Summary
En detaljerad instruktion beskrivs hur man bygger ett starkt lutande svepte kakel (HIST) Mikroskop och dess användning för singel-molekyl avbildning.
Abstract
Singel-molekyl imaging har mycket avancerade vår förståelse av molekylära mekanismer i biologiska studier. Men har det varit utmanande att få stora fält-of-view, kontrastrika bilder med tjocka celler och vävnader. Här introducerar vi lutar sopade kakel (HIST) mikroskopi som övervinner detta problem. Ett par av cylindriska linser implementerades för att generera en långsträckt excitation stråle som skannades över ett stort imaging område via en snabb galvo spegel. En 4f konfiguration användes till position optiska komponenter. En vetenskaplig kompletterande metal-oxide semiconductor kamera upptäckt fluorescens signalen och blockerade out-of-fokus bakgrunden med en dynamisk confocal slit synkroniseras med den balk sotningen. Vi presenterar en steg för steg instruktion om bygga mikroskopet HIST med alla grundläggande komponenter.
Introduction
Singel-molekyl fluorescens imaging spelar en viktig roll i många biologiska studier som avslöjar ultrastructures, dynamik och kvantiteten av biomolekyler1,2,3. Dock har det svårt för att studera singel-molekyler inuti celler eller vävnader. Medan konfokalmikroskopi ger hög snittningen kapacitet4, är det inte lämplig för singel-molekyl imaging på grund av svår fotoblekning av hög excitation intensiteten eller långsam imaging hastigheten. Widefield mikroskopi använder svagare belysning utan lider av en dålig signal till bakgrunden baserat (SBR)5. Ljus-ark mikroskopi, däremot, kunde visa bra snittning och låg fotoblekning6; den tillgängliga numeriska bländaröppningen (NA) är dock kraftigt begränsad av kravet på ortogonalt placerade mål7. Alternativt, det kräver speciella lampor och prov kammare8,9.
Av dessa skäl har mycket benägen och laminerade optiska ark (HILO) mikroskopi använts för 3D singel-molekyl imaging10. När en lutande balk påträffar ett gränssnitt av två media (glas och vatten, till exempel), bryts strålen enligt Snells lag. Ännu viktigare, bryts strålen blir tunnare, och dess tjocklek beskrivs som dz = R/tan(θ) där R är diametern på den lutande balken och θ är refraktion vinkeln av den överförda beam. Detta enkla genomförande resulterar i en bra snittningen kapacitet. Ändå, denna relation anger att en tunn belysning (dvs hög snittningen kapacitet) kräver en liten R eller en stor θ. Till exempel, när R = 20 µm och θ = 72 grader, kan man få dz = 6,5 µm. Eftersom det finns en praktisk gräns till ökande refraktion vinkel för att bilden djupt inne i cellerna och undvika Totalreflexion, finns det en stark koppling av belysning diameter och beam tjocklek. Av denna anledning visar HILO imaging en relativt liten field-of-view (FOV) som kraftigt begränsar dess tillämpningar i flercelliga imaging.
Nyligen har vi lösa detta problem genom lutar sopade kakel (HIST) mikroskopi där FOV är frikopplat från beam tjocklek i ett mycket enkelt sätt11. Först, genereras en balk som avlånga i en riktning via ett par av cylindriska linser. Denna balk, betecknas som en bricka, producerar en tunn belysning med dz ~ 4 µm medan dess FOV är 130 x 12 µm2. Sedan är kakel svepte över provet med en roterande galvo spegel. Under tiden registreras fluorescens bilden på en vetenskaplig kompletterande metal-oxide semiconductor (sCMOS)-kamera som filtrerar effektivt out-of-fokus bakgrund genom verksamhet i en rullande slutare som fungerar som avstämbara confocal slit upptäckt. På detta sätt möjliggör HIST mikroskopi singel-molekyl bildbehandling med ett större synfält (~ 130 x 130 µm2) och en tunnare belysning än HILO imaging. Vi tillämpat detta nya imaging teknik för att upptäcka RNA avskrifter med en enda sond i celler eller med några sonder i mus hjärnans vävnader, som har en betydande potential för att studera genuttryck och sjukdomar. Till skillnad från andra metoder, HIST sysselsätter endast ett enda hög numeriska bländaröppningen mål utan en ytterligare illuminator eller remote upptäckt mål och är helt kompatibel med inverterade Mikroskop. Dessa fördelar tillsammans med en stor FOV och hög kontrast gör HIST mikroskopi ett framstående verktyg inom biologi och medicin. Vi presenterar detaljerade instruktioner angående instrumentering av mikroskopet HIST, och hur att testa och kalibrera dess prestanda enligt nedan.
