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Bioengineering

विस्तारित क्षेत्र के दृश्य एकल अणु इमेजिंग के लिए एक उच्च इच्छुक बह टाइल माइक्रोस्कोप बनाने के लिए एक गाइड

Published: April 8, 2019 doi: 10.3791/59360
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1CREOL, The College of Optics and Photonics, University of Central Florida, 2Andor Technology, Oxford Instruments

Summary

एक विस्तृत अनुदेश एक उच्च झुका हुआ टाइल (HIST) माइक्रोस्कोप और एकल अणु इमेजिंग के लिए इसके उपयोग का निर्माण करने के लिए कैसे पर वर्णन किया गया है ।

Abstract

एकल अणु इमेजिंग ने जैविक अध्ययनों में आणविक तंत्रों की हमारी समझ को काफी उन्नत किया है । हालांकि, यह बड़े क्षेत्र के देखने के लिए चुनौतीपूर्ण है, मोटी कोशिकाओं और ऊतकों में उच्च विपरीत छवियों । यहां, हम अत्यधिक इच्छुक बह टाइल (HIST) माइक्रोस्कोपी कि इस समस्या को काबू करने परिचय । बेलनाकार लेंस की एक जोड़ी एक लंबी उत्तेजना बीम कि एक तेजी से galvo दर्पण के माध्यम से एक बड़े इमेजिंग क्षेत्र पर स्कैन किया गया उत्पंन करने के लिए लागू किया गया था । एक 4एफ विंयास ऑप्टिकल घटकों की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर कैमरा ने प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाया और बीम के साथ सिंक्रनाइज़ गतिशील संनाभि झिरी के साथ बाहर की फोकस पृष्ठभूमि को अवरुद्ध किया । हम सभी बुनियादी घटकों के साथ हिस्ट माइक्रोस्कोप के निर्माण पर एक कदम दर कदम निर्देश प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग कई जैविक अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो ultrastructures, गतिशीलता और जैव अणुओं की मात्रा1,2,3प्रकट करते हैं । हालांकि, यह कोशिकाओं या ऊतकों के अंदर एकल अणुओं का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है । जबकि संनाभि माइक्रोस्कोपी उच्च परिच्छेदन क्षमता4प्रदान करता है, यह उच्च उत्तेजना तीव्रता या धीमी इमेजिंग गति से गंभीर photoब्लीचिंग के कारण एकल अणु इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है । Widefield माइक्रोस्कोपी कमजोर रोशनी का उपयोग करता है, लेकिन पृष्ठभूमि अनुपात (SBR)5के लिए एक गरीब संकेत से ग्रस्त है । प्रकाश-चादर माइक्रोस्कोपी, दूसरी ओर, अच्छा परिच्छेदन और कम photoब्लीचिंग6दिखा सकता है; हालांकि, उपलब्ध संख्यात्मक एपर्चर (एनए) बहुत orthogonally रखा उद्देश्य7की आवश्यकता द्वारा सीमित है । वैकल्पिक रूप से, यह विशेष प्रकाशक और नमूना मंडलों8,9की आवश्यकता है ।

इन कारणों के लिए, उच्च झुका और परतदार ऑप्टिकल शीट (HILO) माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से 3 डी एकल अणु इमेजिंग10के लिए इस्तेमाल किया गया है । जब एक झुका बीम दो मीडिया के एक अंतरफलक के सामने (कांच और पानी, उदाहरण के लिए), किरण है Snell कानून के अनुसार पुनः खंडित है । महत्वपूर्ण रूप से, रिफ्रैक्टेड बीम पतले हो जाता है, और इसकी मोटाई dz = R/tan (θ) के रूप में वर्णित है जहां R प्रवृत्त बीम का व्यास है और θ पारेषित बीम का अपवर्तन कोण है । यह सरल कार्यांवयन एक अच्छा परिच्छेदन क्षमता में परिणाम है । फिर भी, यह संबंध इंगित करता है कि एक पतली रोशनी (यानी, उच्च परिच्छेदन क्षमता) एक छोटे R और/या एक बड़े θ की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, जब R = 20 μm और θ = ७२ अंश, एक dz = ६.५ μm प्राप्त कर सकते हैं । के बाद से वहां के लिए अपवर्तन कोण में वृद्धि करने के लिए एक व्यावहारिक सीमा है ताकि गहरी छवि के अंदर कोशिकाओं और कुल आंतरिक प्रतिबिंब से बचने के लिए, वहां एक मजबूत युग्मन प्रकाश व्यास और बीम मोटाई की है । इस कारण से, HILO इमेजिंग एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र के दृश्य (FOV) है कि बहुत बहुकोशिकीय इमेजिंग में अपने अनुप्रयोगों को प्रतिबंधित दिखाता है ।

