Summary
Vi præsenterer en høj gennemløb Traction Force assay fremstillet med silikone gummi (PDMS). Denne nye analyse er egnet til at studere fysiske ændringer i cellernes kontraktilitet under forskellige biologiske og biomedicinske processer og sygdomme. Vi demonstrerer denne metodes anvendelighed ved at måle en TGF-β afhængig stigning i kontraktilitet under epithelial-til-mesenchymal overgangen.
Abstract
Cellulære kontraktilitet er afgørende i forskellige aspekter af biologi, kørsel processer, der spænder fra motilitet og division, til væv sammentrækning og mekanisk stabilitet, og repræsenterer et centralt element i multi-cellulære dyrs liv. I vedklædige celler ses acto-myosin-sammentrækning i trækkraft, som cellerne udøver på deres substrat. Dysregulering af cellulære kontraktilitet vises i et utal af patologier, hvilket gør kontraktilitet et lovende mål i forskellige diagnostiske tilgange ved hjælp af Biofysik som en metrisk. Desuden kan nye terapeutiske strategier være baseret på at korrigere den tilsyneladende fejl i celle kontraktilitet. Disse anvendelser kræver imidlertid en direkte kvantificering af disse kræfter.
Vi har udviklet silikoneelastomer-baseret Traction Force mikroskopi (TFM) i et paralleliseret multi-Well-format. Vores brug af en silikone gummi, specifikt Polydimethylsiloxan (PDMS), snarere end den almindeligt anvendte hydrogel polyacrylamid (PAA) gør os i stand til at gøre robuste og inaktive substrater med ubestemt hylde-liv kræver ingen særlige opbevaringsforhold. I modsætning til søjle-PDMS-baserede tilgange, der har en modulus i GPa-området, er de PDMS, der anvendes her, meget overensstemmende, lige fra ca. 0,4 kPa til 100 kPa. Vi skaber en platform til højt gennemløb for TFM ved at opdele disse store monolitiske substrater rumligt i biokemisk uafhængige brønde, hvilket skaber en multi-Well platform for Traction Force screening, der er kompatibel med eksisterende multi-Well-systemer.
I dette manuskript bruger vi dette multi-Well Traction Force system til at undersøge epitelial til Mesenchymal Transition (EMT); Vi inducerer EMT i NMuMG celler ved at udsætte dem for TGF-β, og at kvantificere de biofysiske ændringer under EMT. Vi måler kontraktilitet som en funktion af koncentrationen og varigheden af TGF-β eksponering. Vores resultater her demonstrere nytten af angreb TFM i forbindelse med sygdom biophysics.
Introduction
Acto-myosin kontraktilitet er et væsentligt element i aktiv celle mekanik, påvirker celle adfærd fra motilitet og spredning til stamcelle differentiering. I væv, kontraktilitet drevaktivitet fra Polar adskillelse i embryo Genesis, til luftvejs indsnævring og hjerteaktivitet. Kritisk, at generere spændinger, celler skal først overholde deres ekstracellulære miljø. Derved genererer denne kontraktilitet trækkraft kræfter på deres omgivelser. Trækkraft mikroskopi (TFM) er dukket op i en lang række former som en måde at kvantificere disse kræfter fra forskellige celler under forskellige forhold.
TFM-området har oplevet en exceptionel bredde af innovation og anvendelse, og resultaterne har banet vejen for nye perspektiver inden for biologi, som inkorporerer mekanik og fysiske kræfter. Begyndende med rynkning silikone substrater1, forskere har anvendt forskellige teknikker til at målecelle trækkraft kræfter. Disse tilgange er blevet løbende forbedret og har nu nået et niveau af beslutning om rækkefølgen af flere mikron2. Der er imidlertid opstået et hovedproblem, som er vanskeligheden ved at skabe substrater af passende lav moduli ved hjælp af de tilgængelige silikegler. For at omgå dette problem, blev polyacrylamid vedtaget som en erstatning på grund af den lethed at skabe substrater på rækkefølgen af 1-20 kPa3. Vi har for nylig implementeret meget kompatible silikegler i TFM4, hvilket giver os mulighed for at fabrikere det samme sortiment af moduli som polyacrylamid, men med fordelene ved inert og robust silikone.
TFM tilgange har gjort det muligt værdifulde mechano-biologiske opdagelser, men, en vedvarende mangel er deres kompleksitet, ofte begrænser deres anvendelse til forskere i ingeniørvidenskab eller fysiske videnskaber discipliner. Dette skyldes for en stor del de detaljerede kalibreringer og udfordrende beregninger, der er nødvendige for at kvantificere kontraktilitet. En anden væsentlig udfordring er, at TFM metoder er stort set lav-gennemløb og derfor dårligt egnet til at studere mange forskellige betingelser eller populationer samtidigt5. Dette har vist en flaskehals, som har hæmmet overdragelsen af TFM fra en specialist Biofysik til bredere biologiske og farmakologiske anvendelser.
