Summary
Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
Abstract
La contractilidad celular es esencial en diversos aspectos de la biología, impulsando procesos que van desde la motilidad y la división, hasta la contracción de los tejidos y la estabilidad mecánica, y representa un elemento central de la vida animal multicelular. En las células adherentes, la contracción acto-miosina se ve en las fuerzas de tracción que las células ejercen sobre su sustrato. La disregulación de la contractilidad celular aparece en un sinfín de patologías, haciendo de la contractilidad un objetivo prometedor en diversos enfoques de diagnóstico utilizando la biofísica como métrica. Además, las nuevas estrategias terapéuticas pueden basarse en corregir el mal funcionamiento aparente de la contractilidad celular. Estas aplicaciones, sin embargo, requieren la cuantificación directa de estas fuerzas.
Hemos desarrollado microscopía de fuerza de tracción basada en elastómero de silicona (TFM) en un formato multipozo paralelizado. Nuestro uso de un caucho de silicona, específicamente polidimetilsiloxano (PDMS), en lugar del poliacrilamida de hidrogel (PAA) comúnmente empleado nos permite hacer sustratos robustos e inertes con vidas útiles indefinidas que no requieren condiciones de almacenamiento especializadas. A diferencia de los enfoques basados en pilar-PDMS que tienen un módulo en la gama GPa, el PDMS utilizado aquí es muy compatible, que van desde aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Creamos una plataforma de alto rendimiento para TFM dividiendo estos grandes sustratos monolíticos espacialmente en pozos bioquímicos independientes, creando una plataforma multipozo para el cribado de fuerza de tracción que es compatible con los sistemas multipozo existentes.
En este manuscrito, utilizamos este sistema de fuerza de tracción multipozo para examinar el Epitelial a la Transición Mesenquimal (EMT); inducimos la EMT en las células NMuMG exponiéndolas a TGF-o, y cuantificando los cambios biofísicos durante la EMT. Medimos la contractilidad en función de la concentración y la duración de la exposición a TGF. Nuestros hallazgos aquí demuestran la utilidad del MFT paralelizado en el contexto de la biofísica de la enfermedad.
Introduction
La contractilidad acto-miosina es un elemento esencial de la mecánica celular activa, afectando los comportamientos celulares desde la motilidad y la proliferación hasta la diferenciación de células madre. En los tejidos, la contractilidad impulsa la actividad desde la separación polar en la embriogénesis, hasta la constricción de las vías respiratorias y la actividad cardíaca. Críticamente, para generar tensión, las células primero deben adherirse a su entorno extracelular. Al hacerlo, esta contractilidad genera fuerzas de tracción en su entorno. La Microscopía de Fuerza de Tracción (TFM) ha surgido en una multitud de formas como una manera de cuantificar estas fuerzas de diversas células bajo diferentes condiciones.
El campo del MFT ha visto una excepcional amplitud de innovación y aplicación, y los resultados han allanado el camino para nuevas perspectivas en biología, que incorporan mecánica y fuerzas físicas. A partir de arrugas sustratos de silicona1, los investigadores han aplicado varias técnicas para medir las fuerzas de tracción celular. Estos enfoques se han mejorado continuamente y ahora han alcanzadoun nivel de resolución sobre el orden de varios micras 2. Sin embargo, ha surgido un problema principal, que es la dificultad para crear sustratos de módulos adecuadamente bajos utilizando las siliconas disponibles. Para evitar este problema, la poliacrilamida se adoptó como reemplazo debido a la facilidad de creación de sustratos por el orden de 1-20 kPa3. Recientemente implementamos siliconas muy compatiblesen TFM 4, lo que nos permite fabricar la misma gama de módulos que la poliacrilamida, pero con las ventajas de la silicona inerte y robusta.
Los enfoques de MFT han permitido valiosos descubrimientos mecanobiológicos, sin embargo, una deficiencia persistente es su complejidad, a menudo restringiendo su uso a los investigadores en las disciplinas de ingeniería o ciencias físicas. Esto se debe en gran parte a las calibraciones detalladas y cálculos desafiantes que se requieren para cuantificar la contractilidad. Otro desafío importante es que los métodos de MFT son en gran medida de bajo rendimiento y, por lo tanto, no aptos para estudiar muchas condiciones o poblaciones diferentes simultáneamente5. Esto ha presentado un cuello de botella, que ha obstaculizado la transferencia de MFT de un entorno especializado en biofísica a aplicaciones biológicas y farmacológicas más amplias.
Recientemente hemos desarrollado una placa TFM de formato multipozo, que permite a los investigadores paralelizar sus mediciones de MFM para una cuantificación más rápida de las métricas de contractilidad, mientras exploran el impacto de diferentes compuestos y también utilizan menos reactivos4 . Esta metodología tiene una amplia utilidad en diversos estudios de mecanobiología, desde la evaluación de los efectos de los compuestos en la actividad celular, hasta la cuantificación de los cambios contractilo en la diferenciación o enfermedad.
