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Genetics

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा मानव त्वचा से पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59372
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि मानव त्वचा से पैपिलरी और रीटिकुलर फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक FACS-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । यह विट्रो संस्कृति में circumvents जो explant संस्कृतियों के माध्यम से आमतौर पर इस्तेमाल किया अलगाव प्रोटोकॉल के साथ अपरिहार्य था । निकलने वाले फाइकोब्लास्ट सबसेट कार्यात्मक रूप से अलग और dermis के भीतर प्रदर्शन विभेदक जीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण कर रहे हैं ।

Abstract

फाइब्रोब्लास्ट एक अत्यधिक विषम कोशिका आबादी है जो कई मानव रोगों के रोगजनन में फंसाती है । मानव त्वचा dermis में, फाइब्रोब्लास्ट पारंपरिक रूप से उनके ऊतकीय स्थानीयकरण के अनुसार सतही अंकुरक या कम जालीदार dermis के लिए जिंमेदार ठहराया गया है । माउस डर्मिस में पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट दो विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न होते हैं जो शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं और एक विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के संबंध में अपसारी कार्यों के साथ होते हैं जिसके द्वारा उन्हें प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।

महत्वपूर्ण बात, सतही और निचले चमड़े के परतों से explant संस्कृतियों से सबूत सुझाव है कि कम से दो कार्यात्मक अलग चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट प्रजातियों मानव त्वचा dermis में के रूप में अच्छी तरह से मौजूद हैं । हालांकि, माउस त्वचा के लिए विपरीत, सेल सतह मार्कर विभिंन फाइकोब्लास्ट सबसेट के भेदभाव को सक्षम करने के लिए मानव त्वचा के लिए अभी तक स्थापित नहीं किया गया है । हम प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई (facs) दो सेल सतह मार्कर रेशकोरक सक्रियकरण प्रोटीन (FAP) और thymocyte antigen 1 (Thy1)/ इस विधि में इन विट्रो हेरफेर, जो जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था बिना शुद्ध फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव को सक्षम बनाता है, इस प्रकार ऊतक homeostasis या रोग के संबंध में मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट सबसेट के सटीक कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति पैथोलॉजी.

Introduction

संयोजी ऊतक के मुख्य सेलुलर घटक के रूप में, fibroblasts कोलेजन और लोचदार फाइबर के जमाव के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं कि अंततः extracellular मैट्रिक्स के रूप में1, और इस प्रकार, ऊतक homeostasis में उनकी भूमिका, उत्थान और बीमारी को लंबे समय से कम करके आंका गया है । हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट हाल ही में शोधकर्ताओं की सुर्खियों में आ गए हैं, न केवल क्योंकि वे प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लिए एक प्रमुख सेलुलर स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं2 लेकिन यह भी कारण के रोगजनन में उनके उच्च सुघट्यता और निहितार्थ अंग फाइब्रोसिस3,4,5 या कैंसर6,7जैसे रोगों की एक विस्तृत संख्या ।

मानव त्वचा एक बहु स्तरित उपकला से बना है, epidermis, और उसके अंतर्निहित संयोजी ऊतक, dermis, जो histologically ऊपरी अंकुरक में subdivided किया जा सकता है और कम जालीदार dermis और मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट से बना है और कोशिकीय मैट्रिक्स8 और हाइपोडर्मिस । ऊतक के भीतर अपने स्थान के अनुसार, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट मोटे तौर पर पाषाणमय और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट1में वर्गीकृत किया गया है ।

महत्वपूर्ण बात, हाल के आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इन चमड़े का फाइब्रीब्लास्ट subpopulations केवल histologically भेद नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी है कि उनके समारोह में काफी विविध है । माउस त्वचा में, papeni और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट भ्रूणजनन9के दौरान दो अलग प्रजातियों से उत्पन्न होता है । सबूत के कई लाइनों का सुझाव है कि दोनों प्रजातियों न केवल ऊतक homeostasis में विभिंन भूमिकाओं डालती है, बाल कूप morphogenesis, घाव की मरंमत और फाइब्रोसिस7,9,10, लेकिन वे भी विभिंन जवाब नियोप्लास्टिक एपिडर्मी स्टेम कोशिकाओं से संकेत11, कैंसर रोगजनन में हट भूमिकाओं का सुझाव । आसानी से, दोनों प्रजातियों वयस्क माउस त्वचा में पारस्परिक रूप से अनंय सेलुलर मार्करों का एक अलग सेट एक्सप्रेस, इस प्रकार शुद्ध त्वचीय फाइकोब्लास्ट आबादी और उनके विशिष्ट कार्यों की बाद में व्यापक विश्लेषण के अलगाव को सक्षम करने में विट्रो9 , ११।

तदनुसार, अलग आकारिकी और कार्यों, प्रसार दर हट, ऊतक remodeling क्षमता12,13, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षमता के विकास इन विट्रो में एपिडर्मल स्टेम सेल, मानव त्वचा dermis14,15के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि, मानव चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट पर प्रकाशित अध्ययन के अधिकांश मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट की त्वचीय त्वचा से explant संस्कृतियों से अलग आबादी का उपयोग कर आयोजित किया गया है, के बाद से विशिष्ट कोशिका की सतह मार्कर शुद्ध मानव पाशिकीय के अलगाव को सक्षम करने के सेट या जालीदार फाइबब्लास्ट सादृश्य में माउस dermis को subpopulations अभी तक स्थापित किया जाना था ।