Vi har for nylig udviklet en multi-Well format TFM plade, som giver forskerne mulighed for at parallelér deres TFM målinger for hurtigere kvantificering af kontraktilitet Metrics, mens udforske virkningen af forskellige forbindelser og også ved hjælp af mindre reagenser4 . Denne metode har bred nytte i forskellige mechanobiologi undersøgelser, fra at evaluere virkningerne af forbindelser på cellulære aktivitet, at kvantificere de kontraktile ændringer i differentiering eller sygdom.
Et område af biomedicinsk forskning, der vil drage stor fordel af TFM er studiet af, hvordan fysiske stikord påvirker de maligne fænotyper af kræftceller. Metastase, ansvarlig for 90% af Cancer-relaterede dødsfald, er karakteriseret ved kræftceller forlader deres oprindelige tumor site og koloniserer et sekundært sted. For celler til at migrere gennem vævet og passere ind og ud af det vaskulære system, skal de radikalt ændre deres former til at klemme gennem disse fysiske barrierer, samtidig med at generere betydelige kræfter til at trække sig vej langs ekstracellulære matrix eller flytte mellem andre Celler. Disse kræfter overføres til substratet gennem fokale vedhæftnings interaktioner2,3og kan kvantificeres ved hjælp af TFM. Mens kræft er biologisk kemisk usædvanligt forskelligartet, med en ekspanderende repertoire af kendte mutationer og protein ændringer, nogle almindelige fysiske ændringer er blevet observeret; i en række forskellige kræftformer, herunder bryst-, prostata-og lungekræft, har metastatiske celler vist sig at udøve 2-3 gange Trækkraft kræfterne i ikke-metastatiske celler6,7,8. Disse resultater tyder på, at der kan være en stærk sammenhæng mellem metastatisk progression og trækkraft kræfterne udøvet af celler; Det er imidlertid vanskeligt at undersøge de detaljerede tidsafhængige ændringer i kontraktilitet.
Epitel-til-mesenchymal Transition (EMT) er en proces, hvorved cellerne reducerer vedhæftnings-og tight-Junction medieret celle-celle adhæsion, bliver mere vandrende og invasiv. Ud over fysiologiske funktioner, der omfatter sårheling og udviklingsmæssige processer, EMT er også en proces udnyttes under metastase, hvilket gør det til et nyttigt model system til at studere denne proces. Ved hjælp af TGF-β, vi kan fremkalde EMT i murine bryst epitelceller (nmumg)9 at direkte kvantificere de fysiske ændringer under denne transformation, og karakteriserer den tid og dosis-afhængige effekter af TGF-β på EMT og celle kontraktilitet. I denne artikel viser vi nytten af denne tilgang ved at måle ændringerne i kontraktilitet under en induceret EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: følgende protokol vil vejlede forskerne i opdigte og ved hjælp af multi-Well TFM skålen vist i figur 1.
1. fremstilling af PDMS silikone substrater
- Fremstilling af PDMS silikone gummiblanding baseret på en sammensat blanding af to kommercielt tilgængelige kits.
- Tilføj del A og del B af PDMS Kit (f. eks. GEL-8100, se tabellen over materialer) i et 1:1 vægt forhold i 50 ml røret.
Bemærk: blandingen blandes på en rotator med en hastighed, der er langsom nok til, at blandingen flyder frem og tilbage under revolutionen for at sikre fuldstændig blanding. - Tilsæt den nødvendige mængde Hærdningsmiddel til den ønskede modulus af substratet.
Bemærk: mængden af Hærdningsmiddel, der skal tilsættes til blandingen, afhænger af den ønskede modulus af substratet og kan typisk variere fra 0,1% til 1,8%. Se tabel 1 og figur 3 for en guide til specifikke kryds linker koncentrationer og resulterende moduli. - Bland formuleringen på rotator i 30-45 min; Sørg for, at rotationen er langsom nok til grundig blanding.
- Tilføj del A og del B af PDMS Kit (f. eks. GEL-8100, se tabellen over materialer) i et 1:1 vægt forhold i 50 ml røret.
- Bundlag: belægning PDMS substrater på glasset slide
- Placer den specialbyggede Chuck illustreret i figur 2 på spin-Coater. Rengør glasset med ethanol eller isopropanol, og tør med en fnugfri serviet. Placer glas sliden i spændepatronen, og tænd for støvsugeren for at holde diaset på plads.
- Anvend uhærdet PDMS ca. 1 cm fra kanterne og arbejd ind mod midten. Anvend nok (3-4 mL) PDMS for at sikre, at hele overfladen bliver dækket.