Un área de investigación biomédica que se beneficiará enormemente de la MFT es el estudio de cómo las señales físicas afectan los fenotipos malignos de las células cancerosas. La metástasis, responsable del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer, se caracteriza por células cancerosas que salen de su sitio tumoral original y colonizan un sitio secundario. Para que las células migren a través del tejido y pasen dentro y fuera del sistema vascular, deben cambiar radicalmente sus formas para exprimir a través de estas barreras físicas mientras generan fuerzas sustanciales para abrirse camino a lo largo de la matriz extracelular o moverse entre otras Células. Estas fuerzas se transmiten al sustrato a través de interacciones de adhesión focal2,3, y se pueden cuantificar utilizando TFM. Mientras que los cánceres son bioquímicamente excepcionalmente diversos, con un repertorio en expansión de mutaciones conocidas y cambios de proteínas, se han observado algunos cambios físicos comunes; en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer esternón, próstata y pulmón, se ha demostrado que las células metastásicas ejercen 2-3 veces las fuerzas de tracción de las células no metastásicas6,7,8. Estos resultados sugieren que puede haber una fuerte correlación entre la progresión metastásica y las fuerzas de tracción ejercidas por las células; sin embargo, los cambios detallados de contractilidad dependientes del tiempo son difíciles de examinar.
La transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso por el cual las células reducen la adhesión de células celulares mediadas por unión mediada y estrecha, cada vez más migratorias e invasivas. Además de las funciones fisiológicas que incluyen la cicatrización de heridas y los procesos de desarrollo, la EMT es también un proceso explotado durante la metástasis, por lo que es un sistema modelo útil para estudiar este proceso. Usando TGF-, podemos inducir la EMT en células epiteliales mamarias murinas (NMuMG)9 para cuantificar directamente los cambios físicos durante esta transformación, y caracterizar el tiempo y los efectos dependientes de la dosis de TGF-o en la EMT y la contractilidad celular. En este artículo, demostramos la utilidad de este enfoque midiendo los cambios en la contractilidad durante una EMT inducida.
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Protocol
NOTA: El siguiente protocolo guiará a los investigadores en la fabricación y el uso de la placa de MFT multi-pozo que se muestra en la Figura1.
1. Preparación de sustratos de silicona PDMS
- Preparación de la mezcla de caucho de silicona PDMS basada en una mezcla compuesta de dos kits disponibles comercialmente.
- Añada la Parte A y la Parte B del kit PDMS (por ejemplo, GEL-8100, consulte la Tabla de Materiales)en una relación de peso 1:1 en el tubo de 50 ml.
NOTA: La mezcla se mezcla en un rotador a una velocidad lo suficientemente lenta como para que la mezcla fluya de un lado a otro durante la revolución para asegurar una mezcla completa. - Agregue la cantidad necesaria de agente de curado para el módulo deseado del sustrato.
NOTA: La cantidad de agente de curado que se añadirá a la mezcla depende del módulo deseado del sustrato y normalmente puede variar de 0.1% a 1.8%. Consulte la Tabla 1 y la Figura 3 para obtener una guía sobre las concentraciones específicas del retitulador y los módulos resultantes. - Mezclar la formulación en el rotador durante 30-45 min; asegurar que la rotación sea lo suficientemente lenta como para una mezcla completa.
- Añada la Parte A y la Parte B del kit PDMS (por ejemplo, GEL-8100, consulte la Tabla de Materiales)en una relación de peso 1:1 en el tubo de 50 ml.
- Capa inferior: recubrimiento de sustratos PDMS en la corredera de vidrio
- Coloque el mandril personalizado que se ilustra en la Figura 2 en el spin-coater. Limpie el vaso con etanol o isopropanol y séquelo con una toallita sin pelusas. Coloque el portaobjetos de vidrio en el mandril y encienda la aspiradora para mantener la diapositiva en su lugar.
- Aplique PDMS sin curar aproximadamente 1 cm de los bordes y trabaje hacia el centro. Aplique suficiente (3-4 ml) PDMS para asegurarse de que toda la superficie estará cubierta.
NOTA: Para asegurarse de que el PDMS se extiende uniformemente en la superficie del vidrio, una punta de pipeta puede ser útil para extender la mezcla PDMS desde el centro hasta los bordes. - Gire el vidrio con la mezcla PDMS en un spin-coater con el siguiente protocolo.
- Para distribuir el PDMS no curado en la diapositiva, acelere a 50 rpm/s de 0 a 200 rpm; 200 rpm durante 1 min.
- Para alcanzar una capa PDMS de 100 m de espesor, acelere a 50 rpm/s a 300 rpm y mantenga pulsado durante 1 min a 300 rpm. Diferentes espesores deseados que no sean 100 m requerirán valores de velocidad específicos.
