Summary
نحن نقدم عالية الإنتاجية الجر قوة الجر تسرب ملفقة مع مطاط السيليكون (PDMS). هذا الفحص الجديد هو مناسبة لدراسة التغيرات المادية في انقباض الخلايا خلال مختلف العمليات البيولوجية والطبية الحيوية والأمراض. نحن نبين فائدة هذه الطريقة عن طريق قياس زيادة تعتمد على TGF-β في الانقباض خلال الانتقال الظهاري إلى mesenchymal.
Abstract
إن الانقباض الخلوي ضروري في جوانب متنوعة من البيولوجيا، وعمليات القيادة التي تتراوح بين الحركة والانقسام، وتقلص الأنسجة والاستقرار الميكانيكي، وتمثل عنصرا أساسيا في الحياة الحيوانية متعددة الخلايا. في الخلايا الملتصقة ، ينظر إلى تقلص الacto-myosin في قوى الجر التي تمارس الخلايا على الركيزة الخاصة بهم. يظهر خلل تنظيم الانقباض الخلوي في عدد لا يحصى من الأمراض، مما يجعل الانقباض هدفا واعدا في نُهج التشخيص المتنوعة باستخدام الفيزياء الحيوية كمقياس. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستند الاستراتيجيات العلاجية الجديدة على تصحيح الخلل الواضح في انقباض الخلايا. غير أن هذه التطبيقات تتطلب تحديدا ً كمياً مباشراً لهذه القوات.
لقد قمنا بتطوير مجهرية قوة الجر القائمة على الاستومر سيليكون (TFM) في شكل مواز متعدد الآبار. إن استخدامنا لمطاط السيليكون، وعلى وجه التحديد بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)، بدلاً من مادة هيدروجيل بوليأكريلاميد (PAA) المستخدمة عادة ً، يمكننا من تقديم ركائز قوية وخاملة مع حياة الجرف غير المحدودة التي لا تتطلب أي ظروف تخزين متخصصة. وعلى عكس النهج المستندة إلى نظام إدارة الأداء المستندة إلى أعمدة والتي لها معامل في نطاق GPa، فإن نظام إدارة الأداء المستخدم هنا متوافق جداً، حيث يتراوح بين 0.4 كيلوباسكال تقريباً و100 كيلوباسكال. نحن ننشئ منصة عالية الإنتاجية لTFM عن طريق تقسيم هذه الركائز متجانسة كبيرة مكانيا في الآبار المستقلة كيميائيا، وخلق منصة متعددة الآبار لفحص قوة الجر التي تتوافق مع النظم القائمة متعددة الآبار.
في هذه المخطوطة، نستخدم نظام قوة الجر متعدد الآبار لفحص الفترة الظهارية إلى الانتقال Mesenchymal (EMT)؛ نحن نحث EMT في خلايا NMuMG عن طريق تعريضها لTGF-β، وتحديد التغيرات البيوفيزيائية خلال EMT. نحن نقيس الانقباض كدالة للتركيز ومدة التعرض TGF-β. النتائج التي توصلنا إليها هنا تبين فائدة TFM موازية في سياق الفيزياء الحيوية المرض.
Introduction
إنقباض Acto-myosin هو عنصر أساسي في ميكانيكا الخلايا النشطة، مما يؤثر على سلوكيات الخلايا من الحركة والانتشار إلى تمايز الخلايا الجذعية. في الأنسجة، الانقباض يدفع النشاط من الفصل القطبي في تكوين الأجنة، إلى انقباض مجرى الهواء والنشاط القلبي. بشكل حاسم، لتوليد التوتر، يجب أن تلتزم الخلايا أولا ً ببيئتها خارج الخلية. في القيام بذلك، وهذا الانقباض يولد قوى الجر على محيطهم. وقد ظهرت مجهرية قوة الجر (TFM) في العديد من الأشكال كوسيلة لتحديد كمية هذه القوى من خلايا متنوعة في ظل ظروف مختلفة.
وقد شهد مجال TFM اتساعا ً استثنائياً للابتكار والتطبيق، وقد مهدت النتائج الطريق لآفاق جديدة في علم الأحياء، والتي تتضمن الميكانيكا والقوى المادية. بدءا من ركائز سيليكونالتجاعيد 1، وقد طبق الباحثون تقنيات مختلفة لقياس قوى الجر الخلية. وقد تحسنت هذه النهج باستمرار ووصلت الآن إلى مستوى من القرار بشأن ترتيب عدة ميكرون2. ومع ذلك، ظهرت مشكلة رئيسية واحدة، وهي صعوبة في خلق ركائز من معامل منخفض بشكل مناسب باستخدام السيليكون المتاحة. للتحايل على هذه المشكلة، تم اعتماد polyacrylamide كبديل بسبب سهولة إنشاء ركائز على ترتيب 1-20 كيلوباسكال3. نفذنا مؤخرا السيليكون متوافقةجدا في TFM 4، مما يسمح لنا لتلفيق نفس مجموعة من معامل كما polyacrylamide، ولكن مع مزايا السيليكون خاملة وقوية.
وقد مكنت نُهج TFM من الاكتشافات الميكانو البيولوجية القيمة، ومع ذلك، فإن القصور المستمر هو تعقيدها، وغالباً ما تقصر استخدامها على الباحثين في تخصصات الهندسة أو العلوم الفيزيائية. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى المعايرة التفصيلية والحسابات الصعبة المطلوبة لتحديد مقدار الانقباض. وثمة تحد هام آخر يتمثل في أن أساليب TFM منخفضة الإنتاجية إلى حد كبير، وبالتالي فهي غير مناسبة لدراسة العديد من الظروف أو السكان المختلفة في وقت واحد5. وقد شكل ذلك اختناقا، مما أعاق نقل TFM من إعداد الفيزياء الأحيائية المتخصصة إلى تطبيقات بيولوجية ودوائية أوسع نطاقا.