Bemærk: for at sikre, at PDM'ER er jævnt fordelt på glasoverfladen, kan en pipettespids være nyttig til at sprede PDMS-blandingen fra midten til kanterne. - Spin glasset med PDMS blandingen på et spin-Coater med følgende protokol.
- For at sprede de uhærdede PDMS på diaset, accelerere ved 50 rpm/s fra 0 til 200 rpm; hold på 200 rpm i 1 min.
- For at opnå et 100 μm tykt PDMS-lag skal du accelerere ved 50 rpm/s til 300 RPM og holde i 1 min ved 300 RPM. Forskellige ønskede tykkelser, bortset fra 100 μm, vil kræve specifikke hastighedsværdier.
- For at fjerne, decelererere ved 50 rpm/s til 0 RPM. Deaktiver vakuum og fjern den coatede slide, pas på ikke at røre den coatede overflade.
Bemærk: det er vigtigt at inkludere acceleration og deceleration trin for at sikre en glat kontinuerlig overflade.
Forsigtig: for at sikre, at prøven ikke flyver ud af borepatronen, skal den specialfremstillede holder anvendes til at holde diaset, og ikke stole blot på vakuum og den eksisterende flade Chuck. Denne indehavers detaljer og specifikationer er angivet i figur 2.
- Anbring den Centrifugerings belagte prøve i ovnen ved den anbefalede temperatur for fabrikanten (100 °C) i 2 timer.
Bemærk: overfladen af ovnen, hvor prøven anbringes, skal være fast (dvs. ikke en rist) og en jævn overflade for at sikre en ensartet opvarmning og tykkelse af prøven. En keramisk eller stålplade gør en ideel overflade.
- Top perle lag
- Tilsæt perle opløsning i det passende forhold til den resterende PDMS-blanding.
Bemærk: dette forhold afhænger af koncentrationen af bestanden perle opløsning og den ønskede perle tæthed på prøven. Typiske endelige værdier er 9,2 x 1011 perler/ml og 0,05-0,2 perler/μm2, og et overskud af perler er generelt at foretrække frem for et utilstrækkeligt beløb. - Bland vulst opløsningen med de uhærdede PDMS. Dette kan opnås ved at placere røret på en rotator i ca. 30 min, vortexning for 1-2 min, eller sonikering i 30 min. Disse metoder kan kombineres.
Bemærk: i vores applikation finder vi, at sonikering er effektiv til at bryde perle aggregater, og rotation er effektiv til at blande. Syntetiseret forvaltnings perler kan aggregere i opbevaring. Før brug kan de resuspenderes i hexan og soniseret. Hvis der er betydelige store aggregater, kan man filtrere perlen suspension gennem en 5 μm sprøjte filter. Dette filtreringstrin er valgfrit. Det hjælper til at belægge prøven med monodispergerede perler, men en betydelig brøkdel af perler kan gå tabt i filteret. - Tag diaset ud af ovnen, lad det køle af til stuetemperatur, og Placer det på spin-Coater.
- Tilsæt 3-4 mL af perlen og den uhærdede PDMS-blanding på overfladen af den coatede prøve.
Bemærk: blandingen med perler tilsat er mindre viskøs på grund af Hexanen. Sørg for ikke at røre ved overfladen af substratet, da det kan beskadige det allerede coatede PDMS substrat. Desuden kan perle blandingen i første omgang ikke våd overfladen; Pas på, at blandingen ikke straks strømmer ud af den hærdede PDMS overflade. - Drej prøven med følgende protokol.
- At sprede perlen og uhærdet PDMS blanding, accelerere ved 100 rpm/s fra 0 til 500 rpm; hold på 500 rpm i 1 min.
- For at opnå et tyndt lag af perle indlejrede PDMS (~ 1 μm), accelerere ved 200 rpm/s fra 500 til 5000 RPM; hold på 5000 RPM for 10 s.
- For at fjerne, decelererere ved 100 rpm/s til 0 RPM. Deaktiver vakuum og fjern coated slide, pas på ikke at røre den coatede overflade.
- Anbring den Centrifugerings belagte prøve i ovnen ved 100 °C i 1 time.
Bemærk: temperaturer over 100 °C eller varigheder længere end 1 time kan reducere vulst fluorescens. Sørg for, at ovntemperaturen er indstillet til 100 °C og ikke højere. - Protokollen kan sættes på pause her. For at opbevare prøven skal du dække overfladen for at undgå eksponering for støv og lys. Sørg for, at intet rører overfladen. Prøven er hylde stabil ved stuetemperatur på ubestemt tid.
- Tilsæt perle opløsning i det passende forhold til den resterende PDMS-blanding.
- Montering af pladen
- Tilføj del A (base) og del B (Hærdningsmiddel, f. eks. Sylgard) af et PDMS elastomer-sæt i et 10:1-vægt forhold i 50 mL-røret.