हाल ही में, हम अत्यधिक इच्छुक बह टाइल (HIST) माइक्रोस्कोपी जहां FOV एक बहुत ही सरल तरीके से11बीम मोटाई से decoupled है द्वारा इस समस्या को दूर किया है । सबसे पहले, एक दिशा में लम्बी बीम बेलनाकार लेंस की एक जोड़ी के माध्यम से उत्पन्न होता है । इस बीम, एक टाइल के रूप में कहा जाता है, dz के साथ एक पतली रोशनी का उत्पादन ~ 4 μm जबकि इसके FOV १३० x 12 μm2है । फिर, टाइल एक घूर्णन galvo दर्पण का उपयोग कर नमूना भर में बह रहा है । इस बीच, प्रतिदीप्ति छवि एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (scmos) कैमरा है कि फिल्टर कुशलता से बाहर का ध्यान केंद्रित पृष्ठभूमि में एक रोलिंग शटर मोड जो स्वरित्र संनाभि भट्ठा का पता लगाने के रूप में कार्य करता है पर दर्ज की गई है । इस तरह, HIST माइक्रोस्कोपी देखने का एक बड़ा क्षेत्र के साथ एकल अणु इमेजिंग सक्षम बनाता है (~ १३० x १३० μm2) और hilo इमेजिंग से एक पतली रोशनी । हम इस नए इमेजिंग तकनीक कोशिकाओं में एक जांच के साथ या माउस मस्तिष्क के ऊतकों, जो जीन अभिव्यक्ति और रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है में कुछ जांच के साथ आरएनए टेप का पता लगाने के लिए आवेदन किया । अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, HIST एक अतिरिक्त प्रकाशक या दूरदराज के पता लगाने के उद्देश्यों के बिना केवल एक ही उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य कार्यरत हैं और उल्टे सूक्ष्मदर्शी के साथ पूरी तरह से संगत है । एक बड़े FOV और उच्च कंट्रास्ट के साथ साथ ये लाभ जीव विज्ञान और चिकित्सा में एक प्रमुख उपकरण HIST माइक्रोस्कोपी कर देगा । हम HIST माइक्रोस्कोप के इंस्ट्रूमेंटेशन के बारे में विस्तृत निर्देश मौजूद है, और कैसे परीक्षण और नीचे के रूप में अपने प्रदर्शन जांचना ।