हम हाल ही में प्रदर्शन किया है, कि मानव त्वचा अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों कि प्रतिदीप्ति के माध्यम से संबंधित subpopulations के अलगाव को सक्षम द्वारा विशेषता-सक्रिय सेल छंटाई (facs)16: FAP + CD90- fibroblasts मुख्य रूप से ऊपरी dermis में स्थित अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं, उच्च प्रसार दर, एक विशिष्ट जीन हस्ताक्षर लेकिन कोई adipogenic क्षमता पेश । Fap+CD90+ और fap-CD90+ फाइब्रोब्लास्ट कम चमड़े के डिब्बों की एक प्रकार की वंशावली से संबंधित हैं, जो कम प्रफलन लेकिन आसानी से गुजरना adipogenesis-जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक बानगी । इस विधि का बड़े पैमाने पर अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, न केवल शारीरिक स्थितियों के तहत उनके विशिष्ट कार्यों के संबंध में बल्कि त्वचा कैंसर सहित त्वचीय रोगों के रोगजनन के संदर्भ में भी इन अलग फाइटोब्लास्ट subpopulations ।

हालांकि, के बाद से fibroblasts दो में अपनी कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन इन विट्रो संस्कृति16,17,19, हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन मानव से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव तक ही सीमित है dermis और मिश्रित कोशिका संस्कृति आबादी में अंकुरक या जालीदार फाइब्रोब्लास्ट की पहचान की अनुमति नहीं है । महत्वपूर्ण बात है, हालांकि विट्रो में कोशिका की सतह मार्कर परिवर्तन की अभिव्यक्ति, हम दिखा दिया है कि फाइटोब्लास्ट सबसेट प्रोटोकॉल के अनुसार अलग अपने विशिष्ट कार्यशीलता बनाए रखने के नीचे वर्णित है जब16की खेती, इस प्रकार सक्षम शारीरिक या रोग स्थितियों के तहत सबसेट विशिष्ट गुणों के इन विट्रो अध्ययन ।

अंत में, हम FACS के माध्यम से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है कि पहली बार के लिए एक भोले राज्य में मानव त्वचा dermis से शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी के अलगाव परमिट ।

Protocol

मानव त्वचा कोकेशियान पुरुषों और महिलाओं से प्राप्त किया गया 26 आयु वर्ग के ६१ वर्ष (सूर्य की रक्षा की त्वचा; पेट में सुधार, स्तन में कटौती). लिखित सूचित रोगी सहमति हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार ऊतक संग्रह से पहले प्राप्त किया गया था, और वियना चिकित्सा विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन के साथ.

नोट: हम कार्यात्मक रूप से अलग फाइकोब्लास्ट subpopulations के अलगाव के लिए या तो पूर्ण मोटाई dermis से एक प्रोटोकॉल प्रदान (1 अनुभाग को देखें) या इसके विभिंन परतों में मानव त्वचा dermis परिच्छेदन के बाद (अनुभाग 1 छोड़ें और सीधे धारा 2 को देखें) .

1. पूर्ण मोटाई Dermis की तैयारी

  1. एक 10 सेमी x 10 सेमी मानव त्वचा टुकड़ा (जैसे, पेट सुधार या स्तन में कटौती से) एपिडर्मिस मोटी फिल्टर कागज पर नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ प्लेस ।
  2. एपिडर्मिस कसकर संदंश के साथ अपने किनारों पर पकड़ और एक स्केलपेल के साथ बंद चमड़े के नीचे वसा परत परिमार्जन । फिर उंहें एक पेट्री डिश में डालने से पहले 5 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में ऊतक स्लाइस ।
    नोट: इसके बाद, यदि एपिडर्मिस को पूरे डर्मिस से अलग करने की आवश्यकता होती है तो इसका प्रयोग किया जाता है । के लिए यह खंड 2 छोड़ और सीधे धारा 3 को देखें । संदूषण से बचने के लिए, शल्य हटाने के बाद ऊतक बाँझ रखने या इथेनॉल या आयोडीन समाधान के साथ अच्छी तरह से साफ । अगर सब पर, त्वचा की सतह के इथेनॉल उपचार केवल छोटे सेल मौत का कारण बनता है । एक ऊतक संस्कृति प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं ।

2. एक Dermatome के साथ पैपिलरी और मिटिकुलर परतों में मानव त्वचा Dermis के sectioning

