Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59372
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

Abstract

Les fibroblastes sont une population cellulaire très hétérogène impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies humaines. Dans le derme cutané humain, les fibroblastes ont traditionnellement été attribués au derme superficiel papillaire ou inférieur réticulaire en fonction de leur localisation histologique. Dans le derme de la souris, les fibroblastes papillaires et réticulaires proviennent de deux lignées différentes avec des fonctions divergentes concernant les processus physiologiques et pathologiques et un profil d’expression de marqueur de surface cellulaire distinct par lequel ils peuvent être distingués.

Il est important de noter que les données issues de cultures explants provenant de couches superficielles et inférieures de la peau suggèrent qu’au moins deux lignées de fibroblastes cutanés fonctionnellement distinctes existent également dans le derme cutané humain. Cependant, contrairement à la peau de la souris, les marqueurs de surface cellulaire permettant la discrimination de différents sous-ensembles de fibroblastes n’ont pas encore été établis pour la peau humaine. Nous avons développé un nouveau protocole pour l’isolement des populations de fibroblastes papillaires et réticulaires humains par le biais du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant les deux marqueurs de surface des cellules protéine d’activation des fibroblastes (FAP) et l’antigène thymocyte 1 (Thy1)/CD90. Cette méthode permet l’isolement des sous-ensembles de fibroblastes purs sans manipulation in vitro, qui a été montré pour affecter l’expression génique, permettant ainsi une analyse fonctionnelle précise des sous-ensembles de fibroblastes cutanées humaines en ce qui concerne l’homéostasie tissulaire ou la maladie pathologie.

Introduction

En tant que principale composante cellulaire du tissu conjonctif, les fibroblastes sont principalement responsables du dépôt de collagène et de fibres élastiques qui forment finalement la matrice extracellulaire1, et donc leur rôle dans l’homéostasie tissulaire, la régénération et la maladie a été sous-estimée pendant une longue période. Cependant, les fibroblastes ont récemment été sous le feu des projecteurs des chercheurs, non seulement parce qu’ils représentent une source cellulaire importante pour les cellules souches pluripotentes induites2 , mais aussi en raison de leur forte plasticité et implication dans la pathogenèse de un grand nombre de maladies telles que la fibrose des organes3,4,5 ou le cancer6,7.

La peau humaine est composée d’un épithélium multicouche, de l’épiderme et de son tissu conjonctif sous-jacent, le derme, qui peut être subdivisé histologiquement en le derme supérieur du papillaire et du bas réticulaire et est principalement composé de fibroblastes et matrice extracellulaire8 et l’hypoderme. Selon leur emplacement dans le tissu, les fibroblastes dermiques ont été classés dans les fibroblastes papillaires et réticulaires1.

Il est important de noter que les données récentes indiquent que ces sous-populations de fibroblastes dermiques sont non seulement histologiquement distinguées, mais aussi que leur fonction est considérablement diverse. Dans la peau de la souris, les fibroblastes papillaires et réticulaires proviennent de deux lignées distinctes au cours de l’embryogenèse9. Plusieurs lignes de preuve suggèrent que les deux lignées exercent des rôles différents non seulement dans l’homéostasie tissulaire, la morphogenèse des follicules pileux, la réparation des plaies et la fibrose7,9,10, mais elles répondent également à différentes signaux des cellules souches épidermiques néoplasiques11, suggérant des rôles divergents dans la pathogenèse du cancer. Commodément, les deux lignées expriment un ensemble distinct de marqueurs cellulaires mutuellement exclusifs dans la peau de souris adulte, permettant ainsi l’isolement des populations de fibroblastes cutanés purs et une analyse approfondie subséquente de leurs fonctions spécifiques in vitro9 , le 11.

