistokjemi (IHC) er en veletablert klassisk teknikk som brukes for å identifisere cellulære eller vevs komponenter (antigener) ved antigen-antistoff interaksjon1,2. Den kan brukes til å identifisere lokalisering og distribusjon av målet biomolekyler innenfor en vev. IHC bruker immunologiske og kjemiske reaksjoner for å detektere antigener i vevs seksjoner3. De viktigste markører som brukes for visualisering av antigen-antistoff interaksjoner inkluderer fluorescerende fargestoffer (immunofluorescence) og enzym-substrat farge reaksjoner (immunoperoxidase), begge bøyd til antistoffer4. Ved hjelp av mikroskopisk observasjon er mulig å bestemme lokalisering av merket vev, som omtrent tilsvarer lokalisering av målet antigen i vevet.

Det finnes to metoder for fluorescerende eller kromogen reaksjoner for å påvise protein: direkte deteksjons metoden, der det spesifikke primære antistoff er direkte merket; og den indirekte deteksjons metoden, der det primære antistoff er unconjugated mens det sekundære antistoff bærer etiketten5,6,7. Den indirekte metoden har noen fordeler, som er hovedsakelig dens signal forsterkning. Videre, i motsetning til andre molekylære og cellulære teknikker, med immunofluorescence, er det mulig å visualisere fordelingen, lokalisering og coexpression av to eller flere proteiner differensielt uttrykt i celler og vev7. Valget av deteksjons metoden som brukes avhenger av eksperimentelle detaljer.

Hittil er IHC mye brukt i grunnleggende forskning som et kraftig og viktig verktøy for å forstå distribusjon og lokalisering av biomarkører og den generelle profilering av ulike proteiner i biologisk vev fra menneske til virvelløse dyr8, 9 andre priser , 10 andre , 11. teknikken bidrar til å vise et kart over protein uttrykk i et stort antall normale og endrede dyre organer og ulike vevstyper, viser mulig ned-eller opp-regulering av uttrykk indusert av fysiologiske og patologiske forandringer. IHC er en svært følsom teknikk som krever nøyaktighet og riktig valg av metoder for å oppnå optimale resultater12. Først av alt, mange forskjellige faktorer som fiksering, Cross-reaktivitet, antigen gjenfinning, og følsomhet for antistoffer kan føre til falske positive og falske negative signaler13. Valg av antistoffer er en av de viktigste trinnene i IHC og avhenger av antigen spesifisitet og dens affinitet til protein og arter under etterforskning7.

Nylig har vi optimalisert IHC teknikk for å oppdage medlemmer av orexin/hypocretin og endocannabinoid systemer i voksen sebrafisk vev. Vi har hovedsakelig fokusert på fiksering, vevs innebygging med to ulike tilnærminger, snitting og montering (som kan påvirke oppløsning og detaljer under mikroskopisk analyse), og blokkering (for å forhindre falske positiver og redusere bakgrunnen)14. Andre viktige egenskaper er antistoff spesifisitet og selektivitet og reproduserbarhet for individuelle IHC protokoller. Nøkkelen til å gi antistoff spesifisitet er bruken av negative kontroller (inkludert ingen primære antistoffer eller vev som er kjent for å ikke uttrykke målet proteiner) så vel som positive kontroller (inkludert vev som er kjent for å uttrykke målet proteiner)15 . Valget av antistoffer for IHC er gjort basert på deres arter-spesifisitet (sannsynligheten som de reagerer med antigen av interesse) og antigen-antistoff binding Detection systemer som brukes4,5,6 ,7. I tilfelle av immunoperoxidase, er fargen på reaksjonen bestemmes av valg av fremskynde kromogen, vanligvis diaminobenzidine (brun)16. På den andre side, jegmmunofluorescence utnytter Antistoffene bøyd med en fluorophor å visualisere protein gjengivelsen inne frosset tissue avdelinger og innrømmer for lett analyse av mangfoldig protein med hensyn til det kromogen oppdagelsen system 5 andre priser , 7i.

I immunoperoxidase teknikk, den sekundære antistoff er bøyd til biotin, en linker molekyl stand til å rekruttere en kromogen reporter molekyl [avidin-biotin kompleks (ABC)], som fører til forsterkning av fargesignalet. Med ABC reporter-metoden, reagerer enzymet peroksidase med 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB), produserer en intenst brun-farget flekker der enzymet binder seg til den sekundære antistoff, som deretter kan analyseres med en vanlig lys mikroskop. ABC farging, på grunn av den høye affinitet av avidin for biotin, produserer en rask og optimal reaksjon, med få sekundære antistoffer knyttet til stedet for den primære antistoff reaktivitet. Denne kromogen gjenkjennings metoden tillater densitometric analyse av signalet, og gir semi-kvantitative data basert på korrelasjon av brune signal nivåer med protein uttrykk nivåer18.

Med immunofluorescence teknikker, er samtidig påvisning av flere proteiner mulig på grunn av evnen til forskjellige fluorokromer å avgi lys på unike bølgelengder, men er viktig å velge fluorokromer nøye for å minimere Spectral overlapping 5. i tillegg minimerer bruken av primære antistoffer i forskjellige verts arter vanskeligheter vedrørende kryss reaktivitet. I dette tilfellet gjenkjenner hvert Arts spesifikt sekundært antistoff bare én type primær antistoff. Fluorescerende journalister er små organiske molekyler, inkludert kommersielle derivater, for eksempel Alexa fluor fargestoffer.