لقد قمنا مؤخرًا بتطوير لوحة TFM متعددة الآبار، والتي تسمح للباحثين بموازاة قياسات TFM الخاصة بهم من أجل تحديد كمية أسرع لمقاييس الانقباض، مع استكشاف تأثير المركبات المختلفة وأيضًا باستخدام الكواشف الأقل4 . ولهذه المنهجية فائدة واسعة في مختلف الدراسات الآلية، من تقييم آثار المركبات على النشاط الخلوي، إلى التحديد الكمي للتغيرات العقدية في التمايز أو المرض.
أحد مجالات البحوث الطبية الحيوية التي سوف تستفيد كثيرا من TFM هو دراسة كيفية تأثير العظة المادية على الأنماط الظاهرية الخبيثة للخلايا السرطانية. يتميز الانبثاث، المسؤول عن 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان، بالخلايا السرطانية التي تغادر موقع الورم الأصلي واستعمار موقع ثانوي. للخلايا للهجرة من خلال الأنسجة وتمرير داخل وخارج نظام الأوعية الدموية، يجب أن تغير جذري أشكالها للضغط من خلال هذه الحواجز المادية في حين توليد قوى كبيرة لسحب طريقها على طول مصفوفة خارج الخلية أو التحرك بين غيرها من الخلايا. يتم نقل هذه القوى إلى الركيزة من خلالتفاعلات التصاق بؤري 2،3،ويمكن قياسها كميا باستخدام TFM. وفي حين أن السرطانات متنوعة من الناحية البيوكيميائية بشكل استثنائي، مع اتساع نطاق الطفرات المعروفة وتغيرات البروتين، فقد لوحظت بعض التغيرات الفيزيائية الشائعة؛ في مجموعة متنوعة من السرطانات، بما في ذلك سرطان الثدي والبروستاتا والرئة، وقد ثبت الخلايا النقيلية لممارسة 2-3 مرات قوى الجر من الخلايا غير النقيلية6،7،8. وتشير هذه النتائج إلى أنه قد يكون هناك ارتباط قوي بين التقدم النقيلي وقوى الجر التي تمارسها الخلايا. ومع ذلك، من الصعب دراسة التغييرات التفصيلية التي تعتمد على الوقت في الانقباض.
الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) هو عملية حيث الخلايا تقليل الالتصاق الخلايا المجانبة- وضيق تقاطع بوساطة الخلية، وتصبح أكثر هجرة والغازية. بالإضافة إلى الوظائف الفسيولوجية التي تشمل التئام الجروح والعمليات التنموية، EMT هو أيضا عملية استغلالها خلال الانبثاث، مما يجعلها نموذجا مفيدا لدراسة هذه العملية. باستخدام TGF-β، يمكننا حث EMT في الخلايا الظهارية الثديية murine (NMuMG)9 لتحديد التغيرات المادية مباشرة خلال هذا التحول، وتميز الوقت والآثار المعتمدة على الجرعة من TGF-β على EMT وتقلص الخلايا. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح فائدة هذا النهج عن طريق قياس التغيرات في الانقباض أثناء EMT المستحثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: سيقوم البروتوكول التالي بتوجيه الباحثين في تصنيع واستخدام طبق TFM متعدد الآبار الموضح في الشكل 1.
1. إعداد ركائز سيليكون PDMS
- إعداد خليط مطاط السيليكون PDMS على أساس خليط مركب من اثنين من مجموعات المتاحة تجاريا.
- إضافة الجزء ألف والجزء باء من مجموعة PDMS (على سبيل المثال، GEL-8100، انظر جدولالمواد) في نسبة الوزن 1:1 في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: يتم خلط الخليط على الدوار بسرعة بطيئة بما فيه الكفاية لتدفق الخليط ذهابا وإيابا خلال الثورة لضمان الخلط الكامل. - إضافة الكمية المطلوبة من عامل علاج لمعامل المطلوب من الركيزة.
ملاحظة: كمية عامل المعالجة التي سيتم إضافتها إلى الخليط يعتمد على معامل المطلوب من الركيزة ويمكن أن تتراوح عادة من 0.1٪ إلى 1.8٪. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 والشكل 3 للحصول على دليل لتركيزات محددة من الوصلة المتقاطعة ومعامل التضمين الناتج عن ذلك. - خلط صياغة على الدوار لمدة 30-45 دقيقة. ضمان دوران بطيء بما فيه الكفاية لخلط شامل.
- إضافة الجزء ألف والجزء باء من مجموعة PDMS (على سبيل المثال، GEL-8100، انظر جدولالمواد) في نسبة الوزن 1:1 في أنبوب 50 مل.
- الطبقة السفلية: طلاء ركائز PDMS على الشريحة الزجاجية
- ضع تشاك المبني حسب الطلب الموضح في الشكل 2 على طبقة الدوران. تنظيف الزجاج مع الإيثانول أو isopropanol، وتجف مع مسح ة خالية من الوبر. وضع الشريحة الزجاجية في تشاك وبدوره على فراغ لعقد الشريحة في مكانها.
- تطبيق PDMS غير المعالجة حوالي 1 سم من الحواف والعمل في نحو المركز. تطبيق ما يكفي (3-4 مل) PDMS لضمان تغطية السطح كله.
ملاحظة: للتأكد من أن PDMS ينتشر بالتساوي على سطح الزجاج، قد يكون تلميح ماصة مفيدة لنشر خليط PDMS من المركز إلى الحواف. - تدور الزجاج مع خليط PDMS على معطف تدور مع البروتوكول التالي.