En conséquence, au moins deux sous-ensembles distincts de fibroblastes avec une morphologie et des fonctions distinctes, y compris des taux de prolifération divergents, des capacités de remodelage tissulaire12,13, ainsi que la capacité de soutenir la croissance de des cellules souches épidermiques in vitro, ont été décrites pour la peau humaine DermIS14,15. Cependant, la plupart des études publiées sur les fibroblastes cutanés humains ont été réalisées à l’aide de populations mixtes de fibroblastes isolées de cultures explantes issues de peaux dermatalisées, puisque des marqueurs de surface cellulaire spécifiques permettent l’isolement des ou des sous-populations de fibroblastes réticulaires, par analogie avec le derme de la souris, n’étaient pas encore établies.

Nous avons récemment démontré que les fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine sont caractérisés par des marqueurs de surface cellulaires spécifiques qui permettent l’isolement des sous-populations respectives via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)16: FAP + Les fibroblastes CD90 représentent des fibroblastes papillaires situés principalement dans le derme supérieur, présentant des taux de prolifération plus élevés, une signature génique distincte mais aucun potentiel adipogénique. Les fibroblastes FAP+CD90+ et FAP-CD90+ appartiennent à la lignée réticulaire des compartiments inférieurs dermiques, qui sont moins PROLIFÉRATIFS, mais qui subissent facilement une adipogenèse, une marque distinctive pour les fibroblastes réticulaires. Cette méthode permet d’étudier en profondeur ces sous-populations distinctes de fibroblastes non seulement en ce qui concerne leurs fonctions spécifiques dans des conditions physiologiques, mais aussi dans le contexte de la pathogenèse des maladies cutanées, y compris le cancer de la peau.

Cependant, étant donné que les fibroblastes modifient leur expression de marqueur de surface cellulaire dans la culture in vitro à deux dimensions16,17,19, l’application de notre protocole se limite à l’isolement des fibroblastes primaires de l’humain derme et ne permet pas l’identification des fibroblastes papillaires ou réticulaires dans les populations de cultures cellulaires mixtes. Fait important, bien que l’expression des marqueurs de surface des cellules change in vitro, nous avons démontré que les sous-ensembles de fibroblastes isolés selon le protocole décrit ci-dessous conservent leur fonctionnalité spécifique lorsqu’ils sont cultivés16, ce qui permet études in vitro de propriétés spécifiques à un sous-ensemble dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

En conclusion, nous avons développé un protocole pour l’isolement des sous-ensembles de fibroblastes distincts via FACS qui permet pour la première fois l’isolement des populations pures de fibroblastes du derme cutané humain dans un État naïf.

Protocol

La peau humaine a été obtenue des hommes et des femmes Caucasiens âgés de 26 à 61 ans (peau protégée par le soleil; corrections abdominales, réductions mammaires). Le consentement informé par écrit du patient a été obtenu avant la collecte des tissus conformément à la déclaration d’Helsinki, et avec l’approbation de la Commission de révision institutionnelle de l’Université médicale de Vienne.

Remarque: Nous fournissons un protocole pour l’isolement des sous-populations de fibroblastes fonctionnellement distinctes soit du derme de pleine épaisseur (référez-vous à la section 1) ou après avoir sectionné le derme cutané humain dans ses différentes couches (sautez la section 1 et référez-vous directement à la section 2) .

1. préparation de la pleine épaisseur du derme

  1. Placez un morceau de peau humaine de 10 cm x 10 cm (par exemple, des corrections abdominales ou des réductions mammaires) avec l’épiderme orienté vers le bas sur du papier filtrant épais.
  2. Tenez l’épiderme fermement sur ses bords avec des pinces et grattez la couche de graisse sous-cutanée avec un scalpel. Coupez ensuite le tissu en lanières de 5 mm de large avant de les mettre dans une boîte de Petri.
    Remarque: Cela facilite la pénétration de la Dispase II (appelée enzyme dissociante dorénavant, voir rubrique 3) et est utilisée si l’épiderme doit être séparé de tout le derme. Pour ce Skip section 2 et référez-vous directement à la section 3. Pour éviter toute contamination, conservez le tissu stérile après l’enlèvement chirurgical ou nettoyez-le soigneusement avec de l’éthanol ou une solution d’iode. Si le traitement à l’éthanol de la surface de la peau ne provoque que des décès cellulaires mineurs. Travailler dans des conditions stériles dans une hotte de flux de culture tissulaire.