Mange dyremodeller brukes til å forstå spesielle fysiologiske og patologiske tilstander. Hittil er det fastslått at mange metabolske trasé er bevart i løpet av utviklingen. Derfor kan IHC studier i modell organismer som sebrafisk gi innsikt i Genesis og vedlikehold av patologiske og ikke-patologiske tilstander17. Det er et mål for denne rapporten å illustrere IHC protokoller som kan utføres på voksen sebrafisk vev og brukes til å få detaljerte bilder av distribusjon og lokalisering av OXA, okse-2R, og CB1R på perifere og sentrale nivåer. Også rapportert er protokoller for anvendelse av to store IHC indirekte metoder i perifere og sentrale vev av voksne sebrafisk. Beskrevet er den indirekte metoden, som gir mulighet for signal forsterkning i tilfeller der et sekundært antistoff blir bøyd til et fluorescerende fargestoff (immunofluorescence metode) eller enzym reporter (immunoperoxidase metode). Både kromogen og fluorescerende deteksjonsmetoder besitter fordeler og ulemper. Rapportert i denne protokollen er bruk av IHC, hovedsakelig immunofluorescence, i voksen sebrafisk, en dyr modell mye brukt til å studere systemer som er evolusjonære bevart på tvers av ulike fysiologiske og patologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunoperoxidase protokoll