- لنشر PDMS غير المعالجة على الشريحة، تسريع في 50 دورة في الدقيقة / ثانية من 0 إلى 200 دورة في الدقيقة. عقد في 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- لتحقيق طبقة PDMS سميكة 100 متر، تسريع في 50 دورة في الدقيقة / ثانية إلى 300 دورة في الدقيقة وعقد لمدة 1 دقيقة في 300 دورة في الدقيقة. سوف سمك المطلوب مختلفة غير 100 درجة مئوية تتطلب قيم سرعة محددة.
- لإزالة، يتباطأ عند 50 دورة في الدقيقة/ ث إلى 0 دورة في الدقيقة. تعطيل فراغ وإزالة الشريحة المغلفة، مع الحرص على عدم لمس السطح المغلفة.
ملاحظة: من المهم تضمين خطوات التسارع والتباطؤ لضمان سطح مستمر سلس.
تحذير: للتأكد من أن العينة لا تطير قبالة تشاك، يجب استخدام حامل حسب الطلب لعقد الشريحة، وليس الاعتماد ببساطة على فراغ وتشاك شقة القائمة. وترد تفاصيل ومواصفات هذا حامل في الشكل2.
- ضع العينة المغلفة الدورانفي الفرن في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (100 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: يجب أن يكون سطح الفرن حيث يتم وضع العينة صلبة (أي ليس رف سلك) ومستوى السطح لضمان التدفئة موحدة وسمك العينة. لوحة السيراميك أو الصلب يجعل سطح مثالي.
- أعلى طبقة حبة
- إضافة محلول حبة في نسبة مناسبة لخليط PDMS المتبقية.
ملاحظة: تعتمد هذه النسبة على تركيز محلول حبة الأسهم وكثافة الخرزة المطلوبة على العينة. القيم النهائية النموذجية هي 9.2 × 1011 الخرز / مل و 0.05-0.2 الخرز / ميكروم2، وفائض من الخرز هو عموما أفضل من كمية غير كافية. - اخلط محلول الخرزة مع أجهزة PDMS غير المعالجة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع الأنبوب على الدوار لمدة 30 دقيقة تقريبا، دوامة لمدة 1-2 دقيقة، أو سونيكيشن لمدة 30 دقيقة. ويمكن الجمع بين هذه الأساليب.
ملاحظة: في تطبيقنا، نجد أن sonication فعالة في كسر المجاميع حبة، والتناوب فعالة في الاختلاط. قد تتجمع الخرزات الائتمانية المركبة في التخزين. قبل استخدامها، قد يتم إعادة تعليقها في الهكهكانات وsonicated. إذا كان هناك مجاميع كبيرة كبيرة، يمكن للمرء تصفية تعليق حبة من خلال مرشح حقنة 5 ميكرومتر. هذه الخطوة الترشيح هو اختياري; فإنه يساعد على معطف العينة مع الخرز monodispersed، ولكن قد تضيع جزء كبير من الخرز في مرشح. - إخراج الشريحة من الفرن، والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، ووضعها على الدوار المغطي.
- إضافة 3-4 مل من حبة وخليط PDMS غير المعالجة على سطح العينة المغلفة.
ملاحظة: الخليط مع الخرز المضافة هو أقل لزجة بسبب الهكهكة. تأكد من عدم لمس سطح الركيزة لأنها قد تضر الركيزة PDMS المغلفة بالفعل. بالإضافة إلى ذلك، قد خليط حبة في البداية لا الرطب السطح. الحرص على أن الخليط لا تتدفق على الفور قبالة سطح PDMS الشفاء. - قم بتدوير العينة مع البروتوكول التالي.
- لنشر حبة وخليط PDMS غير المعالجة، وتسريع في 100 دورة في الدقيقة / ثانية من 0 إلى 500 دورة في الدقيقة؛ عقد في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- لتحقيق طبقة رقيقة من دزجزءا من PDMS (~ 1 ميكرومتر)، وتسريع في 200 دورة في الدقيقة / ثانية من 500 إلى 5000 دورة في الدقيقة؛ عقد في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 s.
- لإزالة، يتباطأ عند 100 دورة في الدقيقة/ ث إلى 0 دورة في الدقيقة. تعطيل فراغ وإزالة الشريحة المغلفة، مع الحرص على عدم لمس السطح المغلفة.
- ضع العينة المغلفة الدورانية في الفرن على درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: درجات الحرارة فوق 100 درجة مئوية أو فترات أطول من 1 ساعة يمكن أن تقلل من الفلورة حبة. تأكد من تعيين درجة حرارة الفرن إلى 100 درجة مئوية وليس أعلى. - يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. لتخزين العينة، قم بتغطية السطح لتجنب التعرض للغبار والضوء. تأكد من أن لا شيء يمس السطح. العينة هي الجرف مستقرة في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.
- إضافة محلول حبة في نسبة مناسبة لخليط PDMS المتبقية.
- تجميع لوحة
- إضافة الجزء ألف (قاعدة) والجزء باء (عامل علاج، على سبيل المثال، Sylgard) من مجموعة الاستومر PDMS في نسبة الوزن 10:1 في أنبوب 50 مل.
- يُمزج المزيج على الدوار لمدّة 30-45 دقيقة.
ملاحظة: للوحة واحدة، مزيج 5 مل من قاعدة مع 0.5 مل من عامل علاج. يمكن إضافة ما يصل إلى 1 مل من الهكهكة للحد من لزوجة الخليط. - يوضع الخليط في الجزء السفلي من المقسم ويُوزّع المزيج.