Protocol
1. ställa in mikroskopet, lasrar och justering verktyg
- Innan byggnaden mikroskopet, förbereda alla nödvändiga komponenter inklusive optik, optomechanics och elektronik som förtecknas i Tabell för material.
- Förbereda en Mikroskop kropp främst består av två delar: ett objektiva hållare med en RMS-gängade port och en piezo-steg monterade på en aluminiumblock (figur 1A).
Obs: Skräddarsydda Mikroskop kroppen används för bekvämlighet och flexibilitet av instrumentering12. Något kommersiellt tillgängliga Mikroskop organ kan användas för HIST mikroskopi. - Kombinera flera laserlinjerna och koppla ihop dem till en single-mode fiber
- Installera 405, 561, 638 nm lasrar på den optiska tabell och kombinera balkar genom en polariserande stråldelare och en lång-pass dichroic spegel som visas i figur 1B. Kontrollera att alla laserstrålar passera genom hål på Linjeringsverktyget. Infoga halv vinkar tallrikar för makt justering.
Obs: Bär skyddsglasögon för ögonskydd och använda beam-block för att absorbera oönskade laserstrålar. - Installera en fiber koppling lins (f = 4,5 mm) och en adapter för fiber höll i z-översättare med en bur-systemet.
- Anslut en multimode fiber (MMF, Ø 62,5 µm) till fiber adaptern. Justera varje par av styrning spegeln och z-översättaren tills kopplingen effektiviteten av varje laser är högre än 95%. Den utgående strålen har en nära Gaussian-formad profil med speckle mönster.
- Ta bort multimode fiber och ansluta en single-mode fiber (SMF). Liknar MMF, finjustera och maximera kopplingen effektiviteten av tre lasrar.
- Installera 405, 561, 638 nm lasrar på den optiska tabell och kombinera balkar genom en polariserande stråldelare och en lång-pass dichroic spegel som visas i figur 1B. Kontrollera att alla laserstrålar passera genom hål på Linjeringsverktyget. Infoga halv vinkar tallrikar för makt justering.
- Montera en kollimerad ljuskälla som kommer att användas för balk justering i excitation och upptäckt sökvägar. Denna enhet består av en temporally koherent ljuskälla (561 nm) ansluten till SMF, fiber adapter, akromatisk lins (f = 60 mm), iris och Ø1 ”tube spacer i en bur-systemet (figur 1C). Justera avståndet mellan fiber adaptern och linsen med en klippning interferometer för att säkerställa collimationen.
- Förbereda ett beam justering verktyg (figur 1D). Detta är ett par aluminium inlägg med hål på 2 ”höjd från ytan av optiska bord, vilket möjliggör snabba och precisa strålen justering.
- Montera ihop en dubbel pinhole-systemet som består av två Ø1 ”slipat glas justering diskar i varje ände och två Ø1” objektivet rör (den längst ned är skårad) som visas i figur 1E.
2. ställa in sökvägen upptäckt
- Ta ut målet och installera kollimerad ljuskällan. Justera knopparna av spegeln (M1) under objektiva innehavaren så att produktionen balken från mikroskopet är ungefär parallellt med den optiska tabellen i höjd och i linje med gängade hål på bordet. Se figur 2 för detaljerad positioner för varje optisk komponent.
- Infoga en multiband dichroic spegel (DM) och reflekterar strålen 90 grader. Använd den maximala storleken på iris och se till att balken passerar genom centrum av dichroic spegeln utan klippning.
- Använd läckande strålen passerar genom dichroic spegeln för att styra justeringen av upptäckt sökväg. Placera en sCMOS kamera in i strålen och kontrollera att strålen träffar centrum av kamera chip med två speglar (M2 och M3).