Protocol

1. माइक्रोस्कोप, लेज़रों और संरेखण उपकरण की स्थापना

  1. माइक्रोस्कोप के निर्माण से पहले, सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध के रूप में प्रकाशिकी, optomechanics और इलेक्ट्रॉनिक्स सहित सभी आवश्यक घटक तैयार करते हैं ।
  2. मुख्य रूप से दो भागों से बना एक माइक्रोस्कोप शरीर तैयार: एक RMS-लड़ी पिरोया बंदरगाह और एक piezo चरण एक एल्यूमीनियम ब्लॉक पर घुड़सवार के साथ एक उद्देश्य धारक (चित्रा 1ए) ।
    नोट: कस्टम निर्मित माइक्रोस्कोप शरीर की सुविधा और12इंस्ट्रूमेंटेशन के लचीलेपन के लिए प्रयोग किया जाता है । किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप शरीर को हिस्ट माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. एकाधिक लेजर लाइनों के संयोजन और एक एकल मोड फाइबर के लिए उन्हें युग्मन
    1. ऑप्टिकल मेज पर ४०५, ५६१, ६३८ एनएम लेजर स्थापित करें और एक ध्रुवीकरण बीम अलगानेवाला के माध्यम से मुस्कराते हुए गठबंधन और चित्रा 1बीमें दिखाया गया है के रूप में एक लंबे समय से गुजारें dichroic दर्पण । सुनिश्चित करें कि सभी लेजर बीम संरेखण उपकरण पर pinholes के माध्यम से गुजरती हैं । पावर समायोजन के लिए आधा वेव प्लेट्स डालें ।
      नोट: नेत्र संरक्षण के लिए सुरक्षा चश्में पहनते हैं और अवांछित लेजर बीम को अवशोषित करने के लिए बीम-ब्लॉक्स का उपयोग करते हैं ।
    2. एक फाइबर युग्मन लेंस स्थापित (एफ = ४.५ मिमी) और एक फाइबर एडाप्टर जेड में आयोजित एक पिंजरे प्रणाली के साथ अक्ष अनुवादक.
    3. फाइबर एडाप्टर के लिए एक बहुपद्वति फाइबर (MMF, Ø ६२.५ μm) कनेक्ट करें । प्रत्येक लेजर की युग्मन क्षमता ९५% से अधिक है जब तक स्टीयरिंग मिरर और जेड अनुवादक की प्रत्येक जोड़ी को समायोजित करें । आउटपुट बीम एक के पास gaussian के आकार का प्रोफाइल के साथ बिंदु पैटर्न है ।
    4. दूर बहुपद्वति फाइबर ले लो और एक एकल मोड फाइबर (smf) कनेक्ट. MMF, ठीक धुन और तीन लेजर के युग्मन दक्षता को अधिकतम करने के लिए इसी तरह ।
  4. एक संधानिक प्रकाश स्रोत है कि उत्तेजना और पता लगाने के रास्तों में बीम संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा इकट्ठा । यह डिवाइस एक अस्थाई सुसंगत प्रकाश स्रोत (५६१ एनएम) SMF, फाइबर एडाप्टर, अवर्णक लेंस (एफ = ६० मिमी), आइरिस और Ø1 "एक पिंजरे प्रणाली में ट्यूब स्पेसर (चित्रा 1सी) से जुड़ा से बना है । फाइबर एडाप्टर और लेंस के बीच दूरी समायोजित एक बाल काटना इंटरफेरोमीटर का उपयोग करने के लिए टकराव सुनिश्चित करने के लिए ।
  5. एक बीम संरेखण उपकरण तैयार (चित्रा 1डी) । इस ऑप्टिकल मेज, जो जल्दी और सटीक बीम संरेखण के लिए अनुमति देता है की सतह से 2 "ऊंचाई पर pinholes के साथ एल्यूमीनियम पदों की एक जोड़ी है ।
  6. एक डबल पिनहोल प्रणाली है जो दो Ø1 "प्रत्येक के अंत में जमीन ग्लास संरेखण डिस्क और दो Ø1" लेंस ट्यूबों (नीचे एक slotted है) के रूप में चित्रा 1ईमें दिखाया गया है इकट्ठा ।

2. पता लगाना पथ की स्थापना

  1. उद्देश्य से बाहर ले लो और संधानिक प्रकाश स्रोत स्थापित करें । उद्देश्य धारक के नीचे दर्पण (M1) के knobs को समायोजित करें ताकि माइक्रोस्कोप से आउटपुट बीम मोटे तौर पर ऑप्टिकल टेबल के समानांतर हो और मेज पर लड़ी पिरोया छिद्रों के साथ संरेखित हो । प्रत्येक ऑप्टिकल घटक की विस्तृत स्थिति के लिए चित्रा 2 का संदर्भ लें ।
  2. एक multiband डिचरोइक दर्पण (डीएम) डालें और बीम ९० डिग्री से प्रतिबिंबित । आईरिस के अधिकतम आकार का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि बीम कतरन के बिना डिचरोइक दर्पण के केंद्र के माध्यम से गुजरता है ।
  3. पता लगाने के पथ के संरेखण गाइड करने के लिए डिचरोइक दर्पण के माध्यम से गुजर टपका हुआ बीम का प्रयोग करें । बीम में एक sCMOS कैमरा प्लेस और सुनिश्चित करें कि बीम दो दर्पण (M2 और M3) का उपयोग करके कैमरा चिप के केंद्र हिट ।
  4. एक ट्यूब लेंस डालें (TL; f = ३०० mm) लगभग ३०० mm कैमरे से दूर ।
  5. कोटेमेटेड प्रकाश स्रोत निकालें और ट्यूब लेंस और कैमरे के बीच सापेक्ष दूरी समायोजित जब तक छत पर एक पैटर्न स्पष्ट रूप से कैमरे से हल हो गई है ।
  6. बहु रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए ट्यूब लेंस से पहले एक मल्टी बैंड पास फिल्टर (BF) डालें ।