- Para extraer, desacelerar a 50 rpm/s a 0 rpm. Desactive el vacío y retire el portaobjetos recubierto, teniendo cuidado de no tocar la superficie recubierta.
NOTA: Es importante incluir los pasos de aceleración y desaceleración para garantizar una superficie continua y suave.
ADVERTENCIA: Para asegurarse de que la muestra no vuela fuera del mandril, el soporte hecho a medida debe utilizarse para sujetar la corredera, y no depender simplemente del vacío y el mandril plano existente. Los detalles y especificaciones de este titular figuran en la Figura2.
- Coloque la muestra recubierta de espín en el horno a la temperatura recomendada por el fabricante (100 oC) durante 2 h.
NOTA: La superficie del horno donde se coloca la muestra debe ser sólida (es decir, no una rejilla de alambre) y nivelar la superficie para garantizar el calentamiento y el espesor uniformes de la muestra. Una placa de cerámica o acero hace una superficie ideal.
- Capa de cuentas superior
- Agregue la solución de cordón en la proporción adecuada a la mezcla de PDMS restante.
NOTA: Esta relación depende de la concentración de la solución de cordón de material y de la densidad de perlas deseada en la muestra. Los valores finales típicos son 9,2 x 1011 perlas/ml y0,05-0,2 perlas/m 2, y un exceso de perlas es generalmente preferible a una cantidad inadecuada. - Mezcle la solución de cuentas con pdmS sin curar. Esto se puede lograr colocando el tubo en un rotador durante aproximadamente 30 minutos, vórtice durante 1-2 min, o sonicación durante 30 min. Estos métodos pueden combinarse.
NOTA: En nuestra aplicación, encontramos que la sonicación es eficaz en la ruptura de agregados de cuentas, y la rotación es eficaz en la mezcla. Las perlas fiduciarias sintetizadas pueden acumularse en el almacenamiento. Antes de su uso, pueden ser resuspendidos en hexano y sonicados. Si hay agregados grandes significativos, se puede filtrar la suspensión del cordón a través de un filtro de jeringa de 5 m. Este paso de filtración es opcional; ayuda a recubrir la muestra con cuentas monodispersas, pero una fracción significativa de cuentas puede perderse en el filtro. - Saque el portaobjetos del horno, deje enfriar a temperatura ambiente y colóquelo en el spin-coater.
- Agregue 3-4 ml del cordón y la mezcla PDMS no curada a la superficie de la muestra recubierta.
NOTA: La mezcla con perlas añadidas es menos viscosa debido al hexano. Asegúrese de no tocar la superficie del sustrato, ya que puede dañar el sustrato PDMS ya recubierto. Además, la mezcla de cuentas puede inicialmente no mojar la superficie; cuidar que la mezcla no fluya inmediatamente de la superficie de PDMS curada. - Gire la muestra con el siguiente protocolo.
- Para esparcir el cordón y la mezcla PDMS no curada, acelere a 100 rpm/s de 0 a 500 rpm; 500 rpm durante 1 min.
- Para lograr una capa delgada de PDMS incrustado en cuentas (1 m), acelere a 200 rpm/s de 500 a 5000 rpm; 5000 rpm durante 10 s.
- Para extraer, desacelerar a 100 rpm/s a 0 rpm. Desactive el vacío y retire el portaobjetos recubierto, teniendo cuidado de no tocar la superficie recubierta.
- Colocar la muestra recubierta de espín en el horno a 100oC durante 1 h.
NOTA: Las temperaturas por encima de 100 oC o duraciones superiores a 1 h pueden reducir la fluorescencia del cordón. Asegúrese de que la temperatura del horno esté a 100 oC y no más alta. - El protocolo se puede pausar aquí. Para almacenar la muestra, cubra la superficie para evitar la exposición al polvo y a la luz. Asegúrese de que nada toque la superficie. La muestra es estable en el estante indefinidamente a temperatura ambiente.
- Agregue la solución de cordón en la proporción adecuada a la mezcla de PDMS restante.
- Montaje de la placa
- Añada la Parte A (base) y la Parte B (agente de curado, por ejemplo, Sylgard) de un kit de elastómero PDMS en una relación de peso de 10:1 en el tubo de 50 ml.
- Mezclar la mezcla en el rotador durante 30-45 min.
NOTA: Para una placa, mezcle 5 ml de base con 0,5 ml de agente de curado. Se pueden añadir hasta 1 ml de hexano para reducir la viscosidad de la mezcla. - Aplique la mezcla en la parte inferior del divisor y extienda la mezcla.
NOTA: El divisor debe colocarse boca abajo. - Poner el sustrato en el divisor boca abajo.
- Colocar la muestra boca abajo en el horno a 65oC durante 2 h.