2. sectionnement du derme cutané humain en couches papillaires et réticulaires avec un dermatome

  1. Placez un morceau de peau de 10 cm x 10 cm (par exemple, des corrections abdominales ou des réductions mammaires) sur du papier filtrant épais, avec l’épiderme orienté vers le haut. Tenez fermement la peau sur ses bords avec des pinces.
  2. Trancher la peau avec un dermatome électrique, ajusté à une épaisseur de coupe/profondeur de 300 μm, en glissant la tête du dermatome loin de soi, avec la lame étant à un angle de 90 ° par rapport à la surface de la peau.
  3. Prendre la première couche composée d’épiderme et de derme papillaire (300 μm d’épaisseur, «couche cutanée 1», figure 1 et figure 2) et la mettre dans une boîte de Petri. Procéder immédiatement à la section 3 ou ajouter 1x PBS pour empêcher le tissu de sécher.
    Remarque: Pour éviter toute contamination, conservez le tissu stérile après l’enlèvement chirurgical ou nettoyez-le soigneusement avec de l’éthanol ou une solution d’iode. Travailler dans des conditions stériles dans une hotte de flux de culture tissulaire.
    Attention: Manipulez le dermatome avec précaution puisque les lames sont très pointues.
  4. Répéter l’étape 2,2 en ajustant le dermatome à une épaisseur de coupe de 700 μm et trancher le derme restant. Placer la tranche supérieure qui est définie comme le derme réticulaire supérieur («couche cutanée 2», figure 2) dans une boîte de Petri distincte. Procéder immédiatement à la section 4 ou ajouter 1x PBS pour empêcher le tissu de sécher.
  5. Grattez la couche de graisse sous-cutanée avec un scalpel de la couche dermique réticulaire inférieure résiduelle (> 1000 μM) et jetez-la. Prélever le derme réticulaire inférieur («couche cutanée 3», figure 2) dans une autre boîte de Petri. Procéder immédiatement à la section 4 ou ajouter 1x PBS pour empêcher le tissu de sécher.
    Remarque: Alternativement, au lieu de racrer la graisse avec un scalpel, enlever la couche de graisse avec des ciseaux. Il peut aider à mettre le derme réticulaire sur la glace avant de racrer la graisse loin.

3. séparation de l’épiderme et du derme

  1. Préparer une solution enzymatique dissociante de 3 U/mL (c.-à-d., Dispase II) dans un PBS 1x stérile. Placer les bandes de 5 mm (à partir de la section 1), ou l’épiderme/derme papillaire (à partir de l’étape 2,2), avec l’épiderme orienté vers le haut dans une boîte de Petri de 10 cm avec 10 mL de solution enzymatique dissociante de 3 U/mL. Incuber la boîte de Petri à 37 ° c pendant 1 h.
    1. Le protocole peut être suspendu ici. Incuber l’épiderme/le derme papillaire dans la protéase au réfrigérateur à 4 ° c au lieu de la nuit. Au besoin, rangez les autres couches (couche 1, 2 et 3) pendant la nuit, immergées dans 1x PBS dans des tubes de 50 mL à 4 ° c.
      Attention: Travailler avec précaution avec la protéase, il peut irriter la peau et les yeux lors du contact.
  2. Après incubation, transférer l’épiderme/le derme papillaire au couvercle sec de la boîte de Petri et séparer l’épiderme du derme supérieur (couche cutanée 1) avec deux forceps chacun tenant le bord de l’épiderme ou du derme.