3. उत्तेजन पथ की स्थापना

  1. उद्देश्य धारक पर कोटेमेटेड प्रकाश स्रोत पुनर्स्थापित करें । एक गुना दर्पण (M4) ९० डिग्री द्वारा माइक्रोस्कोप से बीम उत्पादन अनुप्रेषित करने के लिए रखें । बीम संरेखण उपकरण में pinholes के माध्यम से गुजरता किरण जब तक द्विस्तरीय दर्पण और गुना दर्पण के knobs को समायोजित करें ।
  2. कोटेमेटेड प्रकाश स्रोत अलग और यह मेज पर स्थापित करें, जिसमें बीम माइक्रोस्कोप शरीर की ओर इशारा करते हैं । बीम संरेखण उपकरण और एक डबल पिनहोल प्रणाली का उपयोग किरण संरेखित करें ।
  3. कोई लेंस L4 डालें (f = ४०० mm; Ø = 2 ") ऑप्टिकल पथ के लिए लगभग ४०० mm उद्देश्य धारक से दूर । उद्देश्य लेंस स्थापित करें और ऑप्टिकल अक्ष के साथ L4 की स्थिति को समायोजित जब तक एक परिपूर्ण Airy डिस्क पैटर्न छत पर बना है ।
    नोट: लेंस को सम्मिलित करते समय, लेंस से गुजरने वाली बीम स्थिति को अपरिवर्तित रखा जाना चाहिए । लेंस L4 एक SM2 धागा है कि यह संलग्न होने की अनुमति देता है/६० मिमी SM2-लड़ी पिरोया पिंजरे की थाली से आसानी से अलग ।
  4. उद्देश्य को खोलना और एक खुला आईरिस के साथ कोटेमेटेड प्रकाश स्रोत पुनर्स्थापित करें । एक व्यापार कार्ड के साथ माइक्रोस्कोप से बीम उत्पादन नीचे ट्रेस । माउंट एक दर्पण M5 जगह है जहां बीम के आकार में सबसे छोटी और लगभग ४०० mm L4 से दूर है, जो एक संयुग्मित छवि विमान (cIP) है ।
  5. एक दर्पण M6 स्थापित करें और बीम ९० डिग्री से प्रतिबिंबित । M5 और M6 iteratively बीम संरेखण उपकरण के साथ समायोजित करें ।
  6. कोई लेंस L3 डालें (f = १५० mm) M5 से लगभग १५० mm दूर । आउटपुट बीम के टकराव को सुनिश्चित करने के लिए एक बाल काटना इंटरफेरोमीटर का उपयोग करें ।
  7. अस्थाई रूप से ले L4 और बीम नीचे ट्रेस L3 की फोकल स्थिति को खोजने के लिए । इस बिंदु पर एक एकल अक्ष galvo दर्पण रखो, जो एक संयुग्मित वापस फोकल विमान (cBFP) है । आपूर्ति 0 galvo दर्पण के लिए वोल्ट और galvo दर्पण के धारक को घुमाएगी ताकि यह बीम ९० डिग्री से प्रतिबिंबित करता है ।
  8. एक गुना दर्पण M7 प्लेस । ठीक से L2 प्लेस (एफ = १०० मिमी) उसी तरह के रूप में कदम ३.६ ।
  9. ऑब्जेक्ट होल्डर से कोटेमेटेड प्रकाश स्रोत निकालें । एक समांतरण लेंस L1 (f = १०० मिमी), फाइबर एडाप्टर और आईरिस स्थापित करें । एडाप्टर के लिए एक एकल मोड फाइबर कनेक्ट और इमेजिंग प्रणाली के माध्यम से बीम भेजें ।
  10. L4 डालें और एक परिपूर्ण Airy डिस्क पैटर्न तक प्रणाली ठीक धुन छत पर प्रकट होता है ।

4. बेलनाकार लेंस की स्थापना

  1. एक बेलनाकार लेंस डालें (CL1, f = ४०० mm) L1 के बाद और सुनिश्चित करें कि बेलनाकार लेंस x-अक्ष के साथ बीम पर केंद्रित है ।
  2. एक और बेलनाकार लेंस डालें (ब्स2, f = ५० mm) बीम पथ के लिए । एक बाल काटना इंटरफेरोमीटर का उपयोग करें यह सुनिश्चित करने के लिए आउटपुट बीम collimated है ।
    नोट: दो बेलनाकार लेंस के बीच की दूरी ४५० मिमी है । आउटपुट बीम की एक संपीड़न अनुपात है 8 और एक लम्बी अंडाकार आकार का हवादार डिस्क पैटर्न छत पर बना है ।