- Infoga en tube lins (TL, f = 300 mm) ca 300 mm bort från kameran.
- Ta bort kollimerad ljuskällan och justera det relativa avståndet mellan tube objektivet och kameran tills ett mönster på taket löses klart genom kameran.
- Infoga ett flera band pass filter (BF) innan röret linsen för flerfärgade fluorescens avbildning.
3. ställa in sökvägen magnetisering
- Installera om kollimerad ljuskällan på objektiva innehavaren. Placera en fold-spegel (M4) att omdirigera beam utdata från mikroskopet 90 grader. Justera rattarna dichroic spegeln och vik-spegeln iterativt tills strålen passerar genom hål i balken Linjeringsverktyget.
- Lossa kollimerad ljuskällan och installera det på bordet, där strålen pekar mot Mikroskop kroppen. Justera strålen med en balk justering verktyg och en dubbel pinhole system.
- Infoga en lins L4 (f = 400 mm; Ø = 2 ”) till den optiska vägen cirka 400 mm från objektiva innehavaren. Installera objektivet och justera positionen för L4 längs den optiska axeln tills ett perfekt luftiga disk mönster bildas i taket.
Obs: När du sätter objektivet, beam position passerar genom objektivet bör hållas oförändrad. Linsen L4 har en SM2-tråd som gör det möjligt att vara ansluten/borttagbar från 60 mm SM2-gängade bur plattan lätt. - Skruva målet och installera om kollimerad ljuskällan med en öppen iris. Spåra ner beam utdata från mikroskopet med ett visitkort. Montera en spegel M5 på den plats där storleken på balken är den minsta och cirka 400 mm från L4, vilket är en konjugerad bildplanet (cIP).
- Installera en spegel M6 och reflekterar strålen 90 grader. Justera M5 och M6 iterativt med beam Linjeringsverktyget.
- Infoga en lins L3 (f = 150 mm) ungefär 150 mm från M5. Använd en klippning interferometer för att säkerställa collimationen av produktionen balken.
- Tillfälligt ta bort L4 och spåra ner balken för att hitta den fokala L3. Sätta en enda axel galvo spegel på denna punkt, vilket är en konjugerad tillbaka fokalplan (cBFP). Leverera 0 volt till galvo spegeln och rotera innehavaren av galvo spegeln så att den återspeglar balken 90 grader.
- Placera en fold-spegel M7. Korrekt placera L2 (f = 100 mm) på samma sätt som steg 3.6.
- Ta bort kollimerad ljuskällan från innehavaren objekt. Installera en kollimering lins L1 (f = 100 mm), fiber adapter och iris. Anslut en single-mode fiber till adaptern och skicka strålen genom imaging system.
- Sätt tillbaka L4 och finjustera systemet tills ett perfekt luftiga disk mönster visas på taket.
4. ställa in de cylindriska linserna
- Infoga en cylindrisk lins (CL1, f = 400 mm) efter L1 och kontrollera att den cylindriska linsen fokuserar strålen längs x-axeln.
- Infoga en annan cylindrisk lins (CL2, f = 50 mm) till strålgång. Använd en klippning interferometer för att säkerställa produktionen balken är parallell.
Obs: Avståndet mellan de två cylindriska linserna är 450 mm. Den utgående strålen har ett kompressionsförhållande av 8 och en långsträckt oval formade luftiga disk mönster bildas i taket.
5. testa kakel imaging
- Förbereda 3D hydrogel provet. Blanda 20 nm Crimson pärlor med hydrogel lösning som består av 12% acrylamide:bisacrylamide (29: 1), 0,2% (v/v) TEMED och 0,2% (w/v) ammonium persulfatoxidation i 0,75 x TAE buffert. Injicera en flöde kammare som beskrivs på andra ställen1150 µL av den blanda lösningen. Efter 10 min är 3D hydrogel provet redo att för avbildning.
- Lägg provet på provhållaren. Slå på 638 nm laser och justera makt att < 1 mW för provet excitation.
- Kör programmet kamera kontroll. Panelen kamera förvärv-inställningen Välj inre i trigger-läge och klicka sedan på ta video gratis kör läge.