ملاحظة: يجب وضع الفاصل رأساً على عقب. - وضع الركيزة على مقسم رأسا على عقب.
- ضع العينة رأساً على عقب في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إخراج عينات من الفرن وتنظيف الجزء السفلي من الزجاج مع الإيثانول 70٪ أو isopropanol لإزالة أي بقايا PDMS.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. لتخزين العينة، ضع غطاء على الركيزة ولف الجهاز في رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. العينة هي الجرف مستقرة في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى. الفاصل المستخدم في هذه الطريقة هو في شكل 96 جيدا; ومع ذلك، قد يستخدم الباحثون أشكال أخرى (384-well، 2-well، 4-well، 8-well، وما إلى ذلك) اعتمادا على الإعداد اتّساح التجارب المرغوبة وتوافر الهياكل الفاصلة. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين.
2. وظائف السطح
- حل 80 ميكرولتر من aliquot Sulfo-SANPAH في 40 مل من 0.1 M HEPES العازلة (درجة الحموضة 7-9).
ملاحظة: إعداد aliquots Sulfo-SANPAH عن طريق حل 100 ملغ من مسحوق سولفو-سانباه في 2 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل المعقمة (DMSO). إعداد 0.1 M HEPES العازلة عن طريق تخفيف 50 مل من HEPES في 450 مل من المياه المعقمة منزوعة الأيونات وتصفية من خلال مرشح المسام 0.22 m. - إضافة 200 درجة مئوية من محلول Sulfo-SANPAH المخفف لكل بئر من لوحة 96 جيدا.
- عرض لوحة للأشعة فوق البنفسجية (300-460nm) ضوء على مسافة مناسبة والمدة.
ملاحظة: بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، يجب أن يكون لون الحل أغمق. تعتمد مسافة التعرض للأشعة فوق البنفسجية ومدتها على قوة مصباح الأشعة فوق البنفسجية. في تطبيقنا، ونحن فضح لمدة 10-15 دقيقة على مسافة 5 سم. - إزالة محلول Sulfo-SANPAH من الآبار وإضافة 200 درجة مئوية من 5 ميكروغرام / مل محلول فيبرونكتين إلى كل بئر.
ملاحظة: يمكن استخدام البروتين المحدد من قبل الباحث لطلاء السطح. بعض البروتينات شائعة الاستخدام هي الكولاجين, فيبرونيكتين, ولامينين. لقد وجدنا Sulfo-SANPAH لتكون الطريقة الأكثر فعالية، وتنظيف البلازما في حين يتم تثبيط في بعض الأحيان توظيف في PDMS كما أنه يخلق طبقة ثاني أكسيد السيليكون ويضر بشكل واضح على السطح. - احتضان لوحة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: طرق حضانة مختلفة يمكن تطبيقها اعتمادا على البروتين المستخدم للطلاء. - إزالة محلول الفيبرونكتين وغسل كل بئر مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) مرتين.
- ضع غطاء على العينة.
- إضافة 200 درجة مئوية من PBS إلى كل بئر.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن تخزين العينات المغلفة فيبرونيكتين في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
3. الأشعة فوق البنفسجية التعقيم
- تعقيم العينة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: قد تؤثر أوقات التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأطول بشكل سلبي على الفلورة الخرزة. ويجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة.
4. خلية ثقافة
- إزالة PBS من كل بئر وإضافة 200 μL من الخلايا المعلقة في وسائل الإعلام الثقافة إلى كل بئر.
- لوحة الخلايا في كثافة الخلية المطلوبة. تعتمد كثافة الخلايا على التجربة المطلوبة. بالنسبة لدراسات الخلايا الواحدة، يجب أن تكون الخلايا على الأقل 50 ميكرومتر وبصرف النظر عن الخلايا القريبة من حواف نافذة التصوير لا ينبغي أن تدرج في قياس TFM. بالنسبة للخلايا أحادية الطبقة، يجب أن يكون لنافذة التصوير حقل العرض المغطى بطبقة من الخلايا.
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة النمو الكامل لخلايا NMuMG عن طريق استكمال DMEM مع 5٪ FBS، 10 MM HEPES، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، 1٪ بنسلين-ستربيتوميسين، 1 مليون لام الجلوتامين، و 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين B.
- إعداد مخزون الأنسولين عن طريق إعادة تشكيل في المياه الحمضية (2.5 مل من حمض الخليك الجليدي في 130 مل من الماء منزوع الأيونات) إلى تركيز 10 ملغ / مل. تخزين حل الأسهم في 4 درجة مئوية. انتظر حتى يصبح الحل واضحًا، ثم قم بتصفية فلتر المسام بـ 0.22 ميكرومتر.
- إضافة TGF-β
- لإعداد الأسهم TGF-β، حل 2 ميكروغرام من TGF-β في 100 ميكرولتر من 10 مل من حمض الستريك 10 مل (درجة الحموضة 3.0) وتعقيم فلتر مع المسام 0.22 ميكرومتر. دوامة الأنبوب وaliquot في وحدات التخزين المطلوبة. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية.
- إضافة 1.5 ميكرولتر من TGF-β حل الأسهم إلى 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية كاملة لتشكيل وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع تركيز TGF-β النهائي من 3 نانوغرام / مل.
ملاحظة: لجعل 10 مل درجة الحموضة 3.0 حامض الستريك، تخفيف الحمض في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 3.0 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك.
5 - الحصول على البيانات
- لكل موقف، والحصول على صورة واحدة على الأقل من الجسيمات الائتمانية والخلايا. التركيز على طبقة حبة.