Merk: sebrafisk ble innhentet av Prof Omid Safari (Department of Fisheries, Fakultet for naturressurser og miljø, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Vev disseksjon
    1. Ofre sebrafisk ved å bli i isvann (5 deler is/1 del vann, 4 ° c); forlate dem til opphør av all bevegelse for å sikre død ved hypoksi.
    2. Fjern raskt tarmen og hjernen med følgende disseksjon metode:
      1. Tørk fisken på et papir håndkle og plassere den sagittally på en dissekere matte, blokkerer den ventrale delen av øyet socket og kjøttfulle del av halen.
      2. For tarmen: Skjær huden og forsiktig fjerne huden og underliggende muskel fra siden av fisken til de indre organene er synlige. Fjern tarmen fra kroppens hulrom strekke den ut.
      3. For hjernen: fjerne hodet med et barberblad. Fjern bløtvev fra ventrale side av skallen med tang. Åpne skallen og fjerne benet fra ventrale siden av hjernen. Fjern hud og skallen bein fra rygg siden av hjernen. Fjern hjernen.
  2. Fiksering av vev
    1. Fest dissekere vev ved nedsenkning i fersk 4% paraformaldeyde (PFA) i fosfat buffer (PB, pH 7,4, 4 ° c) i 3 timer ved romtemperatur (RT).
      1. Forbered 0,1 M PB ved å oppløse 1,755 g av NaH2PO4H2O og 4,575 g av na2HPO4 i 450 ML destillert vann (dH2O), og Juster til en pH på 7,4 med den nødvendige mengden av NaOH 1N.
      2. Forbered 4% PFA oppløsning 4 g PFA i 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4) ved omrøring på en varmeplate. Når en temperatur på 60 ° c nås, tilsett 2-4 dråper NaOH 1N for å få en klar løsning. Venstre PFA 4% ved RT og kontrollere pH. Juster pH til 7,4.
        Merk: vev fiksering for mer enn 4 – 6 h kan føre til overfixation, som masker antigener, begrenser antistoff-epitope binding. Tidspunktet for fiksering avhenger av vevs størrelse.
  3. Innebygging av vev
    1. Skyll vevet 5x i 5 minutter hver, ved nedsenkning i 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Tørke vevet ved påfølgende nedsenking i alkohol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min), og 100% (1 min).
    3. Avklare vev ved nedsenkning i 100% alkohol: xylen (1:1) i 10 min, deretter 2x i xylen i 5 min hver.
    4. Infiltrere vevet med parafinvoks (56 ° c) to ganger for 1 time hver ved direkte nedsenking i parafin.
    5. Bygg inn vevet i para fin blokker ved romtemperatur (RT) og oppbevar ved RT til snitting.
  4. Skjæring av vev
    1. Skjær vev i koronale eller sagittal seksjoner med 8 μm tykkelse med en mikrotomen, og samle delene i annenhver serie på selvklebende glass lysbilder på vannet og varmet ved 38 ° c.
    2. Tørk lysbildene med seksjoner ved 37 ° c over natten.
  5. Deparaffinization og rehydratation av vevs deler
    1. Dewax seksjonene ved nedsenking i xylen i 5 min etterfulgt av nedsenking i xylen i 3 min.
    2. Rehydrate delene ved påfølgende lysbilder nedsenking i alkohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), deretter plassere lysbildene i dH2O (5 min).
      Merk: fullstendig dewax seksjonene før reaksjonen starter. Hvis delene fortsatt har spor av parafin, utføre en ekstra nedsenking i xylen i 5 minutter eller mer.
  6. Antigen henting
    1. Behandle delene med citrate buffer (0,01 M, pH 6,0) ved å fordype lysbildene i løsningen og oppvarming i en mikrobølgeovn i 5 minutter ved maksimal effekt.
    2. La seksjonene avkjøles.
    3. Gjenta syklusen av 5 min i mikrobølgeovnen ved maksimal effekt for å fullføre antigen henting.
      1. Forbered citrate buffer (0,01-M, pH 6,0) ved å oppløse 2,10 g sitronsyre i 100 mL av dH2o og 5,882 g natrium citrate i 200 ml DH2o. bland natrium citrate (0,01 m) med sitronsyre (0,01 m) ved en 1:4 ratio etter volum og Juster pH til 6 bruker HCl 0.1 N.
  7. Blokkering endogene peroksidase
    1. Avgrense vevs området på lysbildene med en løsemiddelbestandig penn.
    2. Skyll avsnittene 3 ganger, 5 min hver, med Tris-bufret saltoppløsning (TBS) (0,1-M, pH 7,3).
      1. Forbered 0,1 M TBS ved å oppløse 12,1 g av trizma base og 9 g NaCl i 950 mL av dH2O og Juster til pH 7,3 med HCL 0.1 n.
    3. Block den endogene peroksidase aktivitet av lysbilder nedsenking i en løsning på 0,75% H2O2 for 5 min på RT.
      1. Klargjør 0,75% H2o2 -løsningen oppløsning 5 ml 30% H2O2 i 195 ml av dH2o.
        Merk: ndogenous enzymer kan reagere med IHC reagenser og gi falske positive resultater. Videre svært vascularized vev uttrykke mange endogene peroksidase, som kan føre til intens uspesifisert farging og bakgrunn nivåer. Behandling med 0,75% H2O2 slukker endogene peroksidase og reduserer den ikke-spesifikke bakgrunnen betraktelig.
  8. Blokkering av ikke-spesifikk Bindi ng nettsteder og vev permeabilization
    1. Ruge vevs delene med TBS/0,4% Triton (TBS-T) blokkerende buffer, som inneholder den primære antiserum (NRS), i 30 minutter ved RT å blokkere ikke-spesifikke bindings områder.
      1. Forbered 0,4% Triton ved oppløsning 0,4 mL av Triton X-100 i 100 mL av TBS.
      2. Klargjør blokkerings bufferen TBS-T-løsning ved å oppløse 1% normal serum i TBS som inneholder 0,4% Triton X-100 (1 mL normal serum + 8,2 mL TBS + 0,8 mL 0,48 Triton X-100).
        Merk: Velg arten av dyret serum avhengig av verten for sekundær antistoff (f. eks, når du bruker en geit anti-kanin sekundær antistoff, bruk normal geit serum).
  9. Vevs inkubasjons med primært antistoff
    1. Ruge seksjonene overnatter i en fuktig boks ved RT med primær antistoffer fortynnet i TBS-T. Stain avsnittene med følgende primære antistoff:
      1. Goat antistoff mot OX-2R utvannet 1:200, som anerkjenner C-terminal av proteinet.
      2. Goat antistoff mot OX-A fortynnet 1:200 [orexin-A (C-19)], som gjenkjenner C-terminalen på proteinet.
        Merk: Sørg for at det primære antistoff reagerer med biomolekyler av interesse. Definer med hvilken epitope av biomolekyler den primære antistoff reagerer ved å bruke gen justeringen. For eksempel har OX-A epitope blitt kartlagt mellom AA 50-100 av menneskelig OX-A (O43612) mens OX-2R epitope har blitt kartlagt nær de siste 50 AA ved C-terminalen av menneskelig.
  10. Vevs inkubasjons med sekundært antistoff
    1. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Ruge seksjonene for 1,5 h ved RT med biotinylated sekundære antistoff og kanin anti-geit immunglobulin (H + L) bøyd med biotin, deretter fortynne 1:100 i TBS-T.
      Merk: test og Finn de ulike fortynninger av både primære og sekundære antistoffer for å finne den optimale fortynning som tillater reduksjon av bakgrunnen.
  11. Peroksidase reaksjon
    1. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Ruge seksjonene med avidin-biotin kompleks (ABC) for 1 t.
      1. Klargjør ABC-løsning som legger til to dråper med komponent A etterfulgt av to dråper med komponent B i 5 mL TBS.
    3. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Behandle seksjonene med kromogen substrat 3, 3 '-diaminobenzidine-4 (DAB).
      1. Klargjør DAB-løsning ved å legge til én dråpe (ca. 30 μL) av DAB-kromogen konsentrat til 1 mL DAB fortynningsmiddel, og bland godt før bruk.
        Merk: Forbered ABC-løsningen minst 30 min før bruk og oppbevar komplekset ved 4 ° c til bruk for å muliggjøre stabil avidin/biotin-binding. Forbered den friske DAB arbeids løsning, gjelder for vev seksjoner, og utvikle til fargen er hensiktsmessig. Når kromogen reaksjonen omdanner det epitope steder å en brun fargen og intensiteten av signalet er passende for tenkelig, gå videre å morgendagen steg. Timing av DAB utvikling kan variere fra noen få sekunder til 10 min. For OX-A og OX-2R 1, er 2 min nok. Håndter DAB med forsiktighet, da det er kreftfremkallende.
  12. Vevs dehydratation og-montering
    1. Skyll alle seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M TBS (pH 7,3) for å stoppe DAB-reaksjonen.
    2. Tørke delene ved påfølgende lysbilder nedsenking i alkohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Avklare skiver ved nedsenkning 2x i xylen 10 min hver.
    4. Monter seksjonene med DPX (dibutyl ftalat xylen) mountant for histologi, og legger to dråper monterings medier til lysbilder og topping langsomt med coverslips.
      Merk: siden nedsenking av vev i økende konsentrasjoner av alkohol under dehydrering resulterer i alkohol inntrengning av vev og utskifting av vann med alkohol, bestemme en presis dehydrering tid og ikke over tørke av vev. Utfør nedsenking i xylen etter dehydrering for å avklare vevet og fjerne overflødig eller gjenværende alkohol.
  13. Kontroller
    1. Gjenta avsnitt 1.1 – 1.12, Utelat primær antistoff og/eller erstatte primær antistoff eller sekundært antistoff IgG ved TBS (negative kontroller).
    2. Gjenta avsnitt 1.1 – 1.12 pre-absorberende hver primære antistoff med et overskudd av den relative peptid (100 mg av peptid/1 mL fortynnet antiserum).
    3. Gjenta avsnitt 1.1 – 1.12 med forskjellig vev som positiv kontroll (f.eks. muse vev).
      Merk: Forbered alle buffere friskt, rett før start. Fjern forsiktig overflødig væske på hvert trinn med en pipette eller filter papir rundt delene, alltid holde delene våte.
  14. Image oppkjøp og analyse
    1. Skaff deg digitale bilder under konstant lys belysning og med samme forstørrelse ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera.
    2. Utfør en semi-kvantitativ analyse av farge intensiteten ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (se tabell over materialer).
      1. Åpne tatt bilder, i. LIF eller TIFF filformat, for å evaluere indekser av OX-A eller OX2-R positivitet.
      2. Velg knappen under mål og klikk på manuell Counting. Telle antall fargede celle profiler direkte fra skjermen ved å plassere et merke på positive celler ved å klikke med musen.
      3. Velg et område av interesse (ROI) området (3 x 103 μm2) for å kvantifisere immunosignal tetthet (optisk tetthet, OD).
      4. Bestem pixel med høyest intensitet (høy positiv) og minst intensitet (negative) inne i analysert bildet for å tildele null som verdien av bakgrunnen (dvs. en del av vev blottet for fargede celler).
      5. Vurder OD ved å arbeide på en logaritmisk skala av absorbansen. I digital bildeanalyse varierer intensiteten på DAB-pikselen fra den mørkeste (0-verdien) til den lyseste (255-verdi) skyggen.
      6. Bestem OD ved å plotte et histogram av følgende: log10(255/i), der "i" er verdien for piksel intensitet gitt av programmet og bestemmes ved å trekke fra bakgrunnen.
        Merk: den permanente og stabile immunoperoxidase reaksjonen kan når som helst analyseres under et mikroskop med lyse felt. Utfør telling av merkede celler i den alternative inndelingen for å unngå dobbelttelling av den samme cellen fra tilstøtende inndelinger.