- Något justera placeringen av kameran så att bilden ligger i centrum av kameran när 0 volt appliceras på galvo spegeln.
- Rotera horisontella ratten av spegeln M5 att uppnå en mycket benägen belysning.
Obs: Med ökningen av infallsvinkel, hydrogel bilden blir tydligare än för Epi bilden som balken blir tunnare. Men håller bilden nästan samma position. - Registrera den kakel bilden. Beräkna den effektiva belysning bredd11. Figur 3 visar exempelvis effektiv belysning bredd 12 µm.
6. HIST imaging
- Förbereda en data förvärv styrelse i samband med en Kopplingsplint. Ansluta användare 1 BNC-kontakt med P0.0 via en elkabel. Använda användare 1 som en digital utgång för extern utlösning av sCMOS kamera. Ansluta en analog utgång AO0 till en galvo spegel förare.
- Generera TTL puls tåg från P0.0 använder ett skräddarsydda program (figur 4A) och Ställ in period tid = 400 ms och t_ON = 2 ms. Kontrollera genererade pulserna från användare 1 BNC terminal genom en digital oscilloskop och sedan ansluta den BNC-kabeln till kameran extern trigger port.
Obs: Den kontroll-programvara som används i detta dokument finns på begäran. När imaging på olika kamerans bildfrekvens, bör den period tid justeras. - Börja sopa en galvo spegel via skräddarsydda program. Justera Vmin att-500 mV och Vmax 500 mV för full FOV avbildning. Observera att under denna operation, 3D hydrogel prover fortfarande visar hög bakgrund liknar Epi belysning.
- Ändra inställningen för förvärv av kameran.
- Välj extern trigger-läge och nedåt (sekventiell) i LightScan Plus rullgardinsmenyn som visas i figur 4B.
Obs: I denna inställning, kameran tar inte bilder om inte en trigger signal är aktiverad. - Klicka på Skanna varvtalsreglering för fönster höjd och linje tid exponeringskontroll och ange värden vara 180 rader och 28 ms, respektive.
Obs: När en kakel bredd (Weff) är 180 rader (12 µm) och en integration tid per rad (Tint) är 28 ms, en fördröjningstid mellan linjerna (TD) bestäms som TD = Tint/Weff = 0,156 ms. för imaging 2,048 x 2 048 pixlar, totalt förvärv tiden är 2 048 x TD + Tint = 346 ms, motsvarar ~2.9 fps.
- Välj extern trigger-läge och nedåt (sekventiell) i LightScan Plus rullgardinsmenyn som visas i figur 4B.
- Något justera Vmax och Vmin att få tydligare bilder.
- Få 3D stack-bilder med hjälp av skräddarsydda programmet genom att växla på 3D stack på och ange antalet staplar och stegstorlek.
Representative Results
Som ett exempel, enkelsträngat DNA märkt med Atto647N fotograferades med en magnetisering våglängd på 638 nm i en 3D hydrogel. DNA var förankrad till hydrogel nätverket via en acrydite biexponentiellt under gel polymerisation. Bilderna togs på 5 µm ovanför ytan som visas i figur 5en. HIST bilden visade mycket mindre bakgrund jämfört med Epi bilden, som beräknades signal-bakgrund-förhållande till 1,9 ± 0,7 för HIST bilden medan de flesta av de enda molekyl platserna kunde knappt ha upptäckts av Epi.
Singel-molekylen RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH) utfördes med 4 fisk sonder. Figur 5 b visar smFISH bilder av EEF2 (eukaryota översättning brottöjning 2) märkt med AlexaFluor 647 på A549 celler i en tänkbar buffert (se vårt tidigare arbete angående prov förberedelse11). En maximal intensitet projektion utfördes på 20 z-stackar motsvarar 5 µm tjocklek. HIST bilden visade inte bara mycket bättre SBR men också mer enhetlig belysning jämfört med Epi bilden. För Epi imaging, exponeringstiden var 400 ms för HIST imaging integration tid per rad 32 ms, vilka båda hade samma belysning makt 7,5 mW mätt innan målet. Imaging hastigheter på Epi och HIST var 2,5 fps.