- Bland blandingen på rotator for 30-45 min.
Bemærk: til én plade blandes 5 mL base med 0,5 mL Hærdningsmiddel. Der kan tilsættes op til 1 mL hexan for at reducere blandingens viskositet. - Påfør blandingen til bunden af skillelinjen og sprede blandingen.
Bemærk: skillelinjen skal placeres på hovedet. - Læg substratet på skillelinjen på hovedet.
- Prøven placeres på hovedet i ovnen ved 65 °C i 2 timer.
- Tag prøver fra ovnen og rengør bunden af glasset med 70% ethanol eller isopropanol for at fjerne eventuelle PDMS rester.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. For at opbevare prøven skal du anbringe et låg på substratet og vikleenheden i aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lyset. Prøven er hylde stabil ved stuetemperatur på ubestemt tid. Den opdeler udnyttet i denne metode er i en 96-Well format; Men, forskerne kan ansætte andre formater (384-godt, 2-godt, 4-godt, 8-godt, osv.) afhængigt af ønskede eksperiment opsætninger og tilgængelighed af opdeling strukturer. Nogle yderligere optimering kan være påkrævet.
2. overflade funktionalisering
- 80 μL af en sulfo-SANPAH alikvot opløses i 40 mL 0,1 M HEPES buffer (pH 7-9).
Bemærk: Forbered sulfo-SANPAH-aliquoter ved at opløse 100 mg sulfo-SANPAH pulver i 2 mL sterilt dimethylsulfoxid (DMSO). Forbered 0,1 M HEPES buffer ved at fortynde 50 mL HEPES i 450 mL sterilt deioniseret vand og Filtrer gennem et 0,22 μm pore filter. - Tilsæt 200 μL fortyndet sulfo-SANPAH-opløsning til hver brønd af 96-brønd pladen.
- Udsæt pladen for UV-lys (300-460nm) i passende afstand og varighed.
Bemærk: efter UV-eksponering bør farven af opløsningen være mørkere. UV-eksponerings afstand og-varighed afhænger af UV-lampens effekt. I vores ansøgning udsætter vi for 10-15 min i en afstand af 5 cm. - Fjern sulfo-sanpah-opløsningen fra brøndene og tilsæt 200 μl 5 μg/ml fibronektin-opløsning til hver brønd.
Bemærk: forsker-specificeret protein kan anvendes til overfladebelægning. Nogle almindeligt anvendte proteiner er kollagen, fibronectin, og Laminin. Vi har fundet sulfo-SANPAH at være den mest effektive metode, og plasma rengøring, mens nogle gange beskæftiger i PDMS frarådes, da det skaber et siliciumdioxid lag og synligt skader overfladen. - Pladen inkubates ved 4 °C natten over.
Bemærk: forskellige inkubations metoder kan anvendes afhængigt af det protein, der anvendes til belægning. - Fjern fibronektin opløsning og vask hver brønd med fosfat-bufferet saltvand (PBS) to gange.
- Anbring et låg på prøven.
- Tilsæt 200 μL PBS til hver brønd.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Fibronectin-coatede prøver kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
3. UV-sterilisering
- Steriliser prøven under UV-lys i et biologisk sikkerhedskabinet i 30 minutter.
Bemærk: længere UV-eksponeringstider kan have en negativ indvirkning på vulst fluorescens. Alle efterfølgende trin skal udføres under sterile forhold.
4. cellekultur
- Fjern PBS fra hver brønd og tilsæt 200 μL af cellerne suspenderet i kultur medier til hver brønd.
- Plade cellerne ved den ønskede celletæthed. Celletætheden afhænger af det ønskede eksperiment. For enkelt celle undersøgelser bør cellerne være mindst 50 μm fra hinanden, og cellerne i nærheden af billedbehandlings vinduets kanter bør ikke inkluderes i TFM-målingen. For enkeltlags-celler skal billedvinduet have visningsfeltet dækket med et konfluent-lag af celler.
- Forbered den komplette vækst kultur medier for NMuMG celler ved at supplere DMEM med 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL insulin, 1% penicillin-streptomycin, 1 mM L-glutamin, og 0,5 μg/mL amphotericin B.
- Insulin lageret forberedes ved rekonstitution i syrnet vand (2,5 mL iseddike i 130 mL deioniseret vand) til en koncentration på 10 mg/mL. Stamopløsningen opbevares ved 4 °C. Vent, indtil opløsningen er klar, og Filtrer derefter gennem et 0,22 μm pore filter.
- TGF-β tilføjelse
- Til klargøring af TGF-β-bestanden opløses 2 μg TGF-β i 100 μL 10 mM citronsyre (pH 3,0) og filter steriliserer med 0,22 μm porer. Vortex røret og alikvot i de ønskede volumener. Aliquoterne opbevares ved-80 °C.