2. Immunofluorescence protokoll

  1. Vev disseksjon
    1. Ofring og analysere dyrene idet beskrevet inne avdeling 1,1.
  2. Fiksering av vev
    1. Fest tarmen og hjernen ved nedsenkning til 3 timer i 4% PFA ved 4 ° c.
      1. Forbered PB og 4% PFA som i pkt. 1.2.1.
        Merk: fikserings tiden avhenger av vevs størrelsen. Vev fiksering for mer enn 4 – 6 h kan føre til overfixation, som masker antigener og begrenser antistoff-epitope binding.
  3. Innebygging av vev
    1. Skyll vevet 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. For cryoprotection, Overfør vevet til 20% sukrose i PB (0,1 M, pH 7,4) og hold over natten ved 4 ° c. Deretter overfører du vevet til 30% sukrose i 0,1 M PB (pH 7,4) og holder for en ekstra natt ved 4 ° c.
    3. Embed vevet i en blokk med optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte. For å gjøre dette, utarbeide en liten Dewar av flytende nitrogen, ta aluminiumsfolie, og skjær den i to for å lage en panne. Kjelen som inneholder vev fylt med OCT sammensatte må dyppet i flytende nitrogen til OCT sammensatte er avkjølt. Det frosne vevet kan oppbevares ved-80 ° c til snitting.
  4. Skjæring av vev
    1. Overfør de frosne vevs blokkene til en kryostaten ved-20 ° c og skjær i koronale eller sagittal seksjoner på 10 μm.
    2. Samle vev i alternative serielle seksjoner på selvklebende glass lysbilder egnet for immunhistokjemi og lagre dem ved-20 ° c til bruk.
      Merk: Lagre lysbilder mellom-20 ° c og 4 ° c i en mørk lysbilde boks eller lysbilde bok.
  5. Blokkering av ikke-spesifikke bindings områder og vevs permeabilizzation
    1. Avgrense vevs området på lysbildet med et løsemiddel motstandsdyktig penn.
    2. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Ruge seksjonene med 1% normalt esel serum oppløst i permeabilization buffer PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) i 30 min ved RT å permeabilize cellemembranen og blokkere den ikke-spesifikke bindings områder.
      1. Klargjør Triton X-100 0,3% oppløsnings 0,3 mL av Triton X-100 i 100 mL av 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Klargjør blokkerings løsningen oppløsning 1% normalt esel serum i PB inneholdende 0,3% TritonX-100.
        Merk: dyrearter av serum som brukes i permeabilization og blokkering buffere er avhengig av verten for sekundær antistoff.
  6. Inkubasjons med blanding av primære antistoffer
    1. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Ruge seksjonene over natten i en fuktig eske på RT med en blanding av primær antistoffer fortynnet i PB-T. Følgende blandinger av primære antistoffer kan brukes: geit antistoff mot OX-2R fortynnet 1:100/kanin antistoff mot CB1R fortynnet 1:100, eller geit antistoff mot OX-A fortynnet 1:100/kanin antistoff mot CB1R fortynnet 1:100.
  7. Inkubasjons med blanding av sekundære antistoffer
    1. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Ruge seksjonene for 2 t på RT med 1) en blanding av esel anti-kanin Alexa fluor 488-bøyd sekundært antistoff og esel anti-geit Alexa fluor 594-bøyd sekundært antistoff utvannet 1:100 i PB-T; eller 2) en blanding av esel anti-geit Alexa fluor 488-bøyd sekundært antistoff og esel anti-kanin Alexa fluor 594-bøyd sekundært antistoff utvannet 1:100 i PB-T.
      Merk: Bruk sekundære antistoffer utviklet i samme dyr vert. Normal serum må tilhøre samme art av sekundær antistoff (f.eks. Bruk sekundære antistoffer utviklet i esel og et esel normalt serum). Fortynne den primære og sekundære antistoffer med blokkering buffer som inneholder vaskemiddel for å øke celle permeabilization og redusere bakgrunnen.
  8. Montering av vev
    1. Skyll seksjonene 3x i 5 minutter hver, med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Counterstain seksjonene med kjernefysisk fargestoff DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) forberedt oppløsning 1,5 μL av DAPI (1 mg/mL) i 3 mL PB.
    3. Dekkglass lysbilder med festemiddel (se tabell over materialer). Dette vandige festemiddelet stabiliserer vevsprøven og flekkene for langvarig bruk. Fluorescerende prøver kan oppbevares i mørket ved 4 ° c. For å forlenge levetiden til fluorofores, bruk et antifed festemiddel.
      Merk: Velg et godt festemiddel. En av de viktigste parametrene for montering agenter er brytningsindeks (nD), som bør være rundt 1,5, den brytningsindeks av glass. Monterings mediet som brukes her, kan brukes spesielt med prøve klargjort for enzym-og lipid-bestemmelser (dvs. prøve som ikke må være dehydrert med en stigende serie av alkohol).
  9. Kontroller
    1. Gjenta seksjoner 2.1 – 2.8, Utelat primær eller sekundær antistoff, eller erstatte i det spesifikke trinnet den primære eller sekundære antisera med PB (negativ kontroll).
    2. Gjenta seksjoner 2.1 – 2.8, pre-absorberende hver primære antistoff med et overskudd av den relative peptid (100 mg av peptid/1 mL av fortynnet antiserum).
    3. Gjenta seksjoner 2.1 – 2.8 på skiver av mus hjernen (positiv kontroll).
      Merk: Forbered alle buffere friskt, rett før start. Fjern overflødig væske forsiktig på hvert trinn med en pipette eller filter papir rundt delene, alltid holde delen fuktig.
  10. Bildeoppkjøp
    1. Bruk et konfokalmikroskopi mikroskop utstyrt med en x-y-z motorisert scene, digitalkamera, og oppkjøp og bildeanalyse programvare som NIS-Elements C å observere og analysere immunostained seksjoner. Tilegne seg digitale bilder ved hjelp av 5-20-40x mål.
    2. Ta bilder av hver del ved lav forstørrelse (10x eller 20x objektiv) i hver av de tilgjengelige kanaler for å komponere en lav forstørrelse montasje, som gir en oversikt over hele regionen for å lette lokalisering og dokumentasjon av okse-2R/CB1R anatomiske co-uttrykk. Normalisere fluorescens bilder til maksimal kontrast og overlegg før analysen.
    3. Samle seriell Z-stabler av bilder i hele området av interesse. Hent bildene gjennom seks fokal fly (Z-trinn) med fokus trinn på 1 – 1,8 μm for å dekke vevs volumet der okse-2R/CB1R-coexpression er i en gul puncta. For å gjøre denne samlingen for hver kanal (rød, grønn, blå) separat, ved hjelp av et Z-motorisert mikroskop.
    4. Bruk en tenkelig deconvolution programvare for å deconvolve bilder ved anvendelse av ti gjentakelser og skjule de serielle Z flybilder i ett maksimalt projeksjonsbilde.
    5. Juster micrographs for lys og kontrast ved hjelp av Adobe Photoshop 6,01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      Merk: Utfør det deconvolution trinnet under observasjon for å redusere bakgrunnen ytterligere. Begrens lysbilde eksponeringen til lys for å forhindre photobleaching.
  11. Image analyse
    1. Utfør kvantitativ analyse av OX-2R/CB1R coexpression på vekslende 10 μm tykke seksjoner (n = 5 dyr per gruppe) ved å dekke hele regionen av interesse for hvert dyr.
    2. Kvantifisere OX-2R/CB1R coexpression som antall gule positive puncta med et semiautomated system av bildeanalyse. Imagins programvare kan gi et høyere detaljnivå, med kvantitative data om regionene overlapping mellom ulike fluorescerende sonder.
    3. Kvantifisere puncta ved hjelp av terskelverdi verktøy for signal intensitet i de to kanalene. Åpne filen. liff,. TIFF eller. jpg-bilder, og velg bilde-terskel. Velg automatisk innstilling eller Manuell metode og regulere terskelen til alle farget puncta er valgt. Analyser fordelingen av piksel intensiteten i et område av bildet som ikke inneholder noen immunolabelled objekter for å oppnå bakgrunns terskelen. Bestem denne bakgrunnen individuelt for hvert bilde. Programmet fjerner deretter bakgrunns terskelen ved å angi en grunnlinje for piksel intensitet til bakgrunns verdien.
    4. Velg analyser – mål og velg parametrene som skal måles (puncta intensitet-minimum, maksimum og gjennomsnittlig verdi; antall/tetthet av immunolabelled puncta).
    5. Tell den gule puncta langs volumet av vevet i 4 Z-stabler for hver del, ved hjelp av stabler rett over eller under til det beste fokuset flyet. Ekskluder områdene utenfor fokus fra analysen.
      Merk: Utfør telling av navngitte celler på den alternative delen for å unngå dobbelttelling av de samme cellene fra adjacents seksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative data for immunoperoxidase flekker er vist i figur 1 og figur 2. Immunhistokjemiske analyse av OX-A og okse-2R distribusjon i tarmen av voksen sebrafisk viste ulike lokalisering steder av OX-A og okse-2R og deres øker i uttrykket i tarm celler av DIO sebrafisk. En intens brun farging for OX-A ble observert i cellene i midtre og fremre tarmen (figur 1a, A1). Immunoexpression av okse-A ga klare signaler i de forskjellige gut compartements, synkende fra fremre mot midtre tarmen (figur 1B, B1). Den negative kontrollen ble brukt som en referanse for bakgrunnen og for å bekrefte spesifisitet av OX-A signal (figur 1e). Langvarig eksponering for kromogen DAB resulterte i økningen av bakgrunns intensiteten (figur 1d). Lignende resultater ble observert for OX-2R immunoexpression i tarmen til DIO og kontroll diett sebrafisk (figur 2). En økt OX-A signal i DIO voksen sebrafisk ble ledsaget av overuttrykte av okse-2R i andre intestinal compartements (figur 2b, B1).