4. digestion enzymatique du tissu cutané

  1. Hacher chaque couche cutanée (cutanée 1, 2 et 3) séparément avec des ciseaux/scalpel aussi minutieusement que possible; plus les morceaux sont petits, mieux la digestion tissulaire.
    Remarque: La ténacité du derme peut varier en fonction de la partie du corps dont elle provient (par exemple, la peau abdominale ou supérieure du bras).
  2. Préparer le mélange de digestion en combinant 1,25 mg/ml de collagénase I, 0,5 mg/ml de collagénase II, 0,5 mg/ml de collagénase IV et 0,1 mg/ml de hyaluronidase dans le milieu de l’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec de la L-glutamine (voir tableau des matériaux) FCS) et 1% de pénicilline/streptomycine (P/S).
    Attention: Travailler avec précaution avec les collagénases car celles-ci peuvent irriter la peau et les yeux au contact.
  3. Mettre chacun des tissus hachés avec 10 mL du mélange de digestion préparé dans un tube de 50 mL et incuber dans un bain d’eau tiède à 37 ° c pendant 1 h sous agitation permanente. Pendant la digestion, inversez les tubes plusieurs fois.
    Remarque: Il faut envisager d’ajuster le volume de digestion en fonction de la taille de la pièce de peau hachée. Ne pas surcharger 10 mL de mélange de digestion avec trop de tissu sinon le rendement de la cellule sera minime. Moins d’un tiers des tissus dans le volume total est recommandé (1:2 w/v).

5. préparation de la suspension à cellule unique et de la lyse érythrocytaire

  1. Arrêter la digestion des tissus enzymatiques en ajoutant 10 mL de fibroblastes (DMEM avec L-glutamine, 10% FCS et 1% P/S) dans le tissu digéré. Travailler sur la glace à partir d’ici.
  2. Versez le contenu de chaque tube à travers une passoire à thé stérile ordinaire et collectez la suspension cellulaire dans une boîte de Petri propre. Lavez la passoire à l’aide de morceaux de tissu non digérés avec le bord d’une seringue-piston.
  3. Ensuite, la pipette a recueilli la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 70 μm dans un tube de 50 mL. Rincez le tamis à cellules avec du fluide et collectez le flux dans le même tube.
  4. Centrifuger les tubes à 500 x g à 4 ° c pendant 10 min. enlever et jeter le surnageant et le pellet de cellule de lavage avec le milieu de fibroblastes de 5 ml. Répétez l’étape de centrifugation.
  5. Retirez et jetez le surnageant et Resuspendez le culot dans 1 mL de tampon de lyse d’érythrocytes ACK (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Laisser les cellules dans le tampon de lyse pendant environ 1 min à température ambiante (20 \ u201222 ° c).
  6. Arrêter la lyse en ajoutant 9 mL de 1x PBS avec 10% de FCS et centrifuger les tubes à nouveau à 500 x g à 4 ° c pendant 5 min. jeter le surnageant.
    Attention: Le temps d’incubation dans la lyse érythrocytaire peut être ajusté si la lyse semble incomplète (granule rouge). Cependant, ne laissez pas les cellules dans le tampon de lyse érythrocytaire pendant trop longtemps pour éviter la lyse des fibroblastes et des cellules immunitaires.

6. blocage et coloration des fibroblastes pour FACS

  1. Préparer 5 μL de solution de blocage du récepteur FC dans 100 μL de 1x PBS avec 10% de FCS et Resuspendre les cellules dans 100 μL de bloqueur FC humain. Incuber sur la glace pendant 10 min.
  2. Concevez un panneau de coloration FACS pour tacher les fibroblastes CUTANES humains. Mélange anti-humain FAP APC (1:20), anti-humain CD90 AF700 (1:30), anti-humain E-cadherin PE (1:20), anti-humain CD31 FITC (1:30), anti-humain CD45 bleu Pacifique (1:20), anti-humain ITGA6 PE (1:20), anti-humain CD235ab bleu Pacifique (1:1000) et anti-humain CD106 Pacifique bleu (1:100) en 1x PBS avec 10% FCS.
  3. Après le blocage du récepteur FC, les cellules de spin vers le bas à 500 x g à 4 ° c pendant 3 min. enlever et jeter le surnageant et Resuspendre les cellules dans 100 μl de mélange d’anticorps. Incuber les cellules dans l’obscurité à 4 ° c pendant 20 min.
    1. Avant la coloration, prélever 20 μL d’un échantillon avec un nombre élevé de cellules pour les contrôles FACS non tachés et à tache unique.
  4. Laver les cellules colorées et les contrôles FACS deux fois avec 500 μL 1x PBS avec 10% FCS et centrifuger à 500 x g à 4 ° c pendant 3 min. Dans l’intervalle, ajouter 4 ′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 1x PBS avec 10% FCS pour effectuer une concentration finale de 1 μg/mL.
  5. Retirer et jeter le surnageant, Resuspendre les cellules dans 200 μL de solution DAPI et filtrer chaque suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 70 μm dans un tube FACS de 5 mL.
    Remarque: Si FACS va être exécuté avec retard, ajouter DAPI et filtrer peu de temps avant l’enregistrement.