- Tilsæt 1,5 μL TGF-β stamopløsning til 10 mL af hele cellekultur mediet for at danne cellekultur mediet med den endelige TGF-β-koncentration på 3 ng/mL.
Bemærk: for at lave 10 mM pH 3,0 citronsyre fortyndes syren i vand og justeres pH til 3,0 ved tilsætning af HCl.
5. data indsamling
- For hver position, erhverve mindst ét billede af forvaltnings partikler og celler. Fokuser på vulst laget.
Bemærk: pixel størrelse skal optimeres baseret på størrelsen af de fiduciære partikler og billedbehandling metode, der anvendes. I dette program, forfatterne bruger en 10x 0,4 NA mål, og billeder er erhvervet med 1024 x 1024 opløsning, med 455 nm/pixel. Generelt er det nyttigt at bevare en opløsning på mindst ca. 1-5 pixels pr. perle; Her er perler polydispers og har en individuel størrelse på 300-500 nm. Det er afgørende, at de fluorescerende forvaltnings perler være i fokus for billeder, der skal anvendes til TFM beregninger. Den fokus og billeddannelse kvaliteten af perlerne bør prioriteres over billeddannelse cellerne selv. Der bør ikke være krydstale mellem forskellige kanaler, især fluorescens ikke fra de forvaltnings perler, der vises i billedernes spektre af perlerne. - Når alle positioner af interesse er blevet registreret, tilføje løsrivelse løsning til hver brønd at erhverve kraft-fri reference billeder af de forvaltnings partikler.
- For at tilberede opløsningen af en celle løsning blandes en vandig opløsning indeholdende 2% TritonX-100, 50 mM natrium-Azid og 500 mM kaliumhydroxid.
Bemærk: ovenstående er tilvejebragt som et eksempel på en effektiv løsning til løsrivelse. Forskellige løsrivelse løsninger på forskernes skøn kan bruges til at frigøre cellerne fra substrat overfladen.
- For at tilberede opløsningen af en celle løsning blandes en vandig opløsning indeholdende 2% TritonX-100, 50 mM natrium-Azid og 500 mM kaliumhydroxid.
6. billedanalyse
- Foretag en passende billedanalyse efter behov.
Bemærk: analyse software blev udviklet in-House. Billedanalyse kan ske med skræddersyet software eller software, der er tilgængelig online.
7. syntese af perler
Bemærk: følgende protokol er baseret på den syntesemetode, der er beskrevet af Klein et al.10.
- Under en røg hætte, forberede tre-hals kolbe med en vandkølet tilbageløbs kondensator.
Forsigtig: Indstil en syntese i en godt ventileret kemisk røg hætte. - Tilsæt 0,5 ml PDMS-stabilisator og fluoroforet til kolben.
- Udstyre en hals med en gummi septum med en nitrogen indsugnings kanyle og en stikkontakt nål og udstyre den anden hals med en gummi septum for at tilføje reagens med en sprøjte.
- Der tilsættes 100 mL vandfri hexan i 250 mL til kolben, og der tilsættes en lille magnetisk Stir-stang.
- Kolben anbringes i mineral Oliebadet ved 75 °C og renses med nitrogen gas i 1 time.
- 6 mL methylmethacrylat tilsættes til en 25 mL rund bund kolbe.
- Tilsæt 0,100 g 2, 2 '-azobisisobutyronitril (AIBN) til den runde bund kolbe og Tøm blandingen med nitrogen gas i 1 time.
Bemærk: Skyl methylamethacrylat gennem færdigpakket kolonne for at fjerne inhibitorer før brug. Tilsæt methylamethacrylat og AIBN-blandingen til trehals kolben. - Opløsningen bliver i første omgang uklar og bliver mælkeagtig. Lad reaktionen køre i 3 timer efter opløsningen bliver uklar.
- Efter 3 h anbringes kolben i et isvandbad.
- Vakuum-Filtrer opløsningen med groft filtrerpapir.
- Filtratet centrifugeres og gensuspenderes partiklerne i hexan.
Bemærk: mængden af hexan, der skal tilsættes, afhænger af den ønskede koncentration af perlens opløsning. Sonikering letter re-dispersion af vulst partikler i hexan opløsning. Perler produceret af forfatterne har polydispers diametre på ca. 300-500nm. På grund af brugen af Cross-korrelations mønster sporing til at bestemme forskydninger, monodispers perler er ikke påkrævet.