ملاحظة: يجب تحسين حجم البكسل استناداً إلى حجم الجسيمات الائتمانية وطريقة معالجة الصور المستخدمة. في هذا التطبيق، يستخدم المؤلفون هدف NA 10x 0.4، ويتم الحصول على الصور بدقة 1024 × 1024، مع 455 نانومتر/بكسل. بشكل عام، فمن المفيد الاحتفاظ بقرار من ما لا يقل عن 1-5 بكسل لكل حبة. هنا، والخرز هي polydisperse ولها حجم الفردية من 300-500 نانومتر. من الأهمية بمكان أن تكون الخرزات الائتمانية الفلورية في التركيز على الصور لاستخدامها في حسابات TFM. وينبغي إعطاء الأولوية للتركيز ونوعية التصوير من الخرز على تصوير الخلايا نفسها. وينبغي ألا يكون هناك حديث متقاطع بين قنوات مختلفة، ولا سيما أي فلورة لا من الخرز الائتماني الذي يظهر في أطياف التصوير من الخرز. - وبمجرد تسجيل جميع المواقف ذات الأهمية، أضف حل مفرزة لكل بئر للحصول على صور مرجعية خالية من القوة للجسيمات الائتمانية.
- لإعداد حل مفرزة الخلية، مزيج محلول مائي يحتوي على 2٪ تريتونإكس-100، 50 مليون متر أزيد الصوديوم، و 500 مل هيدروكسيد البوتاسيوم.
ملاحظة: يتم توفير ما سبق كمثال على حل مفرزة فعالة. ويمكن استخدام حلول مفرزة مختلفة حسب تقدير الباحثين لفصل الخلايا عن سطح الركيزة.
- لإعداد حل مفرزة الخلية، مزيج محلول مائي يحتوي على 2٪ تريتونإكس-100، 50 مليون متر أزيد الصوديوم، و 500 مل هيدروكسيد البوتاسيوم.
6. تحليل الصور
- إجراء تحليل الصورة المناسب ة حسب الرغبة.
ملاحظة: تم تطوير برامج التحليل داخلياً. يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام برامج أو برامج مصنوعة خصيصًا على الإنترنت.
7. حبة التوليف
ملاحظة: يستند البروتوكول التالي إلى طريقة التوليف التي وصفها كلاين وآخرون10.
- تحت غطاء الدخان، قم بإعداد قارورة ثلاثية الرقبة مع مكثف الجزر المبرد بالماء.
تحذير: إعداد توليف في غطاء الدخان الكيميائية جيدة التهوية. - إضافة 0.5 مل من مثبت PDMS والفلوروفور إلى قارورة.
- تجهيز عنق واحد مع الحاجز المطاطي مع إبرة مدخل النيتروجين وإبرة منفذ وتجهيز الرقبة الأخرى مع الحاجز المطاطي لإضافة كاشف مع حقنة.
- أضف 100 مل من الهكهكة اللامائية في 250 مل إلى القارورة وأضف شريط تحريك مغناطيسي صغير.
- ضع القارورة في حمام الزيت المعدني عند درجة حرارة 75 درجة مئوية وطهرها بغاز النيتروجين لمدة 1 ساعة.
- أضف 6 مل من ميثيل ميثاكريلات إلى قارورة سفلية مستديرة بـ 25 مل.
- إضافة 0.100 غرام من 2،2 '-azobisisobutyronitririle (AIBN) إلى قارورة أسفل جولة وتطهير الخليط مع غاز النيتروجين لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: مسح ميثيل أميثاكريلات من خلال عمود معبأة مسبقا لإزالة مثبطات قبل الاستخدام. يُضاف خليط ميثيل اميثاكريلات وAIBN إلى قارورة ثلاثية الرقبة. - الحل في البداية يصبح غائما ويتحول حليبي. اسمحوا رد الفعل تشغيل لمدة 3 ح بعد أن يصبح الحل غائم.
- بعد 3 ساعة، ضع القارورة في حمام ماء جليدي.
- فراغ تصفية الحل مع ورقة مرشح الخشنة.
- طرد مركزي فيلترات وإعادة تعليق الجسيمات في الهكهكة.
ملاحظة: يعتمد حجم الهكهسون الذي سيتم إضافته على التركيز المطلوب لحل الخرزة. سونيكيشن يسهل إعادة تشتت جزيئات حبة في محلول الهكهكة. الخرز التي تنتجها المؤلفين لها أقطار polydisperse من حوالي 300-500nm. بسبب استخدام تتبع نمط الترابط المتبادل لتحديد الإزاحات، لا يلزم الخرز أحادي التشتت.
8- بروتوكول قياس علم الرهيولوجيا
ملاحظة: علم الأنسجة غير مطلوب لكل باحث أو تجربة، ولكن من الضروري تحديد معامل للتركيبات الجديدة من PDMS. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم مقياس القص لقياس آثار كروسلينكر، والتردد، والضغط على معامل عينات PDMS. وتبعاً للأدوات والخبرات المتاحة، يمكن أيضاً قياس معامل الغيرة باستخدام العديد من نُهُج التحليل الميكانيكي الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، قد يختار الباحثون الذين يستخدمون هذا البروتوكول استخدام معاملنا المنشور الوارد في الجدول 1والشكل 3 والشكل 4.
- استخدام مقياس الرطوبة مع 25 ملم قطرها هندسة لوحة موازية. ويمكن استخدام الجيومتريات الأخرى.
- تهيئة النظام ومعايرة الجهاز ونظام القياس (لوحة موازية، د = 25 ملم). بعد قياس الفجوة الصفرية، ابدأ في تحميل نموذج PDMS.
- بمجرد أن تم خلط الاستومر PDMS ووكيل الربط المتبادل، pipet الخليط على لوحة أسفل مقياس الرطوبة.