  1. एक 10 सेमी x 10 सेमी त्वचा टुकड़ा (जैसे, पेट सुधार या स्तन कटौती से) मोटी फिल्टर कागज पर, एपिडर्मिस ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ प्लेस । त्वचा को कसकर उसके किनारों पर संदंश के साथ पकड़ो ।
  2. एक बिजली dermatome के साथ त्वचा स्लाइस, एक काटने की मोटाई को समायोजित/३०० μm की गहराई, अपने आप से दूर dermatome के सिर फिसलने से, ब्लेड के साथ त्वचा की सतह के संबंध में एक ९० ° कोण पर जा रहा है ।
  3. एपिडर्मिस और पैपिलरी डर्मिस (३०० μm मोटी, "डर्मी लेयर 1", चित्रा 1 और चित्रा 2) से मिलकर पहली परत लें और इसे पेट्री डिश में डालें । धारा 3 के लिए तुरंत आगे बढ़ें या 1x PBS जोड़ने के लिए बाहर सुखाने से ऊतक रखने के लिए ।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए, शल्य हटाने के बाद ऊतक बाँझ रखने या इथेनॉल या आयोडीन समाधान के साथ अच्छी तरह से साफ । एक ऊतक संस्कृति प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं ।
    चेतावनी: Dermatome सावधानी से संभाल के बाद से ब्लेड बहुत तेज कर रहे हैं ।
  4. दोहराएं कदम २.२ ७०० μm की एक काटने की मोटाई के लिए dermatome समायोजन और शेष dermis टुकड़ा । एक अलग पेट्री पकवान में ऊपरी जालीदार dermis ("त्वचीय परत 2", चित्रा 2) के रूप में परिभाषित किया गया है जो ऊपरी टुकड़ा रखें । धारा 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें या 1x PBS जोड़ने के लिए बाहर सुखाने से ऊतक रखने के लिए ।
  5. अवत्वचीय वसा परत को अवशिष्ट निचली त्वचा की त्वचीय परत (> 1000 μm) से स्कैलपेल के साथ परिमार्जन करें और इसे फेंक दें । एक और पेट्री डिश में कम जालीदार dermis ("त्वचीय परत 3", चित्रा 2) लीजिए । धारा 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें या 1x PBS जोड़ने के लिए बाहर सुखाने से ऊतक रखने के लिए ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक स्केलपेल के साथ वसा बंद scraping के बजाय, कैंची के साथ वसा परत को हटा दें । यह बर्फ पर जालीदार dermis डाल करने के लिए वसा दूर scraping से पहले मदद कर सकता है ।

3. एपिडर्मिस और डर्मिस का पृथक्करण

  1. एक 3 U/एमएल वियोजी एंजाइम (यानी, dispase द्वितीय) समाधान बाँझ 1x pbs में तैयार करें । 5 मिमी त्वचा धारियों (1 अनुभाग से), या एपिडर्मिस/पैशिका dermis (कदम से २.२), एपिडर्मिस 10 सेमी पेट्री डिश के साथ 10 मिलीलीटर 3 U/ पेट्री डिश को 1 ज के लिए ३७ ° c पर सेते हैं ।
    1. यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । 4 ° c के बजाय रात में फ्रिज में प्रोटिनेज में एपिडर्मिस/ के रूप में की जरूरत है अंय परतों की दुकान (त्वचीय परत 1, 2 और 3) रातोंरात में डूब 1x PBS में ५० मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस ।
      चेतावनी: Protease के साथ सावधानी से काम करते हैं, यह संपर्क पर त्वचा और आंखों जलन हो सकती है ।
  2. इंक्यूबेशन के बाद, एपिडर्मिस/पैपिलरी डर्मिस को पेट्री डिश के शुष्क ढक्कन में स्थानांतरित कर दो संदंश के साथ ऊपरी डर्मिस (त्वचीय परत 1) से एपिडर्मिस को अलग कर देते हैं ।

4. त्वचीय ऊतक के enzymatic पाचन

  1. प्रत्येक त्वचीय परत mince (त्वचीय परत 1, 2 और 3) कैंची के साथ अलग से/ छोटे टुकड़े, बेहतर ऊतक पाचन ।
    नोट: Dermis की क्रूरता शरीर के अंग यह (जैसे, पेट या ऊपरी बांह त्वचा) से originates के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
  2. के संयोजन से पाचन मिश्रण तैयार १.२५ मिलीग्राम/एमएल collagenase मैं, ०.५ मिलीग्राम/एमएल collagenase द्वितीय, ०.५ मिलीग्राम/एमएल collagenase चतुर्थ और ०.१ मिलीग्राम/एमएल hyaluronidase Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में एल glutamine के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), 10% भ्रूण बछड़ा सीरम ( (च) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) ।
    चेतावनी: इन संपर्क पर त्वचा और आंखों में जलन हो सकती है के रूप में collagenases के साथ सावधानी से काम करते हैं ।
  3. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में तैयार पाचन के 10 मिलीलीटर के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतकों के प्रत्येक रखो और एक ३७ डिग्री सेल्सियस गर्म पानी स्नान में सेने के लिए 1 ज स्थाई आंदोलन के तहत । पाचन के दौरान नलियों को कई बार पलटी ।
    नोट: एक कीमा बनाया हुआ त्वचा टुकड़ा के आकार के अनुसार पाचन मात्रा को समायोजित करने पर विचार करना चाहिए । अधिभार नहीं 10 मिलीलीटर पाचन बहुत अधिक ऊतक के साथ मिक्स अन्यथा कोशिका की पैदावार कम होगी । कुल मात्रा के भीतर ऊतक के एक तिहाई से भी कम की सिफारिश की है (1:2 w/