Ved hjelp av immunofluorescence ble data innhentet av immunoperoxidase analyse bekreftet, underliggende økningen av okse-A og okse-2R uttrykk i tarmen til voksen DIO sebrafisk med hensyn til kontroll (Figur 3). Videre bruker dobbel immunofluorescence, var det mulig å få informasjon om uttrykket av endocannabinoid reseptoren CB1R og dens co-lokalisering med OX-A eller OX-2R i tarmen og hjernen av kontroll kosthold og DIO voksen sebrafisk. Fordelen med immunofluorescence er at det gir et mer detaljert signal med mindre gitt informasjon om vev morfologi, sammenlignet med immunoperoxidase teknikk. Ved hjelp av immunofluorescence metoden, har vi tidligere bestemt anatomiske interaksjoner mellom OX-2R og CB1R i både tarmen og hjernen10.

Den nøyaktige analysen av immunofluorescent bilder viste økningen av okse-2R/CB1R co-lokalisering i tarmen av DIO voksen sebrafisk sammenlignet med kontroll dietten sebrafisk (figur 3b, C). En lignende situasjon ble observert i forskjellige hjerneregioner, som rygg Telencephalon, hypothalamus (lateral, ventrale og rygg soner), optikk tectum, Torus lateralis og diffus kjerne av den underlegne fliken (Figur 4). Den negative (figur 5a, B) og positiv (mus hjerne) (figur 5c) kontroller ble brukt som referanser for bakgrunnen og for å bekrefte spesifisitet av CB1R og Ox-2R signaler.

Videre, ved dobbelt immunostaining med OX-A/CB1R, ble det observert i orexinergic neurons av hypothalamus at det var en økning på co-lokalisering ledsaget av en økning av OX-A fluorescerende signal (figur 6). Disse resultatene viser hvordan doble immunofluorescence kan bidra til å identifisere fysiologisk bevarte protein uttrykk, co-lokalisering av mål proteiner, og deres distribusjon og/eller uttrykk endringer i ulike patologiske tilstander.