5. परीक्षण टाइल इमेजिंग

  1. 3d हाइड्रोजेल नमूना तैयार करें । एक हाइड्रोजेल समाधान है, जो 12% acrylamide के होते है के साथ 20 एनएम क्रिमसन मोती मिक्स: bisacrylamide (29:1), ०.२% (v/वी) temed और ०.२% (w/ एक प्रवाह कक्ष में मिश्रित समाधान के ५० μL सुई के रूप में कहीं और11वर्णित है । 10 मिनट के बाद, 3 डी हाइड्रोजेल नमूना इमेजिंग के लिए तैयार है ।
  2. नमूना धारक पर नमूना रखो । ६३८ एनएम लेजर चालू करें और नमूना उत्तेजन के लिए 1 मेगावाट < की शक्ति को समायोजित करें ।
  3. कैमरा नियंत्रण सॉफ़्टवेयर चलाएँ । कैमरा अर्जन-सेटिंग पैनल में, आंतरिक ट्रिगर मोड में चुनें और फिर निःशुल्क चल रहे मोड के लिए वीडियो लें पर क्लिक करें.
  4. थोड़ा कैमरा की स्थिति को समायोजित करें ताकि छवि कैमरे के केंद्र में स्थित है जब 0 वोल्ट galvo दर्पण के लिए लागू किया जाता है.
  5. एक अत्यधिक झुका रोशनी को प्राप्त करने के लिए दर्पण M5 की क्षैतिज घुंडी घुमाएं ।
    नोट: रोशनी के कोण की वृद्धि के साथ, हाइड्रोजेल छवि की तुलना में स्पष्ट हो जाता है कि महामारी की छवि के रूप में बीम पतली हो जाता है । हालांकि, छवि लगभग एक ही स्थिति रहती है ।
  6. टाइल छवि रिकॉर्ड । प्रभावी प्रदीप्ति चौड़ाई11की गणना करें । उदाहरण के लिए, चित्रा 3 12 μm की प्रभावी रोशनी चौड़ाई दिखाता है ।

6. HIST इमेजिंग

  1. एक टर्मिनल ब्लॉक के साथ जुड़ा एक डेटा अधिग्रहण बोर्ड तैयार करें । एक बिजली के तार के माध्यम से उपयोगकर्ता 1 P 0.0 के साथ BNC संबंधक कनेक्ट करें । SCMOS कैमरा के बाहरी ट्रिगर के लिए एक डिजिटल आउटपुट के रूप में उपयोगकर्ता 1 का उपयोग करें । एक galvo दर्पण ड्राइवर के लिए एक एनालॉग आउटपुट AO0 कनेक्ट करें ।
  2. एक कस्टम निर्मित कार्यक्रम का उपयोग कर P 0.0 से TTL पल्स गाड़ियों उत्पन्न (चित्रा 4ए) और अवधि के समय सेट = ४०० ms और t_on = 2 ms. एक डिजिटल आस्तसीलस्कप द्वारा उपयोगकर्ता 1 bnc टर्मिनल से उत्पन्न दालों की जाँच करें और फिर कैमरे के लिए bnc केबल कनेक्ट बाहरी ट्रिगर बंदरगाह ।
    नोट: इस पत्र में इस्तेमाल नियंत्रण सॉफ्टवेयर अनुरोध पर उपलब्ध है । जब अलग कैमरा फ्रेम दरों पर इमेजिंग, अवधि के समय तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  3. कस्टम निर्मित कार्यक्रम के माध्यम से एक galvo दर्पण झाडू शुरू करो । पूर्ण FOV इमेजिंग के लिए Vmin to-५०० Mv और vMax to ५०० mv समायोजित करें । ध्यान दें कि इस आपरेशन के तहत, 3 डी हाइड्रोजेल नमूने अभी भी उच्च ईपीआई रोशनी के समान पृष्ठभूमि दिखाते हैं ।
  4. कैमरा प्राप्ति सेटिंग परिवर्तित कर रहा है ।
    1. का चयन करें बाहरी ट्रिगर मोड में और नीचे (अनुक्रमिक) lightscan प्लस ड्रॉप डाउन मेनू में चित्रा 4बीमें दिखाया गया है के रूप में.
      नोट: इस सेटिंग में, कैमरा छवियों नहीं ले जब तक कि एक ट्रिगर संकेत चालू है.
    2. क्लिक करें, विंडो ऊंचाई और रेखा एक्सपोज़र समय नियंत्रण के लिए गति नियंत्रण स्कैन और मान सेट करने के लिए १८० पंक्तियां और 28 ms, क्रमशः ।
      नोट: जब एक टाइल चौड़ाई (Weff) है १८० पंक्तियाँ (12 μm) और एक एकीकरण समय प्रति पंक्ति (tint) है 28 ms, लाइनों के बीच एक विलंब समय (td) टीडी के रूप में निर्धारित किया जाता है = tint/Weff = ०.१५६ ms. इमेजिंग के लिए २,०४८ x २,०४८ पिक्सेल, कुल अधिग्रहण समय २,०४८ x TD + tint = ३४६ ms, के लिए इसी ~ २.९ एफपीएस है ।
  5. थोड़ा Vmax और vmin समायोजित करने के लिए स्पष्ट छवियां प्राप्त करते हैं ।
  6. 3 डी स्टैक छवियों पर 3d स्टैक पर स्विच करके और स्टैक की संख्या और चरण आकार निर्दिष्ट करके कस्टम-निर्मित प्रोग्राम का उपयोग कर प्राप्त करें ।