- Saque muestras del horno y limpie la parte inferior del vidrio con 70% de etanol o isopropanol para eliminar cualquier residuo de PDMS.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para almacenar la muestra, coloque una tapa sobre el sustrato y envuelva el dispositivo en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. La muestra es estable en el estante indefinidamente a temperatura ambiente. El divisor utilizado en este método está en un formato de 96 pozos; sin embargo, los investigadores pueden emplear otros formatos (384-bueno, 2-bueno, 4-pozo, 8-bueno, etc.) dependiendo de las configuraciones de experimento deseadas y la disponibilidad de estructuras divisorias. Es posible que se requiera alguna optimización adicional.
2. Funcionalización de la superficie
- Disolver 80 ml de una alícuota Sulfo-SANPAH en 40 ml de tampón HEPES de 0,1 M (pH 7-9).
NOTA: Preparar alícuotas Sulfo-SANPAH disolviendo 100 mg de polvo de Sulfo-SANPAH en 2 ml de dimetilsulfóxido estéril (DMSO). Preparar un tampón HEPES de 0,1 M diluyendo 50 ml de HEPES en 450 ml de agua desionizada estéril y filtrar a través de un filtro de poros de 0,22 m. - Añadir 200 ml de solución Diluida de Sulfo-SANPAH a cada pocal de la placa de 96 pocillos.
- Exponga la placa a la luz UV (300-460nm) a la distancia y duración adecuadas.
NOTA: Después de la exposición a los rayos UV, el color de la solución debe ser más oscuro. La distancia y la duración de la exposición a los rayos UV dependen de la potencia de la lámpara UV. En nuestra aplicación, exponemos durante 10-15 min a una distancia de 5 cm. - Retire la solución Sulfo-SANPAH de los pozos y agregue 200 ml de solución de fibronectina de 5 g/ml a cada pocil.
NOTA: La proteína especificada por el investigador se puede utilizar para el recubrimiento superficial. Algunas proteínas de uso común son colágeno, fibronectina y laminina. Hemos encontrado Sulfo-SANPAH como el método más eficaz, y la limpieza de plasma mientras que a veces se emplea en PDMS, ya que crea una capa de dióxido de silicio y daña visiblemente la superficie. - Incubar la placa a 4oC durante la noche.
NOTA: Se pueden aplicar diferentes métodos de incubación dependiendo de la proteína utilizada para el recubrimiento. - Retire la solución de fibronectina y lave cada pocal con solución salina con fosfato (PBS) dos veces.
- Coloque una tapa en la muestra.
- Añadir 200 l de PBS a cada pocto.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras recubiertas de fibronectina se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
3. Esterilización UV
- Esterilice la muestra bajo luz UV en un armario de seguridad biológica durante 30 min.
NOTA: Los tiempos de exposición a los rayos UV más largos pueden afectar negativamente a la fluorescencia del cordón. Todos los pasos subsiguientes deben realizarse en condiciones estériles.
4. Cultivo celular
- Retire el PBS de cada pocal y agregue 200 l de células suspendidas en medios de cultivo a cada poca.
- Placa rinde las células a la densidad celular deseada. La densidad celular depende del experimento deseado. Para los estudios de una sola célula, las células deben estar separadas por un mínimo de 50 m y las celdas cerca de los bordes de la ventana de imágenes no deben incluirse en la medición del MFT. Para las celdas monocapa, la ventana de imágenes debe tener el campo de visualización cubierto con una capa confluente de celdas.
- Preparar los medios de cultivo de crecimiento completos para las células NMuMG complementando DMEM con 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 g/mL de insulina, 1% penicilina-estreptomicina, 1 mM de L-glutamina y 0,5 g/ml de anfotericina B.
- Preparar el stock de insulina mediante la reconstitución en agua acidificada (2,5 ml de ácido acético glacial en 130 ml de agua desionizada) a una concentración de 10 mg/ml. Almacene la solución de stock a 4oC. Espere hasta que la solución esté clara y, a continuación, filtre a través de un filtro de poros de 0,22 m.
- Adición de TGF--
- Para preparar el stock de TGF-o, disolver 2 g de TGF-o en 100 ml de ácido cítrico de 10 mM (pH 3.0) y filtrar el esterilizado con poros de 0,22 m. Vortex el tubo y la alícuota en los volúmenes deseados. Conservar las alícuotas a -80oC.
- Añadir 1,5 l de solución de stock de TGF-o a 10 ml del medio de cultivo celular completo para constituir el medio de cultivo celular con la concentración final de TGF-o de 3 ng/ml.
NOTA: Para hacer 10 mM de pH 3.0 ácido cítrico, diluir el ácido en agua y ajustar el pH a 3.0 añadiendo HCl.
5. Adquisición de datos
- Para cada posición, adquiera al menos una imagen de partículas y células fiduciarias. Concéntrese en la capa de perlas.