8. protokol om rheology-måling
Bemærk: Rheology er ikke påkrævet for hver forsker eller eksperiment, men er nødvendigt at kvantificere moduli for nye formuleringer af PDMS. I denne protokol anvender vi en forskydning rheometer til at måle virkningerne af Cross linker, frekvens, og stamme på moduli af PDMS prøver. Afhængigt af de tilgængelige værktøjer og ekspertise, moduli kan også måles ved hjælp af mange andre mekaniske analysetilgange. Derudover kan forskere, der bruger denne protokol, vælge at bruge vores publicerede moduli præsenteret i tabel 1, figur 3 og figur 4.
- Brug et rheometer med en parallel plade geometri på 25 mm diameter. Andre geometrier kan anvendes.
- Initialiser systemet, og Kalibrer enheden og målesystemet (parallel plade, d = 25 mm). Efter måling af nulforskellen, begynde at indlæse PDMS prøve.
- Så snart PDMS elastomer og binding agent har været blandet, pipet blandingen på bundpladen af rheometer.
- Flyt spindlen ned for at kontakte toppen af PDMS-prøven helt.
- Trim forsigtigt den belastede prøve overskydende fra bundpladen.
- I en stamme feje test, anvende stigende stammer for hver sammensætning med forskellige binding tæthed for at sikre polymer struktur forbliver i den lineære viskoelastisk regime under alle forskydnings målinger.
Bemærk: stamme værdier, der er relevante for celle undersøgelser, er typisk i intervallet 0,1-10%. Vi har fundet PDMS at være lineær op til ca 100% stamme. - Mål Dynamic shear Storage modulus (G ') og tabs modulus (G ′ ′) for PDMS-netværket i en tids feje test med en frekvens på 1 Hz og en oscillatorisk forskydnings stamme på 0,5% ved 100 °C.
- For at bestemme viskoelasticiteten og tids afhængigheden af det endelige PDMS-netværk skal du anvende en frekvens feje test med frekvens på 0,1-100 Hz og oscillerende forskydnings stamme på 0,5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før tilsætning af TGF-β, en flydende enkeltlags af celler har en brosten som form og er tæt pakket. Ved TGF-β behandling, celler bliver mere aflange i morfologi, forstørre celleområdet og erhverve en mere mesenchymal fænotype. Ved hjælp af multi-Well enhed fremstillet med bløde PDMS elastomerer, de fysiske egenskaber af celler i alt 17 forskellige betingelser blev undersøgt. Cellerne blev behandlet med fire forskellige TGF-β-koncentrationer (0,5, 1, 2 og 4 ng/mL) og fire forskellige inkubationstider (12, 24, 48, 96 h), og disse resultater er opsummeret i figur 5. Cellerne behandlet med TGF-β anvendte større trækkraft belastninger og stamme energier end de celler, der dyrkes uden TGF-β. Celler inkuberet med TGF-β for 96 h viste de største trækkraft belastninger og stamme energier. Cellerne anvendte større belastninger og stamme energier, når de blev behandlet med højere koncentration af TGF-β. Forskellen i distraktionerne og stamme energier var mere tydelig ved længere inkubationstider.
Overfladen af substratet skal være glat og ensartet belagt med ligands, såsom fibronektin eller kollagen. Ridset overflade og/eller ikke-ensartet belægning af ligander kan føre til forkert celle fastgørelse, hvilket resulterer i unøjagtige trækkraft måling. Figur 6 viser de lokaliserede trækkraft belastninger på grund af den ikke-ensartede substrat overflade.
Figur 1 : Oversigt over multi-brønd plade fabrikation. (A) en Special skåret glas rutsjebane er udgangspunktet. B) glas sliden er belagt med et tykt (~ 100 ΜM lag PDMS). (C) et lag af forvaltnings perler (vist med grønt) er derefter spin-coated i et ~ 1 μm tykt lag på toppen af det foregående lag. (D) den multi-brønd opdeler er omhyggeligt placeret på toppen af den forvaltnings perle lag. (E) den komplette multi-brønd plade er samlet og klar til brug eller opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Custom Chuck til spin-Coater. For at forhindre det nederste glas (hvor PDMS er belagt) fra at flyve ud af standard spin-Coater Chuck, er en skræddersyet holder placeret på Chuck. A) en specialfremstillet holder til spin-Coater-Chuck. B) konstruktionstegning af holderen med alle dimensioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Substrat stivhed med skiftende krydsbinderens-koncentration (WT%). PDMS blandinger tilberedes som beskrevet, med den ekstra krydsbinderens procentdel øge den elastiske modulus indtil et maksimum på 100 kPa ved 1,8 vægtprocent (WT%) krydsbinderens. Som en guide, modulus som en funktion af Cross linker er fit lineært, som kan bruges af forskere til at formulere deres egen blanding på en bestemt ønskede modulus inden for dette interval. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Rheologi af PDMS elastomer indeholdende 0, 0,15, 0,36 og 1 vægt% af link-agenter ved en temperatur på 100 °c. Trekants symboler indikerer tab modulus (G ' ') og firkantede symboler angiver Storage modulus (G '). A) oscillatorisk tids fejning medenfrekvens på 1 Hz og forskydnings stamme på 0,5% under gelering. (B) oscillatory frekvens feje af PDMS netværk ved forskydnings stamme på 0,5%. (C) stamme SWEEP af PDMS-netværk med en frekvens på 1 Hz. Alle datapunkter blev erhvervet i tre eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative resultater udnytte trækkraft stress enhed med multi-Well format. Monolayer af celler under forskellige forhold blev dyrket i en multi-Well-enhed for at måle kontraktilitet og stamme energi. (A) graf af trækkraft belastninger med stigende TGF-β inkubationstid for forskellige TGF-β koncentrationer. Trækkraft belastninger steg med stigende TGF-β koncentrationer og inkubationstiden. Alle data er statistisk signifikante med hensyn til kontrol (dvs. ingen TGF-β) undtagen følgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. (B) graf af stamme energi med stigende TGF-β inkubationstid for forskellige TGF-β koncentrationer. Stamme energier steg med stigende TGF-β koncentrationer og inkubationstiden. Prøvestørrelser spænder fra n = 7 til n = 15. Alle data er statistisk signifikante med hensyn til kontrol (dvs. ingen TGF-β) undtagen følgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0,5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. Statistisk signifikans blev bestemt ved brug af Krukan Wallis-testen, som ikke antager en normal fordeling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Repræsentative resultater fra et suboptimalt (a, B) og et tilfredsstillende (C, D) eksperiment. A) refleksions billede af substrat overfladen. Uønskede forurenende stoffer, som kan omfatte støv eller fibre, eller materielle defekter såsom ridser er til stede på substrat overfladen. B Stress kort over celle kontraktilitet: på grund af den ikke-ensartede overflade observeres uregelmæssige og unøjagtige træk påvirkninger omkring objekterne. C Refleksions billede af substrat overfladen. Der er ingen synlige forurenende stoffer. D Stress kort over Cell contractility: ingen artefakt diskontinuiteter er synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kryds linker koncentration (WT%) | G ' (PA) | Standardafvigelse | E (kPa) | Standardafvigelse |
| 0 | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4,027 | 0,245 | 12,081 | 0,73 |
| 0,75 | 16,01 | 0,49 | 48,03 | 1,2 |
| 1 | 18,44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1,088 |
| 2 | 33,36 | 0,67 | 100,08 | 1,1 |
Tabel 1: Substrat stivhed med skiftende krydsbinderens-koncentration (WT%). Ved at ændre yderligere kryds linker koncentrationer, PDMS substrater af den ønskede Youngs moduli er fabrikeret. PDMS shear moduli blev målt med et rheometer og Youngs moduli blev bestemt. For hvert datapunkt blev der udført 3 uafhængige præparater, og standardafvigelsen blev givet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at denne metode skal lykkes, er det afgørende at have en ensartet belagt prøve med en konstant tykkelse på ca. 100 μm. Modulus bør nøje vælges for at undersøge den fysiske betydning af det biologiske system af interesse. Ved fremstilling af et toplag, bør koncentrationen af de fiducial fluorescerende partikler optimeres for nøjagtig analyse af forskydning og trækkraft stress. Analyse af isolerede enkeltceller kræver et tættere fiduciært lag end måling af konfluent-monolayers. Derudover skal overfladen af substratet have stabil og ensartet belægning af adhæsionsmolekyler som kollagen, fibronectin og Laminin for at sikre korrekt fastgørelse af cellerne til substrat overfladen. Der skal udvises særlig omhu ved fastgørelse af multi-Well-skillelinjen. Det bør placeres uden glidende for at forhindre forsegling PDMS lim fra at blive smurt på kulturen overflade, og den ydre kant skal være nøje afstemt med glas dimensionerne for at forhindre eventuelle lækager på grænsen brønde.
For at undgå, at brønde bliver utætte, skal der påføres en passende mængde PDMS-lim på den veldivider, der holder den på plads. Men, brug af store mængder vil dække cellekultur overflade.
Der skal tilføjes tilstrækkelig mængde PDMS under spin-coating-proceduren. Ved hærdning skal ovnen og stativerne være i niveau. Utilstrækkelige PDMS eller en univelleret ovn kan føre til ujævn PDMS tykkelse.