Figur 1 . Mikroskopet kropp, lasrar och justering verktyg. (A) mål och provhållaren. (B) Foto av lasersystem. LP, lång-pass dichroic spegel; Λ/2, halv-wave plåtar. PBS, polariserande beamsplitter. (C) Collimated ljuskälla. (D) Beam justering verktyg med två insertable hål. (E) dubbel pinhole system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Detaljerade inställningar för lutar sopade kakel (HIST) mikroskopi. Foto (A) och (B) Schematisk bild av HIST Mikroskop system. BF, flera band pass filter; CL1-2, cylindriska linser; DM, dichroic spegel; GM, galvo spegel; BF, band-pass filtrera; M1-7, speglar; L1-4, linser; SMF, single-mode fiber; TL, röret lins; cIP, konjugerade bildplanet; cBFP, konjugerad tillbaka fokalplan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Kakel belysning med ett kompressionsförhållande av 8. (A) fluorescens bild av 20 nm pärlor i en 3D hydrogel. Skalstapeln, 20 µm. (B) standardavvikelse projektion längs y riktning A, jämnas av 10 datapunkter. Den röda pilen anger en effektiv belysning bredd på 12 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Kontroll och bildhanteringsprogram främre paneler. (A) A specialtillverkade LabView program kontrollerar synkront skanning av galvo spegeln, start förvärvet av sCMOS kamera och rörlighet för piezo scenen. (B) förvärv kamerainställningar Kontrollpanelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. (A) bilder av Atto647N-märkt DNA i en 3D hydrogel med Epi och HIST belysning. (B) smFISH bilder av EEF2 använder 4 fisk sonder på A549 celler av Epi och HIST mikroskopi. DAPI fläcken visas i blått. Skala barer, 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är korrekt placering av L4 i steg 3.3, säkerställa att den infallande strålen passerar genom centrum av linsen och en perfekt luftiga disk mönster bildas i taket. Positionen på L4 avgör placeringen av alla andra optiska komponenter, inklusive M5, L3, GM och L2. Den andra kritiska steget är synkroniseringsprocessen. Om du vill avvisa out-of-fokus bakgrund, ska aktiva bildpunkter vars effektiv upptäckt bredd är lika med kakel bredden synkroniseras med den balk sotningen. Därför är det nödvändigt att mäta den effektiva belysningen bredden av en kakel beam (steg 5,6) och Ställ in kamerans parametrar med detta i steg 6,4.
När imaging med mycket stora FOV, visar den presenterade metoden en ökad bakgrund på ena sidan jämfört med den andra sidan. Detta tillskrivs något förändrad vinklar av belysning på olika imaging positioner. Genomföra en andra galvo spegel istället för M5 lindrar problemet som visat innan av synkront justera positionen och skanning vinkel11. I stället för off-the-shelf akromatisk midjekort jacka blir en telecentrisk skanningslinsen också bra. Men för imaging ett område av < 8,080 µm2, enda galvo spegel sotning var tillräcklig. HIST mikroskopi har en högst tänkbar djup, det är dock kunna få en bra SBR när imaging upp till ~ 15 µm med en 12 µm kakel balk och en NA 1,45 olja nedsänkning objektiv11.
I detta protokoll använde vi en balk komprimeringsgrad på 8 för att göra en kakel-balk. En tunnare belysning kan användas i HIST mikroskopi för att uppnå högre SBR, som kan vara kraftfulla för singel-molekyl vävnad imaging11. Men i det här fallet bör fotoblekning effekt övervägas av en ökad excitation intensitet medan nuvarande beam kompressionsförhållandet visade minskad fotoblekning i 3D imaging jämfört med Epi11. HIST mikroskopi jämfört med ljus ark Mikroskop med två ortogonalt placerade mål, och är enkla att genomföra och kompatibel med konventionella prov preparat. Den förbättrade SBR och stora FOV av HIST mikroskopi är lämplig för att studera interaktioner och dynamiken i enda biomolekyler i flera celler och kan användas vidare i super-upplösning imaging och singel-molekyl spårning.
Disclosures
University of Central Florida har lämnat in en patentansökan som omfattar det arbete som beskrivs i detta dokument.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) och National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi tackar Michael Serge i Andor teknik för generöst lånar sCMOS kameran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