NOTA: El tamaño del píxel debe optimizarse en función del tamaño de las partículas fiduciarias y del método de procesamiento de imágenes que se esté utilizando. En esta aplicación, los autores utilizan un objetivo de 10x 0.4 NA, y las imágenes se adquieren con resolución 1024 x 1024, con 455 nm/píxel. En general, es útil conservar una resolución de al menos 1-5 píxeles por cordón; aquí, las cuentas son polidispersas y tienen un tamaño individual de 300-500 nm. Es fundamental que las cuentas fiduciarias fluorescentes estén enfocadas para las imágenes que se utilizarán para los cálculos de MFT. El enfoque y la calidad de las imágenes de las cuentas deben priorizarse sobre la toma de imágenes de las propias células. No debe haber conversaciones cruzadas entre diferentes canales, particularmente cualquier fluorescencia no de las cuentas fiduciarias que aparece en los espectros de imágenes de las cuentas. - Una vez grabadas todas las posiciones de interés, añada una solución de desprendimiento a cada pozo para adquirir imágenes de referencia libres de fuerza de las partículas fiduciarias.
- Para preparar la solución de desprendimiento celular, mezcle una solución acuosa que contenga 2% TritonX-100, 50 mM de azida sódica y 500 mM de hidróxido de potasio.
NOTA: Lo anterior se proporciona como un ejemplo de una solución de desprendimiento eficaz. Se pueden utilizar diferentes soluciones de desprendimiento a discreción de los investigadores para separar las células de la superficie del sustrato.
- Para preparar la solución de desprendimiento celular, mezcle una solución acuosa que contenga 2% TritonX-100, 50 mM de azida sódica y 500 mM de hidróxido de potasio.
6. Análisis de imágenes
- Realice el análisis de imagen adecuado como desee.
NOTA: El software de análisis se desarrolló internamente. El análisis de imágenes se puede realizar con software o software personalizado disponible en línea.
7. Síntesis de cuentas
NOTA: El siguiente protocolo se basa en el método de síntesis descrito por Klein et al.10.
- Bajo una capucha de humos, prepare el matraz de tres cuellos con un condensador de reflujo refrigerado por agua.
ADVERTENCIA: Configure una síntesis en una campana de humo sorquímica bien ventilada. - Agregue 0,5 ml del estabilizador PDMS y el fluoróforo al matraz.
- Equipe un cuello con un tabique de goma con una aguja de entrada de nitrógeno y una aguja de salida y equipe el otro cuello con un tabique de goma para agregar reactivo con una jeringa.
- Añadir 100 ml de hexano anhidro en 250 ml al matraz y añadir una pequeña barra de agitación magnética.
- Colocar el matraz en el baño de aceite mineral a 75oC y purgarlo con gas nitrógeno durante 1 h.
- Añadir 6 ml de metilmetacrilato a un matraz inferior redondo de 25 ml.
- Añadir 0,100 g de 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) al matraz inferior redondo y purgar la mezcla con gas nitrógeno durante 1 h.
NOTA: Enjuague el metilametacrilato a través de la columna preenvasada para eliminar los inhibidores antes de su uso. Agregue el metilametacrilato y la mezcla de AIBN al matraz de tres cuellos. - La solución se vuelve inicialmente turbia y se vuelve lechosa. Deje que la reacción se ejecute durante 3 h después de que la solución se vuelva turbia.
- Después de las 3 h, coloque el matraz en un baño de agua helada.
- Filtrar al vacío la solución con papel de filtro grueso.
- Centrifugar el filtrado y volver a suspender las partículas en hexano.
NOTA: El volumen del hexano que se añadirá depende de la concentración deseada de la solución de cordón. La sonicación facilita la re-dispersión de las partículas de cordón en la solución de hexano. Las perlas producidas por los autores tienen diámetros de polidispersodes de aproximadamente 300-500nm. Debido al uso de seguimiento de patrones de correlación cruzada para determinar desplazamientos, no se requieren perlas monodispersas.
8. Protocolo de medición de reología
NOTA: La reología no es necesaria para cada investigador o experimento, pero es necesario cuantificar los módulos para las nuevas formulaciones de PDMS. En este protocolo, empleamos un reómetro de cizallamiento para medir los efectos del retiquete, la frecuencia y la tensión en los módulos de muestras PDMS. Dependiendo de las herramientas y la experiencia disponibles, los módulos también se pueden medir utilizando muchos otros enfoques de análisis mecánico. Además, los investigadores que utilizan este protocolo pueden optar por utilizar nuestros módulos publicados presentados en la Tabla1, Figura 3 y Figura4.
- Utilice un reómetro con una geometría de placa paralela de 25 mm de diámetro. Se pueden utilizar otras geometrías.
- Inicializar el sistema y calibrar el dispositivo y el sistema de medición (placa paralela, d a 25 mm). Después de medir el espacio cero, comience a cargar la muestra de PDMS.
- Tan pronto como el elastómero PDMS y el agente reticulante se han mezclado, pipetee la mezcla en la placa inferior del reómetro.