Figure 1
Figur 1: orexin immunolocalization i tarmen av CASSIUS vs kontroll kosthold voksen sebrafisk. (A) okse-en immunoreactivity i cellene i midtre tarmen av kontroll diett sebrafisk. (A1) OX-A-immunoreactivity i cellene i midtre tarmen til DIO sebrafisk. (B) okse-A immunoreactivity i cellene i fremre tarmen av kontroll diett sebrafisk. (B1) OKSE-A immunoreactivity i cellene i fremre tarmen av DIO sebrafisk. (A1, B1) En økning av OX-A positive celler i forskjellige vev compartement av midtre og fremre tarmen av DIO sebrafisk. (C) okse-A immunoreactivity i cellene i fremre TARMEN av DIO sebrafisk. (D) immunoperoxidase reaksjon for Ox-A etter en langvarig eksponering for DAB. (E) negativ kontroll. Scale bar: 50 μm (A, A1, B, b1); 100 μm (C, D, E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Orexin 2 reseptor immunolocalization i tarmen av DIO g. Control diett voksen sebrafisk. (A) okse-2R immunoreactivity i cellene i midtre tarmen av kontroll diett sebrafisk. (A1) OKSE-2R immunoreactivity i cellene i midtre tarmen til DIO sebrafisk. (B) okse-2R immunoreactivity i cellene i fremre tarmen av kontroll diett sebrafisk. (B1) OKSE-2R immunoreactivity i cellene i fremre tarmen av DIO sebrafisk. (A1, B1) En økning av okse-2R positive celler i forskjellige vev compartement av midtre og fremre tarmen av DIO sebrafisk. Scale bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Fordeling av okse-A (grønn)/CB1R (rød) og Ox-2R (Red)/CB1R (grønn) og deres co-lokalisering med Ox-2R/CB1R (gul) i tarmen av DIO g. Control diett voksen sebrafisk. (A) okse-A/CB1R co-uttrykk i tarmen av kontroll diett voksen sebrafisk. (B) okse-2R/CB1R co-uttrykk i tarmen av kontroll diett sebrafisk. (C) okse-2R/CB1R co-uttrykk i TARMEN til DIO voksen sebrafisk. En økning av OX-2R/CB1R co-lokalisering (gule prikker) i tarmen av DIO sebrafisk. Scale bar: 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Fordeling av okse-2R (rød) og CB1R (grønn) og deres co-lokalisering med Ox-2R/CB1R (gul) i hjernen koronale deler av DIO vs kontroll kosthold voksen sebrafisk. (A) okse-2R/CB1R co-uttrykk i Telencephalon av kontroll dietten sebrafisk. (A1) OX-2R/CB1R co-uttrykk i Telencephalon av DIO sebrafisk. (B) okse-2R/CB1R co-uttrykk innenfor lateral, ventrale og rygg sone av hypothalamus, optikk tectum, Torus lateralis, diffus kjernen av dårligere flik av kontroll diett sebrafisk (B1) okse-2R/CB1R co-uttrykk innenfor lateral, ventrale, og rygg soner av hypothalamus, optikk tectum, Torus lateralis, og diffus kjerne av den underlegne flik av DIO sebrafisk. (C) høyere forstørrelse av optisk tectum viser co-uttrykk for Ox-2R/CB1R (gul) i kontroll dietten sebrafisk. (C1) Høyere forstørrelse av den optiske tectum som viser co-uttrykket av OX-2R/CB1R (gul) i DIO-sebrafisk. (D) en spesiell av optisk tectum som viser fordelingen og co-uttrykk for Ox-2R/CB1R (gul) i DIO sebrafisk. DAPI (blå) ble brukt til å counterstain kjerner. CP: sentrale bakre thalamic nucleus; Dd: rygg; DC: sentralt; Dl: lateral; DM: midtre; DP: bakre del av rygg Telencephalon; HD: rygg sone av periventrikulær hypothalamus; Hv: ventrale sone av periventrikulær hypothalamus; LH: lateral del av hypothalamus; PGl: lateral og PGm: midtre preglomerular kjerner; PGZ: periventrikulær grå sone av den optiske tectum; TeO: optikk tectum; TL: Torus longitudinalis; VD: rygg del av ventrale Telencephalon. Scale bar: 50 μm (A, A1, c, c1); 250 μm (B og B1); 25 μm (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Ox-2R og CB1R protein uttrykk og spesifisitet i voksen hjerne av sebrafisk og mus hippocampus. (A) negativ kontroll av okse-2R ved pre-absorpsjon med den relative peptid. (B) negativ kontroll av CB1R ved pre-absorpsjon med den relative peptid. (C) positiv kontroll av Ox-2R/CB1R i hippocampus mus. PGZ: periventrikulær grå sone av den optiske tectum; TeO: optikk tectum. Vektstang: 100 μm (A, B); 250 μm (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: fordeling av Ox-A (grønn) og CB1R (rød) og deres co-lokalisering med Ox-A/CB1R (gul) i hypothalamus koronale deler av DIO vs kontroll kosthold voksen sebrafisk. (A) okse-a/CB1R co-uttrykk i hypothalamus av kontroll diett sebrafisk (a1) høyere forstørrelse viser Ox-a/CB1R co-uttrykk innenfor lateral hypothalamus. Detaljer om okse-A/CB1R co-uttrykk som viser en antatte tilstøtende lokalisering av okse-A/CB1R eller co-lokalisering og overlapping av okse-A/CB1R i de samme cellene. (B) okse-a/CB1R co-uttrykk i HYPOTHALAMUS av DIO sebrafisk (B1) høyere forstørrelse viser økt okse-a/CB1R co-uttrykk innenfor lateral hypothalamus. Detaljer om okse-A/CB1R co-uttrykk som viser en antatte tilstøtende lokalisering av okse-A/CB1R eller co-lokalisering og overlapping av okse-A/CB1R i de samme cellene. LH: lateral del av hypothalamus. Vektstang: 50 μm (A, B); 25 μm (A1, B1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksempel på tilberedning

Forberedelse av prøver er det første kritiske trinnet i IHC. En pålitelig protokoll tillater vedlikehold av celle morfologi, vevs arkitektur og antigenisiteten. Dette trinnet krever riktig vevs oppsamling, fiksering og snitting22,23. Formålet med fiksering er å bevare vev og redusere virkningen av vev enzymer eller mikroorganismer. Spesielt bevarer fikserings trinnet cellulære komponenter og biomolekyler, forhindrer autolyse og forskyvning av celle bestanddeler (som antigener og enzymer), stabiliserer cellulære materialer mot aversive virkninger av følgende prosedyrer, og forenkler immunostaining4,7,24.