5. एकल कोशिका निलंबन और एरिथ्रोसाइट Lysis की तैयारी

  1. एंजाइमेटिक ऊतक पाचन को रोकें 10 मिलीलीटर फाइकोब्लास्ट मीडियम (डीएमईएम के साथ एल-ग्लूटेमीन, 10% एफसीएस और 1% पी/एस) को मिलाकर पचाया गया ऊतक । यहां से बर्फ पर काम करते हैं ।
  2. एक नियमित रूप से बाँझ स्टेनलेस चाय छलनी के माध्यम से प्रत्येक ट्यूब की सामग्री डालो और एक साफ पेट्री डिश में सेल निलंबन इकट्ठा । एक सिरिंज-प्लंजर के किनारे के साथ छन्नी को मध्यम और मैश किया हुआ ऊतक के टुकड़ों के साथ धोएं ।
  3. बाद में, पिपेट एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से सेल निलंबन एकत्र । मध्यम के साथ सेल छलनी कुल्ला और एक ही ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा ।
  4. 10 मिनट के लिए 4 ° c पर ५०० x g पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों निकालें और 5 मिलीलीटर फाइकोब्लास्ट माध्यम के साथ supernatant और धोने सेल गोली को हटा दें । अपकेंद्रण चरण को दोहराएं ।
  5. निकालें और supernatant छोड़ें और 1 मिलीलीटर सेल्फ मेड ACK एरिथ्रोसाइट lysis बफर (०.१५ मीटर एनएच4सीएल, 10 मिमी खको3, ०.१ मिमी एनए2edta; पीएच 7.2 \ u 20127.4) में गोली resuspend । कोशिकाओं lysis बफर में परिवेश के तापमान पर लगभग 1 मिनट के लिए छोड़ (20 \ u201222 डिग्री सेल्सियस) ।
  6. 10% FCS के साथ 1x PBS के 9 मिलीलीटर जोड़ कर lysis और ट्यूबों फिर से अपकेंद्रित्र ५०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट के लिए । छोड़ देना supernatant ।
    चेतावनी: एरिथ्रोसाइट lysis में ऊष्मायन समय अगर lysis अधूरा (लाल गोली) लगता है समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, कोशिकाओं को एरिथ्रोसाइट lysis बफर में भी लंबे समय के लिए नहीं छोड़ते फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के lysis से बचने के लिए ।

6. FACS के लिए ब्लॉकिंग और धुंधला फाइब्रोब्लास्ट

  1. 10% FCS के साथ 1x PBS के १०० μL में मानव एफसी-रिसेप्टर अवरुद्ध समाधान के 5 μL तैयार करें और १०० μL के मानव एफसी अवरोधक में कोशिकाओं को निलंबित । 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेबेट ।
  2. मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के दाग के लिए एक FACS धुंधला पैनल डिजाइन । मिश्रण विरोधी मानव FAP APC (1:20), विरोधी मानव CD90 AF700 (1:30), विरोधी मानव ई-cadherin पीई (1:20), मानव विरोधी CD31 FITC (1:30), विरोधी मानव CD45 प्रशांत नीला (1:20), विरोधी मानव ITGA6 पीई (1:20), विरोधी मानव CD235ab प्रशांत ब्लू (1:1000) और विरोधी मानव CD106 प्रशांत नीला (1:100) 1x PBS में 10% FCS के साथ ।
  3. एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध करने के बाद, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० एक्स जी पर नीचे स्पिन कोशिकाओं को हटाने और supernatant त्यागने और एंटीबॉडी मिक्स के १०० μl में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं सेते ।
    1. पहले धुंधला करने के लिए, एक उच्च सेल नंबर के साथ एक नमूना के 20 μL निकालें unstained और एकल दाग FACS नियंत्रण के लिए ।
  4. 10% FCS के साथ ५०० μL 1x PBS के साथ दो बार दाग कोशिकाओं और FACS नियंत्रण धोने और ५०० एक्स जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र । इस बीच, 1 μg/mL की अंतिम सांद्रता बनाने के लिए 10% FCS के साथ 4 ′, 6-डाइमिडिनो-2-फेनिलिनोल (DAPI) को 1x PBS में जोड़ें ।
  5. निकालें और supernatant छोड़ें, २०० μL DAPI समाधान में कोशिकाओं को निलंबित और एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में एक ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से प्रत्येक कोशिका निलंबन फ़िल्टर ।
    नोट: FACS देरी के साथ प्रदर्शन किया जा रहा है, तो रिकॉर्डिंग से पहले शीघ्र ही DAPI और फिल्टर जोड़ें.

7. मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट सबसेट अलगाव और FACS के लिए रणनीति Gating

  1. रिकॉर्ड प्रवाह कोशिका मिति नियंत्रण, सही वोल्टेज सेटिंग सेट और उचित मुआवजा प्रदर्शन. एकल कोशिकाओं और जीने के लिए गेट (DAPI-), प्रशांत नीला, पीई और fitc नकारात्मक कोशिकाओं (CD45-, CD31-,CD235ab-, CD106-, ITGA6 और ई-cadherin-) तीन फाइकोब्लास्ट आबादी पाने के लिए: FAP+ CD90-, fap+CD90 + और fap-CD90+ कोशिकाओं । चित्रा 3देखें ।
  2. अलग १.५ मिलीलीटर पेंच कैप माइक्रोअपकेंद्री ट्यूबों में या तो ३५० μL lysis बफर के साथ आर. एन. ए अलगाव के लिए या ३५० μL फाइकोब्लास्ट विकास माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ भरा के साथ तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations सॉर्ट सेल संस्कृति के लिए । तुरंत सॉर्ट करने के बाद ट्यूबों पलटना और या तो स्नैप ठंड के लिए तरल नाइट्रोजन में lysis बफर ट्यूबों डाल या बर्फ पर मध्यम ट्यूबों डाल दिया ।
    चेतावनी: ०.१% बी के साथ lysis बफर तैयार धूआं हुड में Mercaptoethanol और साँस लेना से बचें ।

8. फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोजेनेसिस परख के culturing

  1. FACS के बाद, ५०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस और प्लेट बराबर सेल नंबर पर 3 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं (5000 \ u201210, 000 कोशिकाओं ४८/ जब तक वे ७०% प्रवाह तक पहुंच कोशिकाओं को बढ़ने के लिए छोड़ दें ।
  2. 5 μg/mL इंसुलिन, 5 μM troglitazone, ०.५ मिमी 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) और 1 μM dexametasone फाइटोब्लास्ट वृद्धि माध्यम करने के लिए एडिपोसाइट विभेदन माध्यम तैयार करने के लिए जोड़ें ।
  3. एडिपोसाइट विभेदन माध्यम के साथ संवर्धित कोशिकाओं के माध्यम बदलें और कोशिकाओं 14 दिनों के लिए अंतर । 5 μg/एमएल इंसुलिन और 5 μM troglitazone युक्त कम adipogenesis माध्यम के साथ 2 दिन के बाद विनिमय मध्यम । हर 3rd या 4वें दिन माध्यम की भरपाई ।
  4. 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं फिक्स परिवेश तापमान (20 \ u201222 डिग्री सेल्सियस) में 20 मिनट के लिए भेदभाव दिवस 14 पर । ६०% isopropanol के साथ कुओं धोने और इसे पूरी तरह से लुप्त हो जाना । 5 मिमी तेल लाल O (उपयोग करने से पहले फ़िल्टर) के साथ कोशिकाओं दाग 20 मिनट के लिए दाग कोशिकाओं को आसुत पानी से चार बार धोएं । माइक्रोस्कोपी करने के लिए आगे बढ़ें ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त और हानिकारक है । सावधानी से संभाल लें ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । फिक्स्ड कोशिकाओं को 1x PBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है जब तक तेल लाल ओ धुंधला किया जाता है । वाष्पीकरण से बचने के लिए भंडारण से पहले पैराफिन फिल्म के साथ कवर पकवान ।
  5. छवि कोशिकाओं को संचारित प्रकाश के साथ 10x इज़ाफ़ा पर एक औंधा खुर्दबीन के साथ पानी में डूबे ।

Representative Results

एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए प्रसंस्करण त्वचा ऊतक के लिए मुख्य कदम का एक सिंहावलोकन चित्र 1में दिखाया गया है, त्वचा की dermatoming प्रदर्शित (चित्रा 1a), विभिन्न त्वचीय परतों (चित्र 1b), चमड़े के नीचे वसा को हटाने परत (चित्रा 1 ग) और एपिडर्मिस और पैपिलरी dermis के जुदाई (चित्रा 1 डी), साथ ही साथ मैनुअल और एंजाइमी ऊतक वियोजन के विभिन्न चरणों (चित्रा 1c, F). चित्र 2में तीन त्वचीय परतों की एक योजना प्रदान की गई है ।

चित्रा 3 मानव त्वचा से अलग फाइटोब्लास्ट सबसेट के विश्लेषण के लिए एक प्रवाह कोशिका मिति धुंधला पैनल के gating रणनीति प्रदर्शित करता है । अतिरिक्त सेल सतह मार्कर है कि fibroblasts पर व्यक्त नहीं कर रहे हैं अनुमति देने के लिए त्वचा में मौजूद विभिन्न अन्य कोशिकाओं के बहिष्करण जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एपिडर्मल कोशिकाओं, मध्योतक स्टेम सेल (mscs), लाल रक्त कोशिकाओं या endothelial कोशिकाओं के अधिकतम शुद्धता प्राप्त करने के लिए इक्का-दुक्का आबादी में । यह एक समान FACS इन फाइकोब्लास्ट subpopulations की पहचान के लिए 2 चित्रा में इस्तेमाल पैनल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन यह हमारी सिफारिश है. एक अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करें या अपवर्जन मार्कर के संयोजन में परिवर्तन हो सकता है ।

ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल मानव त्वचा जो अलग intradermal स्थानीयकरण, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और भी कार्य के साथ वर्तमान में तीन फाइकोब्लास्ट आबादी की पहचान सक्षम बनाता है (चित्रा 4) । Fap+CD90- पित्ती dermis में समृद्ध कर रहे हैं, जबकि fap+CD90+ और fap-CD90+ में अधिक प्रचुर मात्रा में है जालीदार dermis (चित्रा 4a) । सभी तीन subpopulations कोशिका संस्कृति में छंटाई पर ठेठ फाइवब्लास्ट आकारिकी प्रदर्शन (चित्रा 4b) । दिलचस्प है, वे अपने adipocytes जो जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक बानगी है में अंतर करने की क्षमता के बारे में अलग है । वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)16 (चित्रा 4c) के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के साथ इन परिणामों के संयोजन, दिखा रहा है कि FAP+CD90- कोशिकाओं आमतौर पर मार्कर के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए जिंमेदार ठहराया इस तरह के CD26, ntn और pdpn के रूप में अंकुरक fibroblasts जबकि CD90+ कोशिकाओं को उच्च स्तर पर CD36, ACTA2 और pparγ के रूप में जाना जाता है कि जालीदार मार्कर एक्सप्रेस, हम निष्कर्ष है कि FAP+CD90- कोशिकाओं पाशकीय और CD90 के हैं+ कोशिकाऐं वंश से संबंधित होती हैं.