Representative Results

एक उदाहरण के रूप में, Atto647N के साथ लेबल एकल-असहाय डीएनए एक 3 डी hydrogel में ६३८ एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ imaged था । डीएनए जेल बहुलकीकरण के दौरान एक acrydite मोइटी के माध्यम से हाइड्रोजेल नेटवर्क के लिए लंगर डाला गया था । चित्र 5कमें दर्शाए अनुसार सतह के ऊपर 5 μm पर छवियां ली गई थीं । HIST छवि बहुत कम महामारी छवि, जिसमें से संकेत पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए १.९ ± ०.७ को HIST छवि के लिए गणना की गई थी जबकि एकल अणु स्पॉट के सबसे मुश्किल महामारी द्वारा पता लगाया जा सकता है की तुलना में दिखाया ।

एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण (smFISH) में 4 मछली जांच के साथ किया गया था । चित्रा 5 बी EEF2 के smfish छवियों को प्रदर्शित करता है (यूकेरियोटिक अनुवाद बढ़ाव फैक्टर 2) एक इमेजिंग बफर में A549 कोशिकाओं पर alexafluor ६४७ के साथ लेबल (नमूना तैयारी11के बारे में हमारे पिछले काम को देखें) । एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण 20 z-5 μm मोटाई के समान ढेर पर प्रदर्शन किया गया था । HIST छवि न केवल अधिक SBR सुधार दिखाया, लेकिन यह भी अधिक वर्दी प्रकाश महामारी की छवि की तुलना में । महामारी इमेजिंग के लिए, एक्सपोजर समय था ४०० ms जबकि HIST इमेजिंग के लिए प्रति पंक्ति एकीकरण समय ३२ ms था, दोनों जिनमें से ७.५ मेगावाट के एक ही रोशनी शक्ति उद्देश्य से पहले मापा गया था । ईपीआई और हिस्ट की इमेजिंग गति २.५ एफपीएस थे ।

Figure 1
चित्रा 1 . माइक्रोस्कोप शरीर, लेज़रों और संरेखण उपकरण । (क) वस्तुनिष्ठ और प्रतिदर्श धारक । (ख) लेजर प्रणालियों का फोटो । एल. पी., लांग-पास द्वि-चक्रीय दर्पण; λ/2, अर्ध-तरंग पट्ट; Pbs, ध्रुवीकरण बीएमअलगाटर. (ग) समांतरित प्रकाश स्त्रोत । (घ) दो निवेशनीय पिनहोल के साथ बीम संरेखण उपकरण । (ङ) दोहरी पिनहोल प्रणाली । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . अत्यधिक इच्छुक बह टाइल (HIST) माइक्रोस्कोपी के लिए विस्तृत सेटअप । फोटो (क) और योजनाबद्ध (ख) हिस्ट माइक्रोस्कोप सिस्टम । BF, मल्टी बैंड पास फिल्टर; CL1-2, बेलनाकार लेंस; डीचरोइक दर्पण; जीएम, galvo दर्पण; BF, बैंड-पास फिल्टर; M1-7, दर्पण; L1-4, लेंस; SMF, एकल मोड फाइबर; TL, ट्यूब लेंस; cIP, संयुग्मित छवि विमान; सीबीएफपी, संयुग्मित वापस फोकल विमान । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 . 8 के संपीड़न अनुपात के साथ टाइल रोशनी । (क) एक 3 डी hydrogel में 20 एनएम मोती की प्रतिदीप्ति छवि । स्केल बार, 20 μm । (ख) मानक विचलन प्रक्षेपण के साथ एक की दिशा y, 10 डेटा बिंदुओं द्वारा सुचारु । लाल तीर 12 μm की एक प्रभावी रोशनी चौड़ाई इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . नियंत्रण और इमेजिंग सॉफ्टवेयर सामने पैनलों । (क) एक कस्टम निर्मित labview कार्यक्रम तुल्यरूप से galvo दर्पण की स्कैनिंग, scmos कैमरा के शुरू अधिग्रहण और पीजो मंच के आंदोलन को नियंत्रित करता है । (ख) कैमरा अधिग्रहण नियंत्रण पैनल स्थापित करना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5. (क) Atto647N-लेबल डीएनए के एक 3d हाइड्रोजेल में ईपीआई और hist रोशनी के साथ छवियां । (ख) EEF2 की Smfish छवियों ईपीआई और हिस्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा A549 कोशिकाओं पर 4 मछली जांच का उपयोग कर । दपि दाग नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल सलाखों, 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं । पहले एक कदम ३.३ में L4 के उचित स्थान है, यह सुनिश्चित करना है कि घटना बीम लेंस के केंद्र के माध्यम से गुजरता है और एक परिपूर्ण Airy डिस्क पैटर्न छत पर बना है । L4 की स्थिति M5, L3, जीएम और L2 सहित अंय सभी ऑप्टिकल घटकों की नियुक्ति निर्धारित करता है । दूसरा महत्वपूर्ण चरण सिंक्रनाइज़ेशन प्रक्रिया है । फोकस पृष्ठभूमि से बाहर अस्वीकार करने के लिए, सक्रिय पिक्सेल जिसका प्रभावी पता लगाना चौड़ाई टाइल चौड़ाई के बराबर है बीम झाडू के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए । इसलिए, यह एक टाइल बीम के प्रभावी रोशनी की चौड़ाई को मापने के लिए आवश्यक है (चरण ५.६) और सेट कैमरा पैरामीटर तदनुसार चरण ६.४ में ।