Før snitting, vevet er forberedt og bevart gjennom parafin embedding (immunoperoxidase metode) eller embryo (frysing i cryomedia, i flere immunofluorescence metoder). Bevarings metoden er knyttet til type fiksering7. Etter fiksering og bevaring, er vevet skiver av en mikrotomen Hvis innebygd i parafin, eller ved en kryostaten Hvis innebygd i en cryomedia. Vev er vanligvis skiver på en tykkelse utvalg av 8-10 μm og montert på lysbilder. For immunoperoxidase farging kan prøven kreve ytterligere trinn for å avsløre epitopes for antistoff binding, inkludert deparaffinization og antigen retrieveal25,26. Det bør holdes i bakhodet at overfixation kan forårsake epitope maskering, mens underfixation kan føre til lite eller ingen positive signal med tunge kanten flekker.

Blokkering og bakgrunns reduksjon

I immunoperoxidase-metoden, er den høye affinitet av avidin for biotin trolig ansvarlig for den raske produksjonen av bakgrunnen flekker. Videre, siden avidin-biotin reaksjonen er irreversible, kan bakgrunnen ikke fjernes18,27. Under IHC, høy bakgrunn kan også produseres ved uspesifisert binding til endogene vevet biotines. Hydrofobe og ioniske interaksjoner (for eksempel de som produseres av kollagen og andre bindevev som epitel og adipocytter), samt endogene enzym aktivitet, er viktige årsaker til bakgrunns farging. Endogene biotin eller enzymer og hydrofobe binding må minimeres før antistoff farging, som kan oppnås ved tilsetning av et vaskemiddel, for eksempel Triton X-100, i blokkering buffere28.

Bruken av 0,3%-0,4% Triton X-100 i blokkerings buffere gir også mulighet for full permeabilization av antistoffer i vevs seksjoner. Videre, selv om antistoffer er fortrinnsvis spesifikke for en epitope, delvis binding til nettsteder på ikke-konkrete proteiner er mulig, noe som fører til høy bakgrunn farging29. De ikke-spesifikke bindingene kan maskere signalet for mål antigen30. For å redusere ikke-spesifikke bakgrunns flekker, bør prøver være inkubert med en buffer som blokkerer ikke-spesifikke reaktive områder. Vanlige blokkerende buffere inkluderer normalt serum eller storfe serum albumin30. Arten av blokkering serum bør være den samme som vert for sekundær antistoff. Det anbefales å finne den beste inkubasjonstiden. Konsentrasjonen av det normale serum i blokkerings bufferen er en annen viktig bestemmelse31. Videre, for å eliminere bakgrunnen farging, er det avgjørende å bruke optimal fortynning av den primære og sekundære antistoffer. Dermed må inkubasjonstid velges nøye, i tillegg til temperaturen (dvs. øke tiden hvis du utfører ved 4 ° c, redusere tiden hvis på RT) og deteksjons system.

Antistoff valg

Valget av antistoffer for IHC farging er viktig og kan påvirke det eksperimentelle utfallet32. For å sikre at antistoff vil reagere hensiktsmessig, må epitope gjenkjennes av det vurderes. Forstå målet protein og dens funksjon, vev og subcellulære lokalisering, og om det gjennomgår post-translational modifikasjoner kan bidra til å bestemme valg av antistoff. Et annet viktig trinn er testing av ulike konsentrasjoner av primær/sekundær antistoff for å holde bakgrunnen og aspecificity på et minimum nivå kompatibel med et bestemt signal. Videre er det viktig å sjekke arter reaktivitet å bekrefte primære og sekundære antistoff kompatibilitet og evnen til primære antistoff å anerkjenne antigen målet i sin opprinnelige konformasjon. Et annet viktig skritt for primær antistoff valg er Gen justering. Dette sikrer at det primære antistoff reagerer med biomolekyler av interesse og gir informasjon om hvilke epitope som gjenkjennes av antistoff i en bestemt dyremodell. Gene justering gir også muligheten til å velge antistoffer i stand til å gjenkjenne epitopes som er evolusjonære bevart.

Kontroller

For å avklare spesifisitet av antistoffer, et viktig aspekt er ytelsen av kontrollene, som tillater påvisning av spesifikke flekker. Kontrollene inkluderer: i) et vev kjent for å uttrykke antigen som en positiv kontroll; II) en vev kjent for ikke å uttrykke antigen som en negativ kontroll; III) unnlatelse av primær antistoff eller absorpsjon av primær antistoff med en bestemt peptid for å bekrefte at sekundær antistoff ikke crossreact med andre vevs komponenter14,33.

I IHC teknikker, kan flere trinn forårsake problemer før den endelige farging. Sterk bakgrunn flekker og ikke-spesifikk målet antigen farging kan være forårsaket av endogene biotin eller primær/sekundær antistoff kryss-reaktivitet og dårlig enzym aktivitet eller primære antistoff potens, henholdsvis. Bakgrunns farging og ikke-spesifikk binding kan forebygges ved å blokkere de endogene enzymene før inkubasjons med det primære antistoff. Bruk av normalt serum er den beste måten å blokkere ikke-spesifikke interaksjoner30. Valget av blokkerings bufferen avhenger av metoden for påvisning som brukes. Videre, et vev kjent for å mangle uttrykk for målet antigen som negativ kontroll kan fungere som referanse for å bestemme mengden av bakgrunnen farging34. Deponering av kromogen eller fluorescerende signal i negativ kontroll bekrefter tilstedeværelsen av uspesifisert farging. Videre, utilstrekkelig blokkering tid blokkerer fører til en høy bakgrunn, mens overdreven blokkering fører til et lavt signal35.

I immunoperoxidase flekker, er tilstedeværelsen av endogene peroksidase i vevet en annen årsak til brun bakgrunn deponering. Behandlingen med H2O2 før inkubasjons med primær antistoff blokkerer den endogene peroksidase36,37. Tvert imot, i immunofluorescence, spiller fiksering en nøkkelrolle i generering av autofluorescence. For å unngå autofluorescence, den beste fiksering metode, tid for fiksering, og utarbeidelse av vev må nøye valgt. Et annet kritisk trinn i IHC er validering av det primære antistoff. Et antistoff anses som gyldig hvis det produserer en konsistent og spesifikk farge mønster i en bestemt vev eller celle/subcellulære komponenter og hvis pre-absorpsjon av primære antistoff med en bestemt peptid ikke gir flekker38. I immunofluorescence viser ikke-spesifikk binding lignende fluorescerende intensitet under tre farge fluorescens detektorer, mens signalet er variabelt siden forskjellige fluorescerende bøyd sekundære antistoffer brukes. Disse aspektene av IHC vevs forberedelser og antistoff farging må rettes for å overkomme flekker problemer.