- Mueva el husillo hacia abajo para ponerse en contacto completamente con la parte superior de la muestra de PDMS.
- Recorte cuidadosamente el exceso de muestra cargado de la placa inferior.
- En una prueba de barrido de deformación unitaria, aplique cepas crecientes para cada composición con diferente densidad de reticulación para garantizar que la estructura del polímero permanezca en el régimen viscoelástico lineal durante todas las mediciones de cizallamiento.
NOTA: Los valores de tensión relevantes para los estudios celulares suelen estar en el rango de 0,1-10%. Hemos encontrado que PDMS es lineal hasta aproximadamente 100% de tensión. - Mida el módulo de almacenamiento de cizallamiento dinámico (G') y el módulo de pérdida (G) de la red PDMS en una prueba de barrido de tiempo con una frecuencia de 1 Hz y una tensión de cizallamiento oscilatol del 0,5% a 100 oC.
- Para determinar la viscoelasticidad y la dependencia de tiempo de la red final PDMS, aplique una prueba de barrido de frecuencia con frecuencia sorteando 0.1-100 Hz y tensión de cizallamiento oscilatoliente de 0.5%.
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Representative Results
Antes de la adición de TGF-o, una monocapa confluente de células tiene una forma adoquinada y está apretadamente embalada. Tras el tratamiento con TGF, las células se vuelven más alargadas en morfología, ampliando el área celular y adquiriendo un fenotipo más mesenquimal. Utilizando el dispositivo multipozo fabricado con elastómeros PDMS suaves, se estudiaron las propiedades físicas de las células en un total de 17 condiciones diferentes. Las células fueron tratadas con cuatro concentraciones diferentes de TGF-o (0,5, 1, 2 y 4 ng/ml) y cuatro tiempos de incubación diferentes (12, 24, 48, 96 h), y estos resultados se resumen en la Figura5. Las células tratadas con TGF-o aplicaron tensiones de tracción y energías de tensión más grandes que las células cultivadas sin TGF-. Las células incubadas con TGF-o durante 96 h mostraron las mayores tensiones de tracción y energías de tensión. Las células aplicaban tensiones más grandes y energías de tensión cuando se trataban con una mayor concentración de TGF-o. La diferencia en las tracciones y las energías de tensión era más distinta en tiempos de incubación más largos.
La superficie del sustrato debe estar lisa y uniformemente recubierta de ligandos, como la fibronectina o el colágeno. La superficie rayada y/o el recubrimiento no uniforme de los ligandos pueden dar lugar a un accesorio de celda inadecuado, lo que resulta en una medición de tracción inexacta. La Figura 6 muestra las tensiones de tracción localizadas debido a la superficie del sustrato no uniforme.
Figura 1 : Visión general de la fabricación de placas multipozo. (A) Una corredera de vidrio de corte personalizado es el punto de partida. (B) El portaobjetos de vidrio está recubierto con una capa gruesa (capa de 100 m de PDMS). (C) Una capa de cuentas fiduciarias (mostradas en verde) se espían en una capa de grosor de 1 m en la parte superior de la capa anterior. (D) El divisor multipozo se coloca cuidadosamente en la parte superior de la capa de perlas fiduciarias. (E) La placa multipozo completa está montada y lista para su uso o almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Mandril personalizado para reventado de giros. Para evitar que el vidrio inferior (donde PDMS está recubierto) vuele fuera del mandril de recubrimiento de giro estándar, se coloca un soporte hecho a medida en el mandril. (A) Un soporte hecho a medida para el mandril de recubrimiento de giro. (B) Dibujo de ingeniería del soporte con todas las dimensiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Rigidez del sustrato con concentración de retitulador cambiante (wt%). Las mezclas de PDMS se preparan como se describe, con el porcentaje de retitulador adicional que aumenta el módulo elástico hasta un máximo de 100 kPa al 1,8 por ciento de peso (wt%) retitulador. Como guía, el módulo como una función de retitulador se ajusta linealmente, que puede ser utilizado por los investigadores para formular su propia mezcla en un módulo deseado particular dentro de este rango. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Reología del elastómero PDMS que contiene 0, 0,15, 0,36 y 1 wt% de agentes de enlace cruzado a una temperatura de 100 oC. Los símbolos de triángulo indican el módulo de pérdida (G'') y los símbolos cuadrados indican el módulo de almacenamiento (G'). (A) Barrido de tiempo oscilatol a frecuencia de 1 Hz y tensión de cizallamiento del 0,5% durante la gelificación. (B) Barrido de frecuencia oscilatol de la red PDMS en una tensión cortante del 0,5%. (C) Barrido de tensión de la red PDMS a una frecuencia de 1 Hz. Todos los puntos de datos fueron adquiridos por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Resultados representativos que utilizan un dispositivo de tensión de tracción con formato multipozo. Monocapa de células en diferentes condiciones se cultivaron en un dispositivo de varios pozos para medir la contractilidad y la energía de deformación unitaria. (A) Gráfico de tensiones de tracción con el aumento del tiempo de incubación de TGF para diferentes concentraciones de TGF-o. Las tensiones de tracción aumentaron con el aumento de las concentraciones de TGF y el tiempo de incubación. Todos los datos son estadísticamente significativos con respecto al control (es decir, sin TGF-o) excepto los siguientes: 12 h - 0,5 ng, 12 h - 1 ng, 48 h - 1 ng. (B) Gráfico de la energía de la deformación unitaria con el aumento del tiempo de incubación de TGF para diferentes concentraciones de TGF-. Las energías de tensión aumentaron con el aumento de las concentraciones de TGF y el tiempo de incubación. Los tamaños de las muestras oscilan entre no 7 y n a 15. Todos los datos son estadísticamente significativos con respecto al control (es decir, no hay TGF- ) excepto los siguientes: 12 h - 0,5 ng, 12 h - 1 ng, 24 h - 0,5 ng, 24 h - 1 ng, 48 h - 1 ng. La significancia estadística se determinó utilizando la prueba Kruskal Wallis, que no supone una distribución normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Resultados representativos de un experimento subóptimo (A, B) y un experimento satisfactorio (C, D). (A) Imagen de reflexión de la superficie del sustrato. Contaminantes no deseados, que pueden incluir polvo o fibras, o defectos materiales como arañazos están presentes en la superficie del sustrato. (B) Mapa de tensión de la contractilidad celular: debido a la superficie no uniforme, se observan tensiones de tracción irregulares e inexactas alrededor de los objetos. (C) Imagen de reflexión de la superficie del sustrato. No hay contaminantes aparentes visibles. (D) Mapa de tensión de la contractilidad celular: no hay discontinuidades de artefactos visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Concentración de retitulador (wt%) | G' (Pa) | Desviación estándar | E (kPa) | Desviación estándar |
| 0 | 0.135 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1 | 0.1 | 3 | 0.35 |
| 0.36 | 4.027 | 0.245 | 12.081 | 0.73 |
| 0.75 | 16.01 | 0.49 | 48.03 | 1.2 |
| 1 | 18.44 | 0.989 | 55.32 | 1.94 |
| 1.5 | 27.638 | 0.93 | 82.91 | 1.64 |
| 1.8 | 33.986 | 0.88 | 101.94 | 1.088 |
| 2 | 33.36 | 0.67 | 100.08 | 1.1 |
Tabla 1: Rigidez del sustrato con concentración de retitulador cambiante (wt%). Al cambiar las concentraciones adicionales de reticulantes, se fabrican sustratos PDMS de los módulos de Young deseados. Los módulos de cizallamiento PDMS se midieron con un reómetro y se determinaron los módulos de Young. Para cada punto de datos, se realizaron 3 preparaciones independientes y se dio la desviación estándar.
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Discussion
Para el éxito de este método, es fundamental tener una muestra recubierta uniformemente con un espesor constante de aproximadamente 100 m. El módulo debe ser cuidadosamente elegido para examinar la importancia física del sistema biológico de interés. Al fabricar una capa superior, la concentración de las partículas fluorescentes fiduciales debe optimizarse para un análisis preciso del desplazamiento y la tensión de tracción. El análisis de células individuales aisladas requiere una capa fiduciaria más densa que la medición de monocapas confluentes. Además, la superficie del sustrato debe tener un recubrimiento estable y uniforme de moléculas de adhesión como colágeno, fibronectina y laminina para garantizar la fijación adecuada de las células a la superficie del sustrato. Se debe tener especial cuidado al fijar el divisor multipozo; debe colocarse sin deslizamiento para evitar que el sellado de pegamento PDMS se frota en la superficie de cultivo, y el borde exterior debe estar cuidadosamente alineado con las dimensiones de vidrio para evitar fugas en los pozos de borde.
Para evitar que los pozos sean con fugas, es necesario aplicar una cantidad adecuada de pegamento PDMS al bien divididor para mantenerlo en su lugar. Sin embargo, el uso de cantidades excesivas cubrirá la superficie de cultivo celular.
Es necesario añadir un volumen suficiente de PDMS durante el procedimiento de recubrimiento de espín. Al curar, el horno y los estantes deben estar nivelados. Los PDMS inadecuados o un horno sin nivelpueden pueden llevar a un espesor de PDMS desigual.