जब बहुत बड़ी FOV के साथ इमेजिंग, प्रस्तुत विधि एक पक्ष में दूसरी तरफ की तुलना में एक वृद्धि की पृष्ठभूमि से पता चलता है । यह अलग इमेजिंग पदों पर रोशनी के थोड़ा बदल कोण के लिए जिंमेदार ठहराया है । एक दूसरे galvo दर्पण के बजाय M5 को लागू करने के रूप में इस समस्या को alleviates से पहले तुल्यरूप से स्थिति और स्कैनिंग कोण11समायोजन द्वारा प्रदर्शन किया । इसके बजाय ऑफ-द-शेल्फ अक्रोमेटिक doublets, एक टेलीकेंद्रिक स्कैन लेंस भी मददगार होगा । हालांकि, इमेजिंग के लिए < 8080 μm2, एकल galvo दर्पण व्यापक एक क्षेत्र के लिए पर्याप्त था । HIST माइक्रोस्कोपी इमेजिंग गहराई की एक सीमा है, तथापि, यह एक अच्छा SBR जब इमेजिंग अप करने के लिए प्राप्त करने में सक्षम है ~ 15 μm एक 12 μm टाइल बीम और एक NA १.४५ तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस11के साथ ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक टाइल बीम बनाने के लिए 8 के एक बीम संपीड़न अनुपात का इस्तेमाल किया । एक पतली रोशनी HIST माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च SBR, जो एकल अणु ऊतक इमेजिंग11के लिए शक्तिशाली हो सकता है प्राप्त करने के लिए । हालांकि, इस मामले में, photoब्लीचिंग प्रभाव एक वृद्धि की उत्तेजना तीव्रता द्वारा विचार किया जाना चाहिए, जबकि वर्तमान बीम संपीड़न अनुपात 3 पी ईपीआई की तुलना में 3dइमेजिंग में कम photoब्लीचिंग दिखाया । दो orthogonally रखा उद्देश्यों के साथ प्रकाश की चादर माइक्रोस्कोप की तुलना में, HIST माइक्रोस्कोपी को लागू करने और पारंपरिक नमूना तैयारी के साथ संगत करने के लिए सरल है । Hist माइक्रोस्कोपी का बढ़ाया sbr और बड़े fov एकाधिक कोशिकाओं में एकल जैव अणुओं की बातचीत और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है और सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग और एकल अणु ट्रैकिंग में आगे इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

केंद्रीय फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के एक पेटेंट इस पत्र में वर्णित काम को कवर आवेदन दायर की है ।