Figure 1
चित्रा 1: अखंड मानव त्वचा से चमड़े के एकल कोशिका निलंबन का अलगाव । (क) त्वचा को पैपिलरी और रीटिकुलर डर्मिस में एक विद्युत त्वचीय के साथ कटा हुआ है । (ख) आसन्न एपिडर्मिस के साथ पैपिलरी डर्मिस ३०० μm मोटा (शीर्ष) है जबकि ऊपरी रिटिकुलर डर्मिस ७०० μm मोटा (नीचे) है । (ग) अधस्त्वचीय वसा की परत, स्केलपेल के साथ निम्नतर मितकीय डर्मिस से खुबतर हो जाती है । (घ) 1 ज के लिए ३७ ° ब् पर वियोजन एंजाइम विलयन में पैपिलरी डर्मिस के ऊष्मायन के पश्चात बाह्यत्वचा को संदंश के साथ आसानी से निकाला जा सकता है । (ङ) विभिन्न चर्म परतों को कैंची से मिलाया जाता है और इसे एंजाइम पाचन मिश्रण में अंतरित किया जाता है जिसमें कोलेजिनेनेस I, II और IV तथा हायलुरोनिडेस शामिल है । (च) 1 ह के ३७ ° ब् पर वियोजन के बाद ऊतक पाचन रूक जाता है तथा अपचित त्वचा के टुकड़ों को हटाने के लिए एक चाय छन्नी के माध्यम से निलंबन को रोक दिया जाता है । (ज) कोशिका निलंबन को ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से एक बार फिर छान कर 10 मिनट के लिए ५०० × छ पर अपकेंद्रित किया जाता है । (H) अपकेंद्रण के बाद, सेल गोली 1x PBS के साथ 10% FCS के साथ धोया जाता है और facs धुंधला के लिए तैयार है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक dermatome के साथ पैपिलरी और एक प्रकार की हड्डी परतों में मानव त्वचा dermis के Sectioning. एक ऐसी योजना जिसमें पूर्ण मोटाई की त्वचा को टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा प्राप्त तीन त्वचीय परतें (एपिडर्मिस सहित) (बाह्यत्वचा; 0 \ u2012300 μm; त्वचीय परत 1), ऊपरी (300 \ u20121, 000 μm; त्वचीय लेयर 2) और निचली मिटिकुलर डर्मिस (> 1000 माइक्रोमीटर डर्मी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: FACS gating मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट subpopulations के लिए रणनीति । (A\u2012e) सबसे पहले, कोशिकाओं को एक (ख) और व्यवहार्य (dapi-) कोशिकाओं (सी) पर gated हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+), मध्योतक स्टेम सेल (CD106+), लाल रक्त कोशिकाओं (CD235ab+) को बाहर रखा जाता है (ग) और प्रशांत नीला नकारात्मक कोशिकाओं ई cadherin पर आगे gated है (ecad) और ITGA6 डबल नकारात्मक कोशिकाओं (पीई चैनल, डी ). E-cadherin और ITGA6 एपिडर्मल कोशिकाओं पर व्यक्त मार्कर हैं । अगले, CD31-FITC सकारात्मक कोशिकाओं (endothelial और लसीका कोशिकाओं) को छोड़ दिया (घ) तीन फाइकोब्लास्ट या तो एक या दोनों कोशिका की सतह फाइकोब्लास्ट मार्करों FAP और CD90 के दोनों व्यक्त की आबादी में जिसके परिणामस्वरूप: fap+CD90-, Fap+CD90+ और fap-CD90+ (ई) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: FAP+CD90-, fap+CD90+ और fap-CD90+ fibroblasts त्वचीय स्थानीयकरण में अलग, जीन अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता । (क) पैपिलरी, अपर रिटिकुलर और लोअर मिटिकुलर डर्मिस से अलग टेड फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि फैक्स प्लॉट । चित्र-3में गेटिंग की रणनीति बताई गई है । FAP+CD90- फाइब्रोब्लास्ट पैपिलरी dermis में समृद्ध कर रहे हैं (१९.२%) कम रिटिकुलर डर्मिस (०.८३%) की तुलना में । FAP+CD90+ कोशिकाओं dermis भर में पाया जा सकता है लेकिन उनके उच्चतम बहुतायत ऊपरी जालीदार dermis (४०.७%) । FAP-CD90+ कम लालिक्यूलर dermis में समृद्ध कर रहे है (६४.४%) । (ख) नोट की, सभी तीन सॉर्ट की गई subpopulations 7 दिनों (बाएं) के लिए संस्कृति पर ठेठ फाइकोब्लास्ट आकारिकी प्रदर्शित करते हैं । दिलचस्प है, वे एक adipogenesis परख में अलग व्यवहार करते हैं । संस्कृति में 14 दिनों के बाद, FAP+CD90- adipocytes में अंतर नहीं है जबकिFAP +CD90+ और fap-CD90+ आसानीसेगुजरना adipoउत्पत्ति (सही; तेल लाल ओ दाग लिपिड असर कोशिकाओं लाल) । स्केल पट्टियां = १,००० μm । (ग) सीधे छांटे गए FAP+CD90- fibroblasts एक्सप्रेस पिलरी फाइब्रोब्लास्ट मार्करों CD26, NTN1 और pdpn, जबकि FAP-CD90+ कक्षों एक्सप्रेस CD36, ACTA2 और pparγ, जाना जाता है जो रीतिमय वंश द्वारा व्यक्त किया गया । * p ≤ ०.०५; p ≤ ०.०००५ की तुलना में FAP+/cd90- कोशिकाओं; # p ≤ ०.०५; # # # p ≤ ०.०००५ की तुलना में FAP-/cd90+ कोशिकाओं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस लेख में, हम मानव त्वचा से अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन । CD90 व्यापक रूप से किया गया है पहचान या चर्मपत्र फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव18,20,21। तथापि, हमने यह प्रदशत किया है कि CD90 + फाइब्रोब्लास्ट के अलावा, मानव डर्मिस भी एक CD90- फाइब्रोब्लास्ट जनसंख्या के अग्रदूत हैं, जिसमें16FAP, जो सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के लिए मार्कर के रूप में स्थापित किया गया है ( Cafs)22,23,24,25। महत्वपूर्ण बात, हम तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations FAP+CD90 की पहचानकरने में सक्षम थे, fap+CD90 + और fap-CD90+ सभी स्वस्थ मानव दाताओं से त्वचा बायोप्सी में । इसलिए हम निष्कर्ष है कि FAP केवल सक्रिय fibroblasts या CAFs लेकिन यह भी सामांय ऊतक फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक मार्कर नहीं है ।