- نقل المغزل إلى أسفل للاتصال تماما الجزء العلوي من عينة PDMS.
- تقليم بعناية عينة محملة الزائدة من لوحة أسفل.
- في اختبار الاجتياح سلالة، وتطبيق سلالات متزايدة لكل تكوين مع كثافة مختلفة عبر الربط لضمان هيكل البوليمر لا يزال في نظام لزج خطي خلال جميع قياسات القص.
ملاحظة: قيم السلالة ذات الصلة لدراسات الخلايا عادةً في نطاق 0.1-10%. لقد وجدنا PDMS أن تكون خطية تصل إلى ما يقرب من 100٪ سلالة. - قياس معامل التخزين القص الديناميكي (G'), ومعامل الخسارة (G′′) من شبكة PDMS في اختبار الاجتياح الوقت مع تردد 1 هرتز وسلالة القص المذبذب من 0.5% في 100 درجة مئوية.
- لتحديد مرونة لزجة والاعتماد على الوقت من شبكة PDMS النهائي، وتطبيق اختبار الاجتياح التردد مع تردد تتراوح بين 0.1-100 هرتز وسلالة القص المذبذب من 0.5٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل إضافة TGF-β، طبقة أحادية من الخلايا confluent لديه الحصى مثل الشكل ومعبأة بإحكام. عند العلاج TGF-β، تصبح الخلايا أكثر ممدود في مورفولوجيا، وتوسيع منطقة الخلية والحصول على النمط الظاهري mesenchymal أكثر. باستخدام جهاز متعدد الآبار ملفقة مع elastomers PDMS لينة، تمت دراسة الخصائص الفيزيائية للخلايا في ما مجموعه 17 ظروف مختلفة. وقد عولجت الخلايا بأربع تركيزات مختلفة من TGF-β (0.5 و1 و2 و4 نانوغرام/مل) وأربع أوقات حضانة مختلفة (12 و24 و48 و96 ح)، ويرد موجز لهذه النتائج في الشكل5. الخلايا المعالجة مع TGF-β تطبيق ضغط الجر أكبر وسلالة الطاقات من الخلايا المستزرعة دون TGF-β. وأظهرت الخلايا الحاضنة مع TGF-β لمدة 96 ساعة أكبر ضغوط الجر والطاقات سلالة. الخلايا تطبيق ضغوط أكبر وسلالة الطاقات عند التعامل مع تركيز أعلى من TGF-β. وكان الفرق في الجر وسلالة الطاقات أكثر تميزا في أوقات الحضانة أطول.
سطح الركيزة يحتاج إلى أن تكون على نحو سلس والمغلفة بشكل موحد مع الأربطة، مثل الفيبرونكتين أو الكولاجين. قد يؤدي السطح المخدّر و/أو الطلاء غير الموحد للأربطة إلى ربط الخلايا بشكل غير لائق، مما يؤدي إلى قياس الجر غير الدقيق. ويبين الشكل 6 ضغوط الجر الموضعية بسبب سطح الركيزة غير الموحد.
الشكل 1 نظرة عامة على تصنيع لوحة متعددة الآبار. (أ) شريحة زجاجية مخصصة هي نقطة البداية. (B) يتم المغلفة الشريحة الزجاجية مع طبقة سميكة (~ 100 درجة مئوية من PDMS). (C) طبقة من الخرز الائتماني (هو مبين باللون الأخضر) ثم تدور المغلفة في طبقة سميكة ~ 1 ميكرومتر على رأس الطبقة السابقة. (D) يتم وضع مقسم متعددة جيدا بعناية على رأس طبقة حبة الائتمانية. (E) يتم تجميع لوحة كاملة متعددة جيدا وجاهزة للاستخدام أو التخزين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 تشاك مخصص لتدور المغطي. لمنع الزجاج السفلي (حيث يتم المغلفة PDMS) من الطيران قبالة تشاك تدور معطف القياسية، يتم وضع حامل حسب الطلب على تشاك. (A) حامل حسب الطلب لتشاك تدور المغطي. (ب) الرسم الهندسي للحامل مع جميع الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : صلابة الركيزة مع تغيير تركيز كروسلينكر (الوزن٪). يتم إعداد خلائط PDMS كما هو موضح، مع زيادة النسبة المئوية الإضافية للتقاطع معامل مرن حتى الحد الأقصى 100 كيلوباسكال عند 1.8 في المائة الوزن (الوزن٪) كروسلينكر. كدليل، معامل كوظيفة crosslinker يصلح خطيا، والتي يمكن استخدامها من قبل الباحثين لصياغة الخليط الخاصة بهم في معامل معين المطلوب داخل هذا النطاق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 علم الأنسجة من الاستومر PDMS التي تحتوي على 0، 0.15، 0.36 و 1 الوزن٪ من عوامل الربط بين الوصلات عند درجة حرارة 100 درجة مئوية. تشير رموز المثلث إلى معامل الخسارة (G'') وتشير الرموز المربعة إلى معامل التخزين (G'). (أ) الاجتياح الوقت المذبذب في تردد 1 هرتز وسلالة القص من 0.5٪ خلال الهلام. (B) الاجتياح تردد مذبذب من شبكة PDMS في سلالة القص من 0.5٪. (C) سلالة اكتساح شبكة PDMS على تردد 1 هرتز. تم الحصول على جميع نقاط البيانات في ثلاثة أضعاف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : النتائج التمثيلية باستخدام جهاز إجهاد الجر مع تنسيق متعدد الآبار. تم زراعة طبقة أحادية من الخلايا في ظروف مختلفة في جهاز متعدد الآبار لقياس الانقباض وإجهاد الطاقة. (أ) الرسم البياني للضغوط الجر مع زيادة TGF-β وقت الحضانة لتركيزات TGF-β مختلفة. زيادة ضغوط الجر مع زيادة تركيزات TGF-β ووقت الحضانة. وجميع البيانات ذات أهمية