Acknowledgments

इस काम को डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) (HR00111720066) और नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF) (१८०५२००) ने सपोर्ट किया था । हम उदारता से sCMOS कैमरा उधार के लिए Andor प्रौद्योगिकी में माइकल सर्ज धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" Achromatic doublet Thorlabs AC254-060-A-ML Collimator 
1" Achromatic doublet Thorlabs AC254-100-A-ML L1,L2
1" Achromatic doublet Thorlabs AC254-300-A-ML TL
1" Broadband Dielectric Mirrors Thorlabs BB1-E02-10 M1~M7
1" Cylindrical Lenses Thorlabs LJ1363RM-A CL1
1" Cylindrical Lenses Thorlabs LJ1695RM-A CL2
1" square kinematic mount Edmund Optics 58-857 For dichroic mirror mounting
1" Threaded Cage Plate Thorlabs CP02 For holding other lenses
2" Achromatic doublet Thorlabs AC508-150-A-ML L3
2" Achromatic doublet Thorlabs AC508-400-A-ML L4
2" Threaded Cage Plate Thorlabs LCP01 For holding L4
2" Threaded Cage Plate Thorlabs LCP01T For holding L3
2% Bis Solution Bio Rad 64085292 hydrogel component
20 nm fluorescent beads Thermo Fisher F8782 For testing imaging
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount Thorlabs KCB1 For objective & camera mounting
30mm Cage System Iris Thorlabs CP20S
3-Axis NanoMax Stage Thorlabs MAX311D
40% Acrylamide Solution Bio Rad 64148001 hydrogel component
405 nm laser Cobolt Cobolt 06-MLD
50x TAE buffer Bio-Rad 161-0743 hydrogel component
561 nm laser Cobolt Cobolt 06-DPL
638 nm laser Cobolt Cobolt 06-MLD
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G hydrogel component
Beam alignment tool custom made
BNC terminal blocks Natural Instruments BNC-2110
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads Thorlabs CP1TM09 For holding aspheric lens
Cage System Rods Thorlabs SR series
Cell culture & smFISH See a reference [11]
Double side tape  Scotch 515182 Flow chamber
Epoxy  Devcon 14250 Flow chamber
Galvo mirror Thorlabs GVS211 GM
Galvo System Linear Power Supply Thorlabs GPS011
Half wave plate Thorlabs WPH10M-405/561/633 Power adjustment
long-pass dichroic mirror Chroma T550lpxr For combining lasers
Microscope slides Fisherbrand 12549-3 Flow chamber
Mikroskopische Deckglaser Hecht Assistent 990/5024 Flow chamber
Mounted Frosted Glass Alignment Disk Thorlabs DG10-1500-H1-MD For double pinhole system
Mounted rochester aspheric lens Thorlabs A230TM-A
Multi-band dichroic mirror Semrock Di03-R405/488/561/635-t3 DM; 3 mm thickness
Multi-band filter Semrock FF01-446/523/600/677-25 BF
Multimode fiber Thorlabs M31L02 MMF
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine Sigma T7024-25ML hydrogel component
NI-DAQ board Natural Instruments PCI-6733
Ø1" Kinematic Mirror Mount Thorlabs KM100 For holding mirrors
Objective lens Olympus PLANAPO N 60X 60X 1.45NA oil
Pedestal Base Clamping Forks Newport 9916
Pedestal Pillar Posts Thorlabs RS1P8E
Piezo controller Thorlabs BPC303
Polarized beam splitter Thorlabs PBS251 For combining lasers
RMS-SM1 adapter Thorlabs SM1A3TS For objective lens
Rod holder custom made
Rotation cage mount  Thorlabs RSP1/CRM1/CRM1P For HWP & cylindrical lens mounting
sCMOS camera Andor Zyla-4.2P-CL10
Shearing interferometer Thorlabs SI100 Beam collimation test
Single mode fiber Thorlabs P5-405BPM-FC-2 SMF
SM1 Lens Tubes Thorlabs SM1S25 For double pinhole system
SM1 Slotted Lens Tube Thorlabs SM1L30C For double pinhole system
Stage mount custom made
threaded fiber adapter Thorlabs SM1FC
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z Fiber coupling

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References

  1. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
  2. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
  3. Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
  4. Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
  5. Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  7. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
  8. Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
  9. Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
  10. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
  11. Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
  12. Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
  13. Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).

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विस्तारित क्षेत्र के दृश्य एकल अणु इमेजिंग के लिए एक उच्च इच्छुक बह टाइल माइक्रोस्कोप बनाने के लिए एक गाइड
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Tang, J., Weng, C. H., Oleske, J. B., Han, K. Y. A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging. J. Vis. Exp. (146), e59360, doi:10.3791/59360 (2019).

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