ध्यान दें, FAP-CD90- कोशिका आबादी के ऊपर-वर्णित बहिष्करण-और gating रणनीति के आवेदन के बाद शेष fibroblasts शामिल नहीं है, क्योंकि इन कोशिकाओं fibroblasts खेती मध्यम में विट्रो में पैदा करना नहीं है, लेकिन सबसे संभावित एक मिश्रित कोशिका आबादी सहित लसीका कोशिकाओं और pericytes16दूसरों के बीच ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग द्वारा प्राप्त सेल उपज शरीर-भाग के आधार पर अलग कर सकते है कि त्वचा टुकड़ा अलगाव के लिए इस्तेमाल से निकलती है । शरीर के विभिन्न अंगों से डर्मिस अपनी संरचना, मोटाई के साथ ही कोलेजन संरचना के बारे में अलग है । उदाहरण के लिए, चेहरे या ऊपरी बांह से त्वचा बहुत पतली है पेट या जांघ, जो भी अक्सर एक मोटा चमड़े के नीचे वसा परत प्रदर्शित से त्वचा की तुलना में । इसके अतिरिक्त, उंर और त्वचा दाताओं के सेक्स और न केवल ऊतक वियोजन दक्षता प्रभाव हो सकता है, लेकिन यह भी तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations के वितरण को प्रभावित कर सकता है (चित्रा 3) जब पूर्ण मोटाई त्वचा से अलग । इस तथ्य यह है कि पैशिलरी dermis सिकुड़ती है और कि कुल फाइकोब्लास्ट संख्या11,26,27,28उम्र के साथ कम से परिणाम । इसके अलावा, पैपिलरी डर्मिस से गुटिका गोली संभवत: मिटिकुलर डर्मिस से भी बड़ी होगी, क्योंकि ऊपरी डर्मिस, रीटिकुलर डर्मिस की तुलना में फाइब्रोब्लास्ट से अधिक घनी आबादी वाला है । इसके अलावा, कम dermis भी मुश्किल और अधिक घनी कोलेजन के साथ पैक किया जाता है, यह कठिन ऊतक अलग करना और फाइब्रोब्लास्ट जारी करने के लिए बना । नोट की, सेल गोली बहुत लाल दिखाई दे सकता है, यही वजह है कि लाल रक्त कोशिका lysis की सिफारिश की है ।

बरकरार मानव त्वचा में तीन subpopulations की पहचान के अलावा, हम यह भी बताते है कि त्वचा की सूजन में, प्रत्येक फाइकोब्लास्ट उपसमुच्चय या तो अंकुरक या जालीदार dermis16में समृद्ध है । त्वचीय परतों से प्रत्येक उपजनसंख्या का एक उचित संवर्धन प्राप्त करने के लिए डर्मा के साथ त्वचा की सटीक टुकड़ा करने की क्रिया महत्वपूर्ण है । के बाद से पिल्लों से भरा हुआ dermis बहुत पतली है, त्वचीय स्लाइस का प्रतिनिधित्व यह ३०० μm की मोटाई से अधिक नहीं होना चाहिए. ऊपरी जालीदार और कम जालीदार फाइब्रोब्लास्ट दोनों जालीदार वंश का प्रतिनिधित्व करते है और इसी तरह के कार्यों और जीन हस्ताक्षर प्रदर्शन, इसलिए कोई भी उन्हें अलग नहीं करने पर विचार कर सकता है ।

महत्वपूर्ण बात, सभी तीन फाइब्रोब्लास्ट आबादी dermis भर में पाए जाते है और विशेष रूप से एक परत में मौजूद नहीं हैं, यही वजह है कि पाशकीय या मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों में जालीदार dermis परिणाम से explant संस्कृतियों । हालांकि, fap+CD90- अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट पैपिलरी dermis में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं और सतही से कम त्वचीय परतों के लिए एक ढाल का पालन करें, जबकि fap+CD90+ और fap-CD90+ फाइब्रोब्लास्ट एक का पालन करें लोअर से सतही परतों16के लिए व्युत्क्रम ढाल । इसके अलावा, CD90 के बहुमत अंकुरक से भरा हुआ dermis के फाइब्रोब्लास्ट लगभग विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं के आसपास पाए जाते हैं और29CD146 परिसंवहनी फाइब्रोब्लास्ट मार्कर व्यक्त करते हैं, और इस तरह शायद से अलग कार्यों प्रदर्शन शेष CD146- जालीदार फाइब्रोब्लास्ट16. CD146 gating रणनीति में एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस आबादी को बाहर ।

त्वचीय परतों की वियोजन के बाद, अलग कोशिकाओं को विशेष रूप से डिजाइन एंटीबॉडी एक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहिष्करण के लिए विभिन्न एंटीबॉडी युक्त कॉकटेल के साथ दाग रहे हैं, endothelial और लसीका कोशिकाओं, एपिडर्मल कोशिकाओं, एरिथ्रोसाइट्स और mscs करने के लिए शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी प्राप्त करें । नोट की, पहचान और mscs के बहिष्कार के लिए एक मार्कर का चयन क्योंकि प्रकाशित MSC मार्कर की उच्च संख्या30,31मुश्किल हो सकता है । चूंकि एमएससीएस एक्सप्रेस CD90 फाइब्रोब्लास्ट की तरह, अतिरिक्त एमएससी मार्कर जैसे CD105 या CD271 उनकी पहचान के लिए उपयोगी साबित हो सकता है । हालांकि, MSCs केवल सभी त्वचीय कोशिकाओं का एक बहुत कम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते है और के बाद से CD90+ fibroblasts प्रदर्शन छँटाई पर fibroblasts की ठेठ रूपात्मक सुविधाओं, एक तर्क दे सकता है कि अलग सेल सतह मार्कर के उपयोग द्वारा mscs के बहिष्कार हो सकता है अनावश्यक हो ।

महत्वपूर्ण बात, हम 7-14 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को रखने के बाद छंटाई (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बाद FAP और CD90 जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और पाया कि दोनों मार्करों की अभिव्यक्ति संबंधित हल एकल सकारात्मक में upregulated है (FAP+CD90- या FAP-CD90+) कोशिकाओं16। इसलिए हम जोर देते है कि इसके बाद के संस्करण का वर्णन मार्कर सेट और प्रोटोकॉल सीधे ऊतक से प्राथमिक फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव की अनुमति नहीं है, लेकिन पहले से संस्कारित मिश्रित फाइकोब्लास्ट आबादी से ।

फिर भी, हम प्रदर्शित करते है कि सभी तीन subpopulations की कार्यशीलता कोशिका संस्कृति में कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति के परिवर्तन की परवाह किए बिना बनाए रखा है, क्योंकि के रूप में fibroblasts के हल FAP+CD90- अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट नहीं संस्कृति की एक लंबी अवधि के बाद adipogenesis से गुजरना करने की क्षमता हासिल है, जबकि fibroblasts के रूप में छांटे गए fap+CD90+ या fap-CD90+ जालीदार फाइब्रोब्लास्ट अपने adipocytes में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने 16 . महत्वपूर्ण बात, हमने यह भी पाया है कि पैपिलरी और लिटिकुलर-विशिष्ट जीन अभी भी FAP में अधिक हद तक व्यक्त कर रहे हैं+CD90- और CD90+ क्रमशः.

अंत में, हम facs के माध्यम कार्यात्मक रूप से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है कि पहली बार मानव त्वचा dermis से अलगाव और शुद्ध और भोली फाइकोब्लास्ट सबसेट के विश्लेषण परमिट के लिए । इस विधि के लिए एक बड़ी उंनति स्थापित करता है आमतौर पर इस्तेमाल किया फाइब्रोब्लास्ट explant ऊपरी और निचले dermis से संस्कृति अलगाव प्रोटोकॉल के रूप में (i) एक विरोधी के ढाल और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट त्वचा की सतह से hypodermis करने के लिए मौजूद है और (ii) fibroblasts में उनके जीन हस्ताक्षर विट्रो में बदल जाते हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता FACS में सहायता स्वीकार करते हैं-Bärbel रेनेंगर और Wolfgang Bauer द्वारा छंटाई । यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF: V ५२५-B28) से बी एम एल के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और यूरोपीय जैव रासायनिक समाजों के फेडरेशन (FEBS, अनुवर्ती अनुसंधान कोष) । एस एफ ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी (OeAW) के एक डॉक्टर फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । हम वियना के चिकित्सा विश्वविद्यालय में प्रमुख सुविधाओं से उत्कृष्ट समर्थन स्वीकार करते हैं । हम मानव त्वचा सामग्री प्रदान करने के लिए बर्नहार्ड Gesslbauer, Christine Radtke और मार्टिन Vierhapper धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2x Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४७ facs सेल सतह मार्कर फाइब्रोब्लास्ट विषमता फाइब्रोब्लास्ट प्रजातियों मानव त्वचा अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट
प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा मानव त्वचा से पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव
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Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).

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