7. stratégie de gating pour l’isolement de sous-ensemble de fibroblastes humains et FACS

  1. Enregistrer les contrôles de cytométrie de flux, régler les paramètres de tension corrects et effectuer la compensation appropriée. Barrière pour cellules individuelles et cellules négatives vivantes (DAPI-), bleues du Pacifique, PE et FITC (CD45-, CD31-,CD235ab-, CD106-, ITGA6- et E-cadhérine-) pour obtenir trois populations de fibroblastes: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ et FAP-CD90+ cellules. Voir la figure 3.
  2. Trier trois sous-populations de fibroblastes dans des tubes à microcentrifugation à bouchon à vis de 1,5 mL, remplis soit de 350 μL de tampon de lyse pour l’isolement de l’ARN, soit remplis de 350 μL de milieu de croissance des fibroblastes (voir le tableau des matériaux) pour la culture cellulaire. Inverser les tubes immédiatement après le tri et soit mettre les tubes de la lyse tampon dans l’azote liquide pour casser la congélation ou mettre des tubes moyens sur la glace.
    Attention: Préparer le tampon de lyse avec 0,1% de b-mercaptoéthanol dans la hotte et éviter l’inhalation.

8. culturing des fibroblastes et dosage de l’adipogenèse

  1. Après FACS, les cellules de spin vers le bas à 500 x g pendant 3 min à 4 ° c et les nombres de cellules égales de plaque (5000 \ u201210 000 cellules/puits) dans le milieu de croissance de fibroblastes (voir le tableau des matériaux) dans les plats de culture de cellules de 48 puits. Laisser croître les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70% de confluences.
  2. Ajouter 5 μg/mL d’insuline, 5 μM de troglitazone, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 1 μM de dexamétasone à un milieu de croissance de fibroblastes pour préparer le milieu de différenciation des adipocytes.
  3. Remplacer le milieu des cellules cultivées par un milieu de différenciation adipocytes et laisser les cellules se différencier pendant 14 jours. Échangez le milieu après le deuxième jour avec un milieu adipogéné réduit contenant 5 μg/mL d’insuline et 5 μM de troglitazone. Réapprovisionner le milieu tous les 3 ou 4e jours.
  4. Fixer les cellules avec 4% PFA pendant 20 min à température ambiante (20 \ u201222 ° c) au jour de différenciation 14. Lavez les puits avec 60% d’isopropanol et laissez-le s’évaporer complètement. Détachez les cellules avec 5 mM d’huile rouge O (filtre avant utilisation) pendant 20 min. laver les cellules colorées quatre fois avec de l’eau distillée. Procéder à l’exécution de la microscopie.
    Attention: L’PFA est toxique et nocif. Manipulez prudemment.
    Remarque: Le protocole peut être suspendu ici. Les cellules fixes peuvent être stockées dans 1x PBS à 4 ° c jusqu’à ce que l’huile rouge O coloration soit effectuée. Couvrir le plat avec du film de paraffine avant le stockage pour éviter l’évaporation.
  5. Cellules d’image immergées dans l’eau avec un microscope inversé à grossissement 10x avec lumière transmise.