إحصائية فيما يتعلق بالمراقبة (أي لا TGF-β) باستثناء ما يلي: 12 ساعة - 0.5 نانوغرام، 12 ساعة - 1 نانوغرام، 48 ساعة - 1 نانوغرام. (B) الرسم البياني للطاقة سلالة مع زيادة TGF-β وقت الحضانة لتركيزات TGF-β مختلفة. زيادة الطاقات سلالة مع زيادة تركيزات TGF-β ووقت الحضانة. وتتراوح أحجام العينات من n = 7 إلى n = 15. وجميع البيانات ذات أهمية إحصائية فيما يتعلق بالمراقبة (أي لا TGF- β) باستثناء ما يلي: 12 ساعة - 0.5 نانوغرام، و12 ساعة - 1 نانوغرام، و24 ساعة - 0.5 نانوغرام، و24 ساعة - 1 نانوغرام، و48 ح - 1 نانوغرام. وقد تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار كروسكال واليس، الذي لا يفترض توزيعا عاديا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 نتائج تمثيلية من تجربة دون المستوى الأمثل (ألف، باء) وتجربة مرضية (C، D). (أ) صورة انعكاس سطح الركيزة. الملوثات غير المرغوب فيها، والتي يمكن أن تشمل الغبار أو الألياف، أو العيوب المادية مثل الخدوش موجودة على سطح الركيزة. (باء) خريطة الإجهاد من انقباض الخلايا: بسبب سطح غير موحد، لوحظت ضغوط الجر غير النظامية وغير الدقيقة حول الكائنات. (جيم) صورة انعكاس سطح الركيزة. لا توجد ملوثات واضحة مرئية. (دال) خريطة الإجهاد من انقباض الخلية: لا يمكن أن تكون هناك أي انقطاع القطع الأثرية مرئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تركيز كروسلينكر (الوزن) | G' (Pa) | الانحراف المعياري | هاء (كيلوباسكال) | الانحراف المعياري |
| صفر | 0.135 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1 | 0.1 | 3 | 0.35 |
| 0.36 0.36 | 4.027 | 0.245 | 12.081 12 | 0.73 |
| 0.75 | 16.01 | 0.49 | 48.03 | 1.2 |
| 1 | 18.44 | 0.989 | 55.32 | 1.94 |
| 1.5 | 27.638 | 0.93 | 82.91 | 1.64 1.64 |
| 1.8 | 33.986 | 0.88 | 101.94 | 1.088 |
| 2 | 33.36 | 0.67 | 100.08 | 1.1 |
الجدول 1: صلابة الركيزة مع تغيير تركيز كروسلينكر (الوزن٪). عن طريق تغيير تركيزات كروسلينكر إضافية، يتم تصنيع ركائز PDMS من معامل الشباب المطلوب. تم قياس معامل القص PDMS مع مقياس الرهات وتم تحديد معامل يونغ. وبالنسبة لكل نقطة بيانات، أُنجز 3 تحضيرات مستقلة ويُعطى الانحراف المعياري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لنجاح هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان أن يكون عينة المغلفة بشكل موحد مع سمك ثابت من حوالي 100 ميكرومتر. وينبغي اختيار المعوّل بعناية لدراسة الأهمية المادية للنظام البيولوجي الذي يهمه الأمر. عند تصنيع طبقة أعلى، ينبغي تحسين تركيز جزيئات الفلورسنت fiducial لتحليل دقيق للإزاحة والإجهاد الجر. تحليل الخلايا المفردة المعزولة يتطلب طبقة ائتمانية أكثر كثافة من قياس الطبقات الأحادية المتجانسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون سطح الركيزة طلاء مستقرة وموحدة من جزيئات التصاق مثل الكولاجين، فيبرونيكتين، ولامينين لضمان المرفق السليم للخلايا إلى سطح الركيزة. ويجب توخي الحذر بوجه خاص عند ربط مقسم متعدد الآبار؛ وينبغي وضعها دون انزلاق لمنع ختم الغراء PDMS من أن تكون لطخت على سطح الثقافة، ويجب أن تكون محاذاة الحافة الخارجية بعناية مع أبعاد الزجاج لمنع أي تسرب على الآبار الحدودية.
لمنع الآبار من أن تكون متسربة، يجب تطبيق كمية كافية من الغراء PDMS على مقسم جيدا لعقد ها في مكانها. ومع ذلك، فإن استخدام كميات مفرطة تغطي سطح ثقافة الخلية.
يجب إضافة حجم كاف ٍ من PDMS أثناء إجراء الطلاء الدوار. عند العلاج، الفرن والرفوف تحتاج إلى أن تكون على مستوى. قد يؤدي عدم كفاية PDMS أو فرن غير مستوي إلى سمك PDMS متفاوتة.
كثافة حبة يحتاج إلى تحسين للتحليل السليم. عندما تكون كثافة حبة غير كافية، يجب زيادة تركيز الخرز في خليط PDMS الائتمانية. بالإضافة إلى ذلك، يجب إضافة كمية كافية من الخليط لطلاء الدوران. لضمان إشارات الفلورسنت المناسبة من جزيئات حبة الائتمانية، وينبغي رصد حالة علاج بعناية. قد يؤدي طول أوقات ودرجات حرارة أعلى من تلك المحددة في هذا البروتوكول إلى تدهور الفلورة. طلاء البروتين غير لائق على سطح العينة قد يؤدي إلى التصاق الخلية الفقراء. ولمنع ذلك، يجب تنظيف السطح، كما يجب فحص انتهاء الكواشف مثل Sulfo-SANPAH وligands. وينبغي تحسين وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية وقوتها. يمكن اختبار الفلورة المناعية أو غيرها من بناء البروتين الفلورسنت لضمان طلاء الأربطة موحدة.