La densidad de los perlas debe optimizarse para un análisis adecuado. Cuando la densidad de perlas no es adecuada, es necesario aumentar la concentración de las perlas en la mezcla fiduciaria de PDMS. Además, es necesario añadir una cantidad adecuada de la mezcla para el recubrimiento de espín. Para garantizar las señales fluorescentes adecuadas de las partículas de perlas fiduciarias, se debe controlar cuidadosamente la condición de curado. Tiempos más largos y temperaturas más altas que las especificadas en este protocolo pueden degradar la fluorescencia. Recubrimiento proteico inadecuado en la superficie de la muestra puede conducir a una mala adhesión celular. Para evitar esto, la superficie necesita ser limpiada y la expiración de reactivos tales como Sulfo-SANPAH y ligandos necesita ser revisado. Se debe optimizar el tiempo y la resistencia de la exposición a los rayos UV. La inmunofluorescencia u otra construcción de proteínas fluorescentes se pueden probar para garantizar un recubrimiento uniforme de ligando.
El dispositivo fabricado con este método y conjunto de formulaciones PDMS solo es aplicable a sustratos con módulos de Young que van desde 0,4 kPa hasta 100 kPa. Otros módulos pueden ser posibles utilizando formulaciones alternativas, sin embargo, el rango actual abarca un gran conjunto de valores fisiológicamente relevantes. Si bien este método es específicamente para la fabricación de varios pozos, también se puede utilizar para preparar diapositivas individuales u otras geometrías de diapositivas, y en estos casos puede ser necesario solucionar problemas de usuario adicionales. En esta realización, se emplea un portaobjetos de vidrio relativamente grueso (1 mm), que excluye los objetivos comunes de apertura numérica alta (NA) en un microscopio invertido. Si bien es técnicamente factible construir estos platos de TFM multi-pozo utilizando vidrio más delgado, la fragilidad de estos en el procesamiento y el montaje puede resultar en una alta tasa de rotura, y puede correr en contra del enfoque de mayor rendimiento. Además, el recubrimiento superficial puede investigarse más a fondo para aplicaciones más amplias del dispositivo.
Utilizando un formato de varios pozos, experimentos de alto rendimiento son posibles. El formato multipozo nos permitió examinar los cambios físicos de las células NMuMG durante la EMT con tratamiento TGF-o con combinaciones de diferentes concentraciones y diferentes tiempos de incubación en un solo plato. La fabricación de dispositivos de tensión de tracción con hidrogeles como el gel de poliacrilamida tiene varias limitaciones. Con el ingrediente dominante el agua, los hidrogeles son sensibles a las concentraciones de sal (osmolaridad), temperatura, humedad y cambios de pH. Los cambios en cualquiera de estas propiedades pueden conducir al cambio en las propiedades mecánicas del material, lo que requiere un cuidado adicional en el uso de muestras y la interpretación de resultados. Además, tener agua, los hidrogeles son más susceptibles a las infecciones, lo que requiere un cuidado adicional. A diferencia de los hidrogeles a base de agua, PDMS a base de silicona es estable e inerte. Una vez fabricado, se puede almacenar a temperatura ambiente indefinidamente sin necesidad de condiciones especiales de manipulación o almacenamiento.
La naturaleza impermeable de PDMS nos permite fabricar un sustrato monolítico, asegurando que todos los pozos sean verdaderamente idénticos en espesor y composición del sustrato, permitiendo al mismo tiempo que se aplique una bioquímica única en los medios, o diferentes células que se utilizarán en cada uno de ellos Bien. Una superficie a base de hidrogel permite que factores difusivos permeen y viajen a través de ella, lo que requiere la adición del hidrogel a los pozos que de otro modo se dividen para evitar la contaminación cruzada.
Este método permite a los investigadores estudiar la contractilidad celular, un aspecto básico y ubicuo de la biología celular, de una manera de alto rendimiento, lo que permite una adquisición de datos más eficiente y reproducible. Esto ayuda a traducir la microscopía de fuerza de tracción en el cribado de fuerza contráctile, lo que permite a los investigadores utilizar realmente la contractilidad como una métrica para la actividad celular, o la eficacia de un compuesto. Como metodología, esto tiene amplias aplicaciones en ciencias biofísicas y biomédicas, desde la comprensión de la física de las células, hasta la caracterización y prueba de compuestos farmacéuticos contra tipos de células estandarizadas, o tal vez altamente especializadas células individuales para la medicina personalizada.
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Disclosures
AJE y RK tienen interés en Live Cell Technologies, una empresa que fabrica los materiales descritos en este artículo.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Tom Kodger, Michael Landry y Christopher J. Barrett por su ayuda con la síntesis de cuentas. A.J.E. reconoce que el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería otorga rgPIN/05843-2014 y EQPEQ/472339-2015, la subvención 143327 de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria, la subvención no 703930 de la Sociedad Canadiense contra el Cáncer y la Fundación Canadiense para la Innovación #32749 del proyecto. R. Krishnan reconoce que los Institutos Nacionales de Salud otorgan no. R21HL123522 y R01HL136209. H.Y. fue apoyado por Fonds de recherche Santé Québec, y Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Los autores agradecen a Johanan Idicula por su ayuda con el video y el manuscrito y a Zixin He por su ayuda en la preparación del vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