IHC, men en relativt enkel teknikk, presenterer noen begrensninger og er avhengig av mange faktorer39. En av de avgjørende punktene er formalin fiksering, som kan endre uttrykk for post-oversettelse modifiserte proteiner. På den annen side, formalin-fast parafin-embedded vev kan lagres på lang sikt ved romtemperatur, mens frosset vev kan bare oppbevares i opptil ett år ved-80 ° c. Videre kan frosset vev skades av dannelsen av iskrystaller, som kan påvirke subcellulære detaljer endre IHC farging40,41. Når det gjelder studiene, var det vanskeligste aspektet å finne spesifikke primære antistoffer mot sebrafisk molekyler. Selv om sebrafisk har blitt anerkjent som en gyldig dyremodell med en svært bevart grad av struktur, er det utviklet svært få antistoffer som kan gjenkjenne spesifikke proteiner og andre molekyler i sebrafisk. For å overkomme disse begrensningene er det viktig å validere antistoff spesifisitet ved vestlig blotting analyse og gen justering.

Økende interesse for IHC metoder har ført til utviklingen av svært spesifikke immunostaining som kan hjelpe undersøkende studier42. IHC brukes med økende frekvens for å identifisere tilstedeværelsen av spesifikke molekylære markører og deres endringer på tvers av ulike patologi. De to tilnærmingene illustrert her, immunoperoxidase og immunofluorescence, har respektive fordeler og ulemper43. Parafin-embedded vev, som brukes i immunoperoxidase teknikk, kan tillate høy oppløsning av celler og vev og avdekke detaljer om fordelingen og mengden av mål proteiner44,45. Men parafin-embedded vev er ikke egnet for immunofluorescence, siden parafin kan maskere antigenisiteten og føre til uspesifisert fluorescens46. På den annen side, bevarer cryosection av PFA-fast vev endogene antigenisiteten og føre til en nedgang i uspesifisert fluorescens. Selv om den tekniske kvaliteten på cryosections er mye lavere enn for parafin-embedded vev, kan de gi gyldige resultater ved hjelp av IHC Technique47.

Videre, mens parafin embedding bedre bevarer morfologiske detaljer, kryonisk bevaring bedre bevarer enzymet og antigen uttrykk, noe som fører til mer detaljert immunostaining. Den immunofluorescence teknikken gjør det også mulig for moderne påvisning av to eller tre forskjellige biomolekyler, avslørende mulige interaksjoner, som illustrert i vårt tidligere arbeid for orexin og endocannabinoid systemer10. Blant de teknikkene som brukes til å oppdage fordelingen og nivåer av spesifikke biomolekyler, IHC tillater ikke bare fastsettelse av spesifikke morfologiske uttrykk og distribusjon av molekyler og proteiner, men også muligheten til å utføre kvantitative Analyse.

Ved hjelp av immunofluorescence, codistribution og coexpression av biomolekyler kan også bli ytterligere forstått, så vel som mulige interaksjoner og deres endringer i tilfeller av ulike patologi48. Konfokalmikroskopi mikroskopi, i løpet av de siste 20 årene, har ofte blitt brukt til å studere mobilnettet og subcellulære fordeling av mange proteiner i pattedyr hjernen. Fluorescens mikroskopi også tillater visualisering (ved hjelp av fluorophores eller fluorescerende fargestoffer) av bestemte strukturer av interesse, for eksempel proteiner, organeller, og andre biologiske saken; slike signaler kan brukes i både faste og levende biologiske systemer til bilde spesifikke subcellulære strukturer49. Den potensielle modulatory funksjonen til biomolekyler i spesifikke celle rom kan utforskes via visualiseringen av deres uttrykks mønstre, mens rollen til protein signalering i vevet kan bli avdekket via den nevroanatomi fordelingen av Metabolsk enzym uttrykk eller reseptorer.

Den presenterte tekniske arbeidet introduserer IHC tilnærminger, hovedsakelig immunofluorescence, til å studere to høyt bevarte systemer, orexin og endocannabinoid, i en voksen sebrafisk modell. Spesielt kan immunofluorescence metoder brukes til å bestemme fordelingen, relative beløp, og anatomiske interaksjoner av spesifikke proteiner i målet vev. Kryonisk bevaring av PFA-faste vev bevarer bedre svært følsomme proteiner som er mottakelige for rask forverring. Videre er kryonisk bevaring antatt å bedre bevare antigen og antigenisiteten, og det gir mulighet for studier av post-oversettelse modifiserte proteiner og DNA.

Selv om frosset vev (i forhold til parafin-embedded seksjoner) er tykkere, noe som hemmer evnen til å observere vev morfologi i detalj, konfokalmikroskopi mikroskopi gir mulighet for prøven visualisering i stor detalj og forbedrer bildebehandling evner. Videre kan immunofluorescence brukes til kvantitativ analyse av farge intensitet, og densitometric analyse av signalet gir kvantitative data. Dette gjør det mulig for å bestemme sammenhenger av fluorochrom signal nivåer med protein uttrykk nivåer ved å se på områder av co-lokalisering. Dette arbeidet beskriver og illustrerer protokoller som kan brukes til å studere evolusjonære bevaring av viktige proteiner i den voksne sebrafisk. Bruken av IHC, hovedsakelig immunofluorescence, i voksen sebrafisk kan bidra til å fremheve nytten av denne dyre modellen ved å studere morfologiske uttrykk og distribusjon av svært bevarte biomolekyler, samt avdekke mulige endringer på tvers av ulike patologiske tilstander samkjøre med humant physiopathology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universitetet i Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Biokjemi immunhistokjemi immunoperoxidase orexin reseptor endocannabinoid reseptor sebrafisk hjernen sebrafisk tarmen
Identifisering av orexin og Endocannabinoid reseptorer i Adult sebrafisk bruke Immunoperoxidase og Immunofluorescence metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter