Summary
Dette manuskriptet beskriver en FACS-basert protokoll for isolering av papillær og retikulære fibroblaster fra menneskelig hud. Det omgår in vitro kulturen som var uunngåelig med den brukte isolasjons protokollen via explant kulturer. De som kommer Fibroblast delsett er funksjonelt distinkte og viser differensial genuttrykk og lokalisering i dermis.
Abstract
Fibroblaster er en svært heterogen celle befolkning innblandet i patogenesen av mange menneskelige sykdommer. I humant hud dermis, fibroblaster har tradisjonelt vært tilskrevet overfladisk papillær eller lavere retikulære dermis i henhold til deres histologiske lokalisering. I mus dermis, papillær og retikulære fibroblaster stammer fra to forskjellige linjene med avvikende funksjoner vedrørende fysiologiske og patologiske prosesser og en distinkt celle overflate markør uttrykk profil der de kan skilles.
Viktigere, bevis fra explant kulturer fra overfladiske og lavere dermal lag tyder på at minst to funksjonelt distinkt dermal fibroblaster linjene finnes i menneskets hud dermis også. Men i motsetning til musen huden, celleoverflaten markører slik at diskriminering av ulike Fibroblast delsett ennå ikke er etablert for menneskelig hud. Vi utviklet en ny protokoll for isolering av menneskelig papillær og retikulære Fibroblast populasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ved hjelp av to celleoverflaten markører Fibroblast aktivisering protein (FAP) og Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Denne metoden gjør det mulig å isolering av ren Fibroblast delsett uten in vitro manipulasjon, som ble vist å påvirke genuttrykk, og dermed tillater nøyaktig funksjonell analyse av menneskelig dermal Fibroblast delsett i forhold til vev homeostase eller sykdom Patologi.
Introduction
Som den viktigste cellulære komponenten av bindevev, fibroblaster er primært ansvarlig for deponering av kollagen og elastiske fibre som til slutt danner ekstracellulære matrise1, og dermed sin rolle i vev homeostase, regenerering og sykdommen har vært undervurdert i lang tid. Men fibroblaster har nylig kommet under søkelyset av forskere, ikke bare fordi de representerer en fremtredende mobil kilde for indusert Pluripotent stamceller2 , men også på grunn av deres høye plastisitet og konsekvensen i patogenesen av et bredt antall sykdommer som organ fibrose3,4,5 eller Cancer6,7.
Human hud er sammensatt av en flerlags epitel, epidermis, og dens underliggende bindevev, dermis, som kan histologisk inndelt i øvre papillær og nedre retikulære dermis og er i hovedsak sammensatt av fibroblaster og ekstracellulære matrise8 og hypodermis. Ifølge deres plassering i vevet, dermal fibroblaster har grovt blitt klassifisert i papillær og retikulære fibroblaster1.
Viktigere, nyere data tyder på at disse dermal Fibroblast subpopulasjoner er ikke bare histologisk gjenkjennelig, men også at deres funksjon er betydelig mangfoldig. I mus hud, papillær og retikulære fibroblaster oppstår fra to distinkte linjene under embryogenesis9. Flere linjer av bevis tyder på at de to linjene utøve ulike roller ikke bare i vev homeostase, hårsekken morphogenesis, såret reparasjon og fibrose7,9,10, men de også svare på ulike signaler fra neoplastic epidermal stamceller11, antyder avvikende roller i kreft patogenesen. Beleilig, både linjene uttrykke et distinkt sett av gjensidig utelukkende cellulære markører i voksen mus hud, og dermed muliggjøre isolering av ren dermal Fibroblast bestander og påfølgende omfattende analyse av deres spesifikke funksjoner i vitro9 , 11i.
Tilsvarende, minst to distinkte Fibroblast delsett med distinkte morfologi og funksjoner, inkludert avvikende spredning priser, vev remodeling kapasiteter12,13, samt evne til å støtte veksten av epidermal stamceller in vitro, har blitt beskrevet for Human Skin dermis14,15. Men de fleste av de publiserte studier på menneskelig dermal fibroblaster har blitt gjennomført ved hjelp av blandede Fibroblast populasjoner isolert fra explant kulturer fra dermatomed hud, siden bestemte celleoverflaten markør sett muliggjør isolering av ren menneskelig papillær eller retikulære Fibroblast subpopulasjoner i analogi til mus dermis var ennå ikke etablert.
Vi har nylig demonstrert, at menneskets hud papillær og retikulære fibroblaster er preget av spesifikke celleoverflaten markører som muliggjør isolering av de respektive subpopulasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)16: FAP + CD90- fibroblaster representerer papillær fibroblaster primært plassert i øvre dermis, presenterer høyere spredning priser, en distinkt gen signatur, men ingen adipogenic potensial. FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster tilhører den retikulære Lineage av lavere dermal rom, som er mindre proliferativ men lett gjennomgår adipogenesis-et kjennetegn for retikulære fibroblaster. Denne metoden gjør det mulig å omfattende studere disse distinkte Fibroblast subpopulasjoner ikke bare i forhold til deres spesifikke funksjoner under fysiologiske forhold, men også i sammenheng med patogenesen av hudsykdommer, inkludert hudkreft.
Men siden fibroblaster endre deres celle overflate markør uttrykk i to-dimensjonale in vitro kultur16,17,19, anvendelse av vår protokoll er begrenset til isolering av primær fibroblaster fra Human dermis og tillater ikke identifisering av papillær eller retikulære fibroblaster i blandet cellekultur populasjoner. Viktigere, selv om uttrykket av celleoverflaten markører endringer in vitro, har vi vist at Fibroblast delsett isolert i henhold til protokollen beskrevet nedenfor beholde sin spesifikke funksjonalitet når dyrket16, og dermed muliggjør in vitro studier av delsett-spesifikke egenskaper under fysiologiske eller patologiske tilstander.
Avslutningsvis har vi utviklet en protokoll for isolering av distinkte Fibroblast delsett via FACS som for første gang tillater isolering av rene Fibroblast populasjoner fra menneskelig hud dermis i en naiv tilstand.
Protocol
Menneskelig hud ble innhentet fra kaukasiske menn og kvinner i alderen 26 til 61 år (sol-beskyttet hud; abdominal korreksjoner, bryst reduksjoner). Skriftlig informert pasientens samtykke ble innhentet før vev samling i samsvar med Declaration of Helsinki, og med godkjennelse fra Wien Medical University institusjonelle Review Board.
Merk: Vi gir en protokoll for isolering av funksjonelt distinkte Fibroblast subpopulasjoner enten fra full tykkelse dermis (se avsnitt 1) eller etter snitting menneskelig hud dermis i sine forskjellige lag (hopp over avsnitt 1 og direkte se avsnitt 2) .
1. utarbeidelse av full tykkelse dermis
- Plasser en 10 cm x 10 cm menneskelig hud stykke (f. eks, fra abdominal korreksjoner eller bryst reduksjoner) med epidermis vendt nedover på tykt filter papir.
- Hold epidermis tett på kantene med tang og skrape av subkutant fett lag med en skalpell. Deretter Slice vevet i 5 mm brede strimler før du setter dem inn i en Petri parabolen.
Merk: Dette forenkler inntrengning av Dispase II (referert til som dissociating enzym heretter, se pkt. 3) og brukes hvis epidermis må skilles fra hele dermis. For denne hopp over avsnitt 2 og direkte referer til avsnitt 3. For å unngå forurensning, holde vevet sterilt etter kirurgisk fjerning eller Rengjør den grundig med etanol eller jod løsning. Hvis i det hele tatt etanol behandling av hudoverflaten forårsaker bare mindre celle død. Arbeid under sterile forhold i en vev kultur Flow hette.
2. snitting av Human Skin dermis i Papillær og Retikulære lag med en dermatome
- Plasser en 10 cm x 10 cm hud del (f.eks. fra abdominal korreksjoner eller bryst reduksjoner) på tykt filter papir, med epidermis vendt oppover. Hold huden tett på kantene med tang.
- Skjær huden med en elektrisk dermatome, justert til en skjæretykkelse/dybde på 300 μm, ved å skyve hodet av dermatome bort fra seg selv, med bladet være på en 90 ° vinkel i forhold til overflaten av huden.
- Ta det første laget bestående av epidermis og papillær dermis (300 μm tykk, "dermal lag 1", figur 1 og figur 2) og legg den i en Petri parabolen. Fortsett umiddelbart til del 3 eller Legg til 1x PBS for å hindre at vevet tørker ut.
Merk: For å unngå forurensning, holde vevet sterilt etter kirurgisk fjerning eller rengjør det grundig med etanol eller jod løsning. Arbeid under sterile forhold i en vev kultur Flow hette.
Forsiktig: Håndter dermatome forsiktig siden knivene er veldig skarpe. - Gjenta trinn 2,2 for å justere dermatome til en skjæretykkelse på 700 μm og skjær de resterende dermis. Plasser den øvre skive som er definert som den øvre retikulære dermis ("dermal lag 2", figur 2) inn i en egen Petri parabolen. Fortsett umiddelbart til seksjon 4 eller Legg til 1x PBS for å hindre at vevet tørker ut.
- Skrap opp underhudsfett laget med en skalpell fra det gjenværende lavere retikulære dermal laget (> 1000 μm) og kast det. Samle den nedre retikulære dermis ("dermal lag 3", figur 2) i en annen Petri parabolen. Fortsett umiddelbart til seksjon 4 eller Legg til 1x PBS for å hindre at vevet tørker ut.
Merk: Alternativt, i stedet for skraping fettet av med en skalpell, fjerne fettlaget med saks. Det kan bidra til å sette retikulære dermis på isen før skraping fettet unna.
3. separasjon av epidermis og dermis
-
Forbered en 3 U/mL dissociating enzym (dvs., Dispase II) løsning i steril 1x PBS. Legg 5 mm hud striper (fra del 1), eller epidermis/papillær dermis (fra trinn 2,2), med epidermis vendt oppover i en 10 cm Petri parabolen med 10 mL 3 U/mL dissociating enzym løsning. Ruge Petri parabolen ved 37 ° c for 1 time.
- Protokollen kan være stanset midlertidig her. Ruge epidermis/papillær dermis i protease i kjøleskapet ved 4 ° c over natten i stedet. Etter behov oppbevares de andre lagene (dermal lag 1, 2 og 3) over natten nedsenket i 1x PBS i 50 mL rør ved 4 ° c.
Forsiktig: Arbeid forsiktig med protease, kan det irritere hud og øyne ved kontakt.
- Protokollen kan være stanset midlertidig her. Ruge epidermis/papillær dermis i protease i kjøleskapet ved 4 ° c over natten i stedet. Etter behov oppbevares de andre lagene (dermal lag 1, 2 og 3) over natten nedsenket i 1x PBS i 50 mL rør ved 4 ° c.
- Etter inkubasjons, overføre epidermis/papillær dermis til det tørre lokket på Petri parabolen og skille epidermis fra øvre dermis (dermal lag 1) med to pinsett hver holder kanten av enten epidermis eller dermis.
4. enzymatisk fordøyelse av dermal vev
- Hakke hvert dermal lag (dermal lag 1, 2 og 3) separat med saks/skalpell så grundig som mulig; Jo mindre bitene, jo bedre vev fordøyelsen.
Merk: Seighet av dermis kan variere avhengig av kroppsdelen den stammer fra (f. eks, abdominal eller overarm hud). - Forbered fordøyelsen Mix ved å kombinere 1,25 mg/mL kollagenase I, 0,5 mg/mL kollagenase II, 0,5 mg/mL kollagenase IV og 0,1 mg/mL Hyaluronidase i Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) med L-glutamin (se tabell over materialer), 10% fosterets kalv serum ( FCS) og 1% penicillin/Streptomycin (P/S).
Forsiktig: Arbeid forsiktig med collagenases da disse kan irritere hud og øyne ved kontakt. - Sett hver av hakket vev med 10 mL av forberedt fordøyelsen blandes inn i en 50 mL rør og ruge i et 37 ° c varmt vannbad for 1 t under permanent omrøring. Under fordøyelsen invertere rørene flere ganger.
Merk: Man bør vurdere å justere fordøyelsen volumet i henhold til størrelsen på hakket huden stykke. Ikke overbelaste 10 mL fordøyelsen blandes med for mye vev ellers cellen yield vil være minimal. Mindre enn en tredjedel av vevet innenfor det totale volumet anbefales (1:2 w/v).
5. utarbeidelse av single Cell suspensjon og erytrocytt lyse
- Stopp enzymatisk vev fordøyelse ved å legge 10 mL Fibroblast medium (DMEM med L-glutamin, 10% FCS og 1% P/S) til fordøyd vev. Arbeid med is herfra.
- Hell innholdet i hvert rør gjennom en vanlig steril rustfritt te sil og samle celle fjæring i en ren Petri parabolen. Vask sil med medium og bland ufordøyd vev stykker med kanten av en sprøyte-stempel.
- Etterpå samles pipette celle suspensjon gjennom en 70 μm celle sil inn i en 50 mL tube. Skyll celle sil med medium og samle flyte gjennom i samme rør.
- Sentrifugerør ved 500 x g ved 4 ° c i 10 min. Fjern og kast supernatanten og vask celle pellet med 5 ml Fibroblast medium. Gjenta det sentrifugering trinnet.
- Fjern og kast supernatanten og resuspend pellet i 1 mL selv laget ACK erytrocytt lyseringsbuffer (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). La det være celler i lyseringsbuffer i ca. 1 min. ved omgivelsestemperatur (20 \ u201222 ° c).
- Stopp lyse ved å legge til 9 mL 1x PBS med 10% FCS og sentrifuger rørene igjen ved 500 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten.
Forsiktig: Den inkubasjonstiden i erytrocytt lyse kan justeres hvis lyse virker ufullstendig (rød pellet). Men ikke la cellene i erytrocytt lyseringsbuffer for lenge for å unngå lyse av fibroblaster og immunceller.
6. blokkering og farging fibroblaster for FACS
- Forbered 5 μL av Human FC-reseptor blokkerings løsning i 100 μL av 1x PBS med 10% FCS og resuspend celler i 100 μL av menneskelige FC blocker. Ruge på isen i 10 min.
- Design en FACS fargepanel for å farge menneskelig dermal fibroblaster. Bland anti-menneskelige FAP APC (1:20), anti-menneskelige CD90 AF700 (1:30), anti-menneskelige E-cadherin PE (1:20), anti-menneskelige CD31 FITC (1:30), anti-menneskelige CD45 Stillehavet blå (1:20), anti-menneskelige ITGA6 PE (1:20), anti-menneskelige CD235ab Stillehavet blå (1:1000) og anti-menneskelige CD106 Pacific blå (1:100) i 1x PBS med 10% FCS.
-
Etter at FC reseptor blokkering, spinner celler ned ved 500 x g ved 4 ° c i 3 min. Fjern og Forkast supernatanten og resuspend cellene i 100 μL av antistoff mix. Ruge celler i mørket ved 4 ° c i 20 min.
- Før farging, Fjern 20 μL av en prøve med et høyt celle tall for unstained og enkelt flekk FACS kontroller.
- Vask de fargede cellene og FACS-kontrollene to ganger med 500 μL 1x PBS med 10% FCS og sentrifuge ved 500 x g ved 4 ° c i 3 min. I mellomtiden legger 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til 1x PBS med 10% FCS å foreta en endelig konsentrasjon av 1 μg/mL.
- Fjern og Forkast supernatanten, resuspend celler i 200 μL DAPI-løsning og Filtrer hver celle suspensjon gjennom en 70 μm celle sil til et 5 mL FACS-rør.
Merk: Hvis FACS skal utføres med forsinkelse, Legg DAPI og filter kort tid før innspillingen.
7. gating strategi for humant dermal Fibroblast delsett isolasjon og FACS
- Ta opp flyt flowcytometri kontroller, angi riktige spennings innstillinger og utfør riktig kompensasjon. Gate for enkeltceller og Live (DAPI-), Pacific Blue, PE og FITC negative celler (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- og E-cadherin-) for å få tre Fibroblast populasjoner: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ celler. Se Figur 3.
- Sorter tre Fibroblast subpopulasjoner i separate 1,5 mL skrulokk mikrosentrifugen rør fylt enten med 350 μL lyseringsbuffer for RNA-isolasjon eller fylt med 350 μL Fibroblast vekstmedium (se tabell over materialer) for cellekultur. Inverter rør umiddelbart etter slag og enten putte lyseringsbuffer rør i flytende nitrogen for snap frysing eller sette medium rør på isen.
Forsiktig: Klargjør lyseringsbuffer med 0,1% b-Mercaptoethanol i avtrekksvifte og unngå innånding.
8. dyrking av fibroblaster og Adipogenesis analysen
- Etter FACS, spinne celler ned ved 500 x g for 3 min ved 4 ° c og plate lik celle tall (5000 \ u201210, 000 celler/brønn) i Fibroblast vekstmedium (se tabell over materialer) i 48-vel cellekultur retter. La cellene vokse til de når 70% confluency.
- Tilsett 5 μg/mL insulin, 5 μM troglitazone, 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxanthin (IBMX) og 1 μM dexametasone for å Fibroblast vekstmedium for å forberede adipocyte differensiering medium.
- Erstatt medium for de dyrkede cellene med adipocyte differensiering medium og la cellene skille i 14 dager. Bytte medium etter dag 2 med redusert adipogenesis medium som inneholder 5 μg/mL insulin og 5 μM troglitazone. Etterfylle medium hver 3Rd eller 4th dag.
- Fix celler med 4% PFA i 20 min ved omgivelsestemperatur (20 \ u201222 ° c) ved differensiering dag 14. Vask brønner med 60% isopropanol og la det fordampe helt. Stain celler med 5 mM olje rød O (filter før bruk) i 20 min. vask beiset celler fire ganger med destillert vann. Fortsett å utføre mikroskopi.
Forsiktig: PFA er giftig og skadelig. Håndter forsiktig.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Faste celler kan lagres i 1x PBS ved 4 ° c inntil olje rød O farging utføres. Dekk rett med para fin film før oppbevaring for å unngå fordamping. - Bilde celler nedsenket i vann med en invertert mikroskop ved 10x forstørrelse med overført lys.
Representative Results
En oversikt over de viktigste trinnene for å behandle hud vev for å få en enkelt celle suspensjon er vist i figur 1, viser dermatoming i huden (figur 1a), ulike dermal lag (figur 1B), fjerning av subkutan fett lag (figur 1C) og separasjon av epidermis og papillær dermis (figur 1d), så vel som de ulike trinnene i manuelle og enzymatisk vev dissosiasjon (figur 1e, F). En ordning av de tre dermal lagene er gitt i figur 2.
Figur 3 viser gating strategien for en flyt flowcytometri fargepanel for analyse av ulike Fibroblast delsett fra menneskelig hud. Ytterligere celle overflate markører som ikke er uttrykt på fibroblaster tillate utelukkelse av ulike andre celler til stede i huden som immunceller, epidermal celler, Mesenchymal stamceller (MSCs), røde blodlegemer eller endothelial celler for å oppnå maksimal renhet i de isolerte populasjoner. Det er ikke kritisk å bruke identiske FACS panelet brukes i figur 2 for identifisering av disse Fibroblast subpopulasjoner, men dette er vår anbefaling. Man kan bruke antistoffer merket med ulike fluorescerende fargestoffer eller endre kombinasjonen av utelukkelse markører.
Av notatet, denne protokollen muliggjør identifisering av tre Fibroblast populasjoner i menneskelig hud som er tilstede med ulike intradermal lokalisering, genuttrykk profiler og funksjoner (Figur 4). FAP+CD90- er beriket i papillær dermis mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ er mer rikelig i retikulære dermis (figur 4a). Alle tre subpopulasjoner viser den typiske Fibroblast morfologi ved sortering i cellekultur (figur 4b). Interessant, de skiller seg om deres evne til å differensiere til adipocytter som er et kjennetegn for retikulære fibroblaster. Ved å kombinere disse resultatene med genuttrykk profilering via sanntids polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR)16 (figur 4c), viser at FAP+CD90- celler uttrykker høye nivåer av markører som vanligvis tilskrives papillær fibroblaster som CD26, NTN og PDPN mens CD90+ celler uttrykker kjente retikulære MARKØRER som CD36, ACTA2 og PPARγ på høye nivåer, konkluderer vi at FAP+CD90- celler tilhører papillær og CD90+ celler tilhører den retikulære avstamning.
Figur 1: isolering av dermal enkelt celle fjæring fra intakt menneskelig hud. (A) huden er skiver med en elektrisk dermatome i papillær og retikulære dermis. (B) papillær dermis med tilstøtende epidermis er 300 μm tykk (øverst) mens øvre retikulære dermis er 700 μm tykk (nederst). (C) subkutan fett lag er skrapet-off av lavere retikulære dermis med en skalpell. (D) etter inkubasjons av papillær dermis i dissosiasjon enzym løsning ved 37 ° c i 1 time, kan epidermis lett fjernes med tang. (E) forskjellige dermal lag er hakket med saks og overføres til et enzym fordøyelsen blanding bestående av kollagenase i, II og IV og Hyaluronidase. (F) etter 1 h av dissosiasjon ved 37 ° c, er vev fordøyelsen stoppet og suspensjonen helles gjennom en te sil for å fjerne ufordøyd hud stykker. (G) celle suspensjon filtreres en gang til gjennom et 70 μm celle sil og sentrifugert ved 500 x G ved 4 ° c i 10 min. (H) etter sentrifugering, er cellen pellet vasket med 1x PBS med 10% FCS og er klar for FACS farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjæring av humant hud dermis i papillær og retikulære lag med en dermatome. Ordningen viser de tre dermal lagene oppnås ved kutting full tykkelse huden i papillær dermis (inkludert epidermis; 0 \ u2012300 μm; dermal lag 1), øvre retikulære (300 \ u20121, 000 μm; dermal lag 2) og lavere retikulære dermis (> 1000 μm; dermal lag 3) med en dermatome. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: FACS gating strategi for menneskelig dermal Fibroblast subpopulasjoner. (A\u2012E) For det første er celler gated på enkelt (B) og LEVEDYKTIG (DAPI-) celler (C). Immunceller (CD45+), Mesenchymal stamceller (CD106+), røde blodlegemer (CD235ab+) er ekskludert (C) og Pacific blå negative celler er gated videre på E-cadherin (ECAD) og ITGA6 doble negative celler (PE kanal, D ). E-cadherin og ITGA6 er markører uttrykt på epidermal celler. Neste, CD31-FITC positive celler (endothelial og lymfatisk celler) er utelukket (D) resulterer i tre Fibroblast populasjoner uttrykker enten en eller begge av de to celleoverflaten FIBROBLAST markører FAP og CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ (E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: FAP+CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster varierer i dermal lokalisering, genuttrykk og funksjonalitet. (A) representant FACS tomter gated fibroblaster isolert fra papillær, øvre retikulære og lavere retikulære dermis. Gating strategi er forklart i Figur 3. FAP+CD90- fibroblaster er beriket i papillær dermis (19,2%) sammenlignet med lavere retikulære dermis (0,83%). FAP+CD90+ celler kan finnes i hele dermis men deres høyeste overflod er i øvre retikulære dermis (40,7%). FAP-CD90+ er beriket i nedre retikulære dermis (64,4%). (B) av notatet, alle tre sorterte subpopulasjoner viser typisk Fibroblast morfologi på kultur i 7 dager (venstre). Interessant, oppfører de seg annerledes i en adipogenesis analysen. Etter 14 dager i kultur, FAP+CD90- ikke DIFFERENSIERE til adipocytter mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ lett gjennomgår adipogenesis (høyre; Olje rød O flekker lipid-bærende celler rød). Skala barer = 1 000 μm. (C) direkte sortert FAP+CD90- fibroblaster UTTRYKKE papillær FIBROBLAST markører CD26, NTN1 og PDPN, mens FAP-CD90+ celler Express CD36, ACTA2 og PPARγ, kjent for å være uttrykt ved retikulære avstamning. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 sammenlignet med FAP+/CD90- celler; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 SAMMENLIGNET med FAP-/CD90+ celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en metode for isolering av papillær og retikulære fibroblaster fra menneskelig hud. CD90 har blitt mye brukt for identifisering eller isolering av dermal fibroblaster18,20,21. Men vi har vist at i tillegg CD90 + fibroblaster, menneskelige dermis også havner en CD90- Fibroblast BEFOLKNING uttrykker FAP16, som har blitt etablert som en markør for aktivert fibroblaster og kreft-assosiert fibroblaster ( CAFs)22,23,24,25. Viktigere var vi i stand til å identifisere tre Fibroblast subpopulasjoner FAP+CD90-,FAP +CD90+ og FAP-CD90+ i huden biopsier fra alle friske menneskelige donorer. Vi konkluderer derfor med at FAP er ikke bare en markør for aktivert fibroblaster eller CAFs men også normalt vev fibroblaster.
Av notatet, den FAP-CD90- celle befolkning gjenværende etter påføring av den ovenfor beskrevne eksklusjon-og gating strategi ikke inneholder fibroblaster, siden disse cellene ikke sprer i Fibroblast dyrking medium in vitro, men de fleste sannsynlig en blandet celle befolkning inkludert lymfatisk celler og pericytes blant annet16.
Cellen yield oppnås ved bruk av ovennevnte protokollen kan variere avhengig av kroppsdelen at huden stykke brukt for isolasjonen stammer fra. Dermis fra ulike kroppsdeler varierer med hensyn til struktur, tykkelse samt kollagen sammensetning. For eksempel er huden fra ansiktet eller overarmen mye tynnere enn huden fra magen eller låret, som også ofte viser et tykkere underhudsfett lag. I tillegg, alder og kjønn på hud donorer kan videre ikke bare påvirke vevet dissosiasjon effektivitet, men kan også påvirke fordelingen av de tre Fibroblast subpopulasjoner (Figur 3) når isolert fra full tykkelse hud. Dette skyldes det faktum at papillær dermis krymper og at total Fibroblast tall reduseres med alderen11,26,27,28. Videre vil cellen pellet fra papillær dermis trolig være større enn fra retikulære dermis, siden den øvre dermis er mer tett befolket av fibroblaster enn retikulære dermis. For resten, det lavere dermis er likeledes tøffere og flere tett pakket med kollagen, gjør den hardere å distansere vevet og å løslate det fibroblaster. Av notatet, kan cellen pellet vises veldig rødt, det er derfor røde blodlegemer lyse anbefales.
I tillegg til identifisering av tre subpopulasjoner i intakt menneskelig hud, viser vi også at i dermatomed hud, hver Fibroblast delsett er beriket enten i papillær eller retikulære dermis16. Presis kutting av huden med dermatome er avgjørende for å oppnå en riktig berikelse av hver pasientpopulasjonen fra ulike dermal lag. Siden papillær dermis er svært tynn, dermatomed skive representerer det bør ikke overstige en tykkelse på 300 μm. øvre retikulære og lavere retikulære fibroblaster begge representerer retikulære avstamning og vise lignende funksjoner og gen signaturer, Derfor kan man også vurdere å ikke skille dem.
Viktigere, alle tre fibroblaster populasjoner finnes i hele dermis og er ikke utelukkende til stede i ett lag, og det er derfor explant kulturer fra papillær eller retikulære dermis resultere i blandede Fibroblast kulturer. Men FAP+CD90- papillær Fibroblast er mest rikelig i papillær dermis og følge en gradient fra overfladisk til lavere dermal lag mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster følge en inverse gradient fra nedre til overfladiske lag16. Videre flertallet av CD90+ fibroblaster av papillær dermis er nesten utelukkende funnet rundt blodkar og uttrykke inflammasjon FIBROBLAST markør CD14629, og dermed trolig utstillingen ulike funksjoner enn resterende CD146- retikulære fibroblaster16. CD146 kan brukes som en ekstra markør i gating strategi for å utelukke denne populasjonen.
Etter dissosiasjon av dermal lag, er de isolerte cellene beiset med en spesialdesignet antistoff cocktail som inneholder ulike antistoffer for utelukkelse av immunceller, endothelial og lymfatisk celler, epidermal celler, erytrocytter og MSCs til få rene Fibroblast populasjoner. Av notatet, velge en markør for identifisering og utelukkelse av MSCs kan være vanskelig på grunn av det høye antallet publiserte MSC markører30,31. Siden MSCs uttrykke CD90 som fibroblaster, ytterligere MSC markører som CD105 eller CD271 kan være nyttig for deres identifikasjon. Men MSCs bare representerer en svært lav prosentandel av alle dermal celler og siden CD90+ fibroblaster display typisk morfologiske funksjoner av fibroblaster upon sortering, kan man argumentere for at utelukkelse av MSCs ved bruk av distinkte celleoverflaten markører kan være unødvendig.
Viktigere, analyserte vi FAP og CD90 genuttrykk etter å ha holdt cellene i kultur for 7-14 dager etter sortering (data ikke vist) og funnet ut at uttrykk for begge markører er upregulated i de respektive sortert enkelt positive (FAP+CD90- eller FAP-CD90+) celler16. Vi understreker derfor at de ovenfor beskrevne markør sett og protokoll tillater isolering av primære Fibroblast delsett direkte fra vevet, men ikke fra tidligere kultivert blandet Fibroblast populasjoner.
Likevel viser vi at funksjonaliteten til alle tre subpopulasjoner er beholdt i cellekultur uavhengig av endring av celle overflate markør uttrykk, siden fibroblaster sortert som FAP+CD90- papillær fibroblaster ikke tilegne seg muligheten til å gjennomgå adipogenesis etter en lengre periode med kultur, mens fibroblaster sorteres som FAP+CD90+ eller FAP-CD90+ retikulære fibroblaster opprettholde sin evne til å differensiere til adipocytter 16 . Viktigere, vi fant også at papillær og retikulære-spesifikke gener er fortsatt uttrykt i høyere grad i FAP+CD90- og CD90+ hhv.
Avslutningsvis har vi etablert en protokoll for isolering av funksjonelt distinkte Fibroblast delsett via FACS som for første gang tillater isolering og analyse av ren og naiv Fibroblast subpopulasjoner fra menneskelig hud dermis. Denne metoden etablerer en stor avansement til vanlig brukte Fibroblast explant kultur isolasjon protokollen fra øvre og nedre dermis som (i) en opposisjon gradient av papillær og retikulære fibroblaster eksisterer fra huden overflaten til hypodermis og (II) fibroblaster endre sin gen signatur in vitro.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker takknemlig assistanse i FACS-sortering av Bärbel Reininger og Wolfgang Bauer. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til B. M. L. fra det østerrikske vitenskaps fondet (FWF: V 525-B28), og Føderasjonen av europeiske biokjemiske foreninger (FEBS, oppfølgings Forskningsfond). S. F. er mottaker av en DOC Fellowship of the Austrian Academy of Sciences (OeAW). Vi takknemlig erkjenner utmerket støtte fra kjernen anlegg ved Medical University of Vienna. Vi takker Bernhard Gesslbauer, Christine Radziszewska og Martin Vierhapper for å gi menneskelig hud materiale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material: | |||
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
| β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | CAUTION |
| C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
| Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | CAUTION |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | CAUTION |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | CAUTION |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | CAUTION |
| Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | CAUTION |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
| OilRed O | Sigma | O-0625 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ | Lonza | BE17-512F | |
| Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
| Taqman 2x Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | CAUTION Skin and eye irritant. |
| Troglitazone | Sigma | T2573 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry Antibodies: | |||
| anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
| anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
| anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
| anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
| anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
| anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
| anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
| anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
| Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| 1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
| 1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
| 5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
| 50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
| 70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
| Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
| Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
| MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
| Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
| Tea strainer | x | x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibroblast growth medium: | |||
| AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I.
- Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
- Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
- LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
- Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
- Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
- Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
- Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
- Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
- Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
- Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
- Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
- Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
- Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
- Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
- Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
- Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
- Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
- Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).