الجهاز ملفقة مع هذه الطريقة ومجموعة من تركيبات PDMS ينطبق فقط على ركائز مع معامل يونغ تتراوح بين 0.4 كيلوباسكال إلى 100 كيلوباسكال. ومع ذلك، قد يكون من الممكن استخدام معامل آخر باستخدام تركيبات بديلة، فإن النطاق الحالي يمتد على مجموعة كبيرة من القيم ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بينما هذا الأسلوب هو على وجه التحديد لتصنيع متعددة الآبار، فإنه قد يستخدم أيضاً لإعداد الشرائح الفردية أو الجيومتريات الشرائح الأخرى، وفي هذه الحالات قد يكون من الضروري استكشاف أخطاء المستخدم وإصلاحها. في هذا التجسيد، يتم استخدام شريحة زجاجية سميكة نسبيا (1 مم)، مما يحول دون تحقيق أهداف فتحة رقمية عالية مشتركة (NA) على مجهر مقلوب. في حين أنه من الممكن من الناحية الفنية لبناء هذه الأطباق TFM متعددة الآبار باستخدام الزجاج أرق، وهشاشة هذه في تجهيز والتجمع قد يؤدي إلى ارتفاع معدل الكسر، ويمكن أن تعمل على عكس نهج الإنتاجية أعلى. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء مزيد من الدراسة في طلاء السطح من أجل التطبيقات الأوسع للجهاز.
باستخدام شكل متعدد الآبار، يمكن إجراء تجارب عالية الإنتاجية. شكل متعدد جيدا مكننا من دراسة التغيرات المادية لخلايا NMuMG خلال EMT مع العلاج TGF-β مع مجموعات من تركيزات مختلفة وأوقات حضانة مختلفة في طبق واحد. تصنيع أجهزة الإجهاد الجر مع هيدروجيلات مثل هلام بولياكريلاميد لديها العديد من القيود. مع العنصر المهيمن هو الماء، هيدروجيلات حساسة لتركيزات الملح (osmolarity)، ودرجة الحرارة، والرطوبة، وتغيرات درجة الحموضة. التغييرات في أي من هذه الخصائص يمكن أن يؤدي إلى تغيير في الخصائص الميكانيكية للمواد، مما يتطلب عناية إضافية في استخدام العينات وتفسير النتائج. وعلاوة على ذلك، وجود المياه، هيدروجيلات هي أكثر عرضة للعدوى، مما يتطلب رعاية إضافية. على النقيض من هيدروجيلات المياه القائمة، PDMS القائمة على السيليكون مستقرة وخاملة. مرة واحدة ملفقة، فإنه يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى دون الحاجة إلى أي مناولة خاصة أو ظروف التخزين.
الطبيعة غير قابلة للنفاذ من PDMS يسمح لنا بتلفيق الركيزة متجانسة، وضمان أن جميع الآبار متطابقة حقا في سمك الركيزة وتكوين، مع السماح الكيمياء الحيوية فريدة من نوعها ليتم تطبيقها في وسائل الإعلام، أو خلايا مختلفة لاستخدامها في كل حسنا. يسمح السطح القائم على هيدروجيل للعوامل المنافية باختراقها والسفر من خلالها، مما يستلزم إضافة هيدروجيل إلى الآبار التي يتم تقسيمها لمنع التلوث المتبادل.
تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة انقباض الخلايا، وهو جانب أساسي وفي كل مكان من بيولوجيا الخلايا، بطريقة عالية الإنتاجية، مما يتيح الحصول على بيانات أكثر كفاءة وقابلة للاستنساخ. وهذا يساعد على ترجمة الفحص المجهري لقوة الجر إلى فحص قوة الانقباض، مما يسمح للباحثين باستخدام الانقباض حقا كمقياس لنشاط الخلية، أو فعالية المركب. كمنهجية، وهذا له تطبيقات واسعة عبر العلوم البيوفيزيائية والطبية الحيوية، من فهم فيزياء الخلايا، إلى وصف واختبار المركبات الصيدلانية ضد أنواع الخلايا الموحدة، أو ربما متخصصة للغاية الخلايا الفردية للطب الشخصي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE وRK لديهم مصلحة في تقنيات الخلية الحية، وهي الشركة التي تقوم بتلفيق المواد الموصوفة في هذه المقالة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون توم [كودجر], مايكل [لندري], و [كريستوفر] [ج.]. [برّتّ] لمساندة مع حبة تأليف. A.J.E. يعترف مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية منح RGPIN/05843-2014 و EQPEQ/472339-2015، منحة المعاهد الكندية للبحوث الصحية رقم 143327، منحة الجمعية الكندية للسرطان رقم 703930، والمؤسسة الكندية للابتكار #32749 المشروع. ر. كريشنان يعترف بمنحة المعاهد الوطنية للصحة رقم R21HL123522 و R01HL136209. وقد تلقى من مؤسسة البحوث الشهية في كيبيك الدعم من مؤسسة البحوث الشهية، ومؤسسة البحوث الطبيعية والتكنولوجيات في كيبيك. يشكر المؤلفون يوهانان إيديكولا على مساعدته في الفيديو والمخطوطة وزيشين هي للمساعدة في إعداد الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