Perle tæthed skal optimeres for korrekt analyse. Når perlen tæthed ikke er tilstrækkelig, koncentrationen af perlerne i forvaltnings PDMS blanding skal øges. Derudover skal der tilsættes en passende mængde af blandingen til spin belægning. For at sikre korrekt fluorescerende signaler af forvaltnings perle partikler, bør hærdnings tilstand overvåges nøje. Længere tider og højere temperaturer end dem, der er angivet i denne protokol, kan forringe fluorescensen. Forkert protein belægning på overfladen af prøven kan føre til dårlig celle vedhæftning. For at undgå dette skal overfladen rengøres, og udløbet af reagenser såsom sulfo-sanpah og ligander skal kontrolleres. UV-eksponeringstid og styrke skal optimeres. Immunofluorescens eller anden fluorescerende protein konstruktion kan testes for at sikre ensartet ligand belægning.
Enheden fabrikeret med denne metode og sæt af PDMS formuleringer er kun gældende for substrater med Youngs moduli spænder fra 0,4 kPa til 100 kPa. Andre moduli kan være muligt ved hjælp af alternative formuleringer, men det nuværende interval spænder over et stort sæt af fysiologisk relevante værdier. Selv om denne metode er specielt til multi-brønd fabrikation, kan den også bruges til at forberede individuelle slides eller andre slide geometrier, og i disse tilfælde kan yderligere bruger fejlfinding være nødvendig. I denne udførelsesform anvendes en forholdsvis tyk (1 mm) glas rutsjebane, der udelukker fælles høje numeriske blænde (NA) mål på et inverteret mikroskop. Selv om det er teknisk muligt at konstruere disse multi-Well TFM retter ved hjælp af tyndere glas, kan skrøbelighed af disse i behandling og samling resultere i en høj grad af brud, og kan køre i modstrid med den højere gennemløb tilgang. Desuden kan overfladebelægning undersøges yderligere for bredere anvendelser af anordningen.
Ved hjælp af et multi-Well-format er eksperimenter med høj gennemløb mulige. Multi-Well format gjorde det muligt for os at undersøge de fysiske ændringer af NMuMG celler under EMT med TGF-β behandling med kombinationer af forskellige koncentrationer og forskellige inkubationstider i en enkelt skål. Fabrikation af trækkraft stress enheder med silicagelrogeler såsom polyacrylamid gel har flere begrænsninger. Med den dominerende ingrediens er vand, silicagelrogeler er følsomme over for saltkoncentrationer (osmolaritet), temperatur, fugtighed, og ph-ændringer. Ændringer i nogen af disse egenskaber kan føre til ændringer i mekaniske egenskaber af materialet, der kræver ekstra omhu i at bruge prøver og fortolke resultater. Desuden, at have vand, silicagelrogeler er mere modtagelige for infektioner, der kræver ekstra omhu. I modsætning til vandbaserede hydrogels er silikone baserede PDMS stabilt og inert. Når fabrikeret, det kan opbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid uden at kræve nogen særlig håndtering eller opbevaring betingelser.
Den uigennemtrængelige karakter af PDMS giver os mulighed for at fabrikere en monolitisk substrat, sikre, at alle brønde er virkelig identiske i substrat tykkelse og sammensætning, samtidig med at unikke biokemi, der skal anvendes i medierne, eller forskellige celler, der skal udnyttes i hver Godt. En hydrogel-baseret overflade giver åbne systemer faktorer til at trænge igennem og rejse gennem den, hvilket nødvendiggør tilsætning af hydrogel til brønde, der ellers er partitioneret for at forhindre krydskontaminering.
Denne metode giver forskerne mulighed for at studere celle kontraktilitet, et grundlæggende og allestedsnærværende aspekt af cellebiologi, i en høj gennemløb måde, hvilket muliggør mere effektiv og reproducerbar dataindsamling. Dette hjælper med at oversætte trækkraft mikroskopi i kontraktile kraft screening, så forskerne virkelig kan bruge kontraktilitet som en måling for celle aktivitet, eller effekten af en forbindelse. Som en metodologi, dette har brede applikationer på tværs af biofysiske og biomedicinske videnskaber, fra forståelse af fysik af celler, til karakterisering og afprøvning af farmaceutiske forbindelser mod standardiserede celletyper, eller måske højt specialiserede individuelle celler til personlig medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE og RK har interesse i levende celle teknologier, et selskab, der fabrikerer materialer beskrevet i denne artikel.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tom Kodger, Michael Landry og Christopher J. Barrett for hjælp med perle syntese. A.J.E. anerkender naturvidenskab og ingeniør forskning Rådet tilskud RGPIN/05843-2014 og EQPEQ/472339-2015, canadiske institutter for sundhed forskning Grant No. 143327, canadiske Cancer Society Grant No. 703930, og Canadian Foundation for innovation Projekt #32749. R. Krishnan anerkender nationale institutter for sundhedstilskud nr. R21HL123522 og R01HL136209. H.Y. blev støttet af fonds de Recherche santé Québec og fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Forfatterne takker Johanan Idicula for at hjælpe med video og manuskript og Zixin he for at hjælpe med at forberede videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