Representative Results

Une vue d’ensemble des principales étapes de traitement des tissus cutanés pour obtenir une suspension à une seule cellule est illustrée à la figure 1, montrant la dermatation de la peau (figure 1a), différentes couches dermiques (figure 1b), l’enlèvement de la graisse sous-cutanée couche (figure 1c) et la séparation de l’épiderme et du derme papillaire (figure 1d), ainsi que les différentes étapes de la dissociation du tissu manuel et enzymatique (figure 1e, F). Un schéma des trois couches cutanées est fourni dans la figure 2.

La figure 3 affiche la stratégie de blocage d’un panneau de coloration de cytométrie de flux pour l’analyse de différents sous-ensembles de fibroblastes de la peau humaine. Des marqueurs de surface de cellules supplémentaires qui ne sont pas exprimés sur les fibroblastes permettent l’exclusion de diverses autres cellules présentes dans la peau telles que les cellules immunitaires, les cellules épidermiques, les cellules souches mécachymateuses (MSCs), les globules rouges ou les cellules endothéliales pour atteindre la pureté maximale dans les populations isolées. Il n’est pas essentiel d’utiliser le panneau FACS identique utilisé dans la figure 2 pour l’identification de ces sous-populations de fibroblastes, mais c’est notre recommandation. On peut utiliser des anticorps étiquetés avec différents colorants fluorescents ou altérer la combinaison de marqueurs d’exclusion.

Il est à noter que ce protocole permet l’identification de trois populations de fibroblastes dans la peau humaine qui présentent une localisation intradermique différente, des profils d’expression génique et aussi des fonctions (figure 4). FAP+CD90- sont enrichis dans le derme papillaire tandis que FAP+CD90+ et FAP-CD90+ sont plus abondants dans le derme réticulaire (figure 4a). Les trois sous-populations présentent la morphologie typique des fibroblastes lors du tri dans la culture cellulaire (figure 4b). Fait intéressant, ils diffèrent en ce qui concerne leur capacité à se différencier en adipocytes qui est un poinçon pour les fibroblastes réticulaires. Combinant ces résultats avec le profilage d’expression génique via la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-PCR)16 (figure 4C), montrant que les cellules FAP+CD90 expriment des niveaux élevés de marqueurs communément attribués à les fibroblastes papillaires tels que le CD26, le NTN et le PPPN tandis que les cellules CD90+ expriment les marqueurs réticulaires connus tels que CD36, ACTA2 et PPARγ à des niveaux élevés , nous CONCLUONS que les cellules FAP+CD90 appartiennent au papillaire et au CD90+ appartiennent à la lignée réticulaire.

Figure 1
Figure 1: isolement de la suspension cutanée à une seule cellule de la peau humaine intacte. (A) lapeau est tranchée avec un dermatome électrique dans le derme papillaire et réticulaire. (B) le derme papillaire avec l’épiderme adjacent est 300 μm d’épaisseur (en haut) tandis que le derme réticulaire supérieur est 700 μM d’épaisseur (en bas). (C) la couche adipeuse sous-cutanée est racée du derme réticulaire inférieur avec un scalpel. (D) après incubation du derme papillaire dans une solution enzymatique de dissociation à 37 ° c pendant 1 h, l’épiderme peut facilement être enlevé à l’aide de forceps. (E) les différentes couches dermiques sont hachées avec des ciseaux et transférées dans un mélange enzymatique de digestion composé de collagénase I, II et IV et de hyaluronidase. (F) après 1 h de dissociation à 37 ° c, la digestion tissulaire est arrêtée et la suspension est versée à travers une passoire à thé pour enlever les morceaux de peau non digéré. (G) la suspension cellulaire est filtrée une fois de plus par un tamis à cellules de 70 μm et centrifugée à 500 x G à 4 ° c pendant 10 min. (H) après centrifugation, le culot de la cellule est lavé avec 1x PBS avec 10% FCS et est prêt pour la coloration des FACS. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: sectionnement du derme cutané humain en couches papillaires et réticulaires avec un dermatome. Schéma montrant les trois couches cutanées obtenues en coupant la peau pleine épaisseur dans le derme papillaire (y compris l’épiderme; 0 \ u2012300 μm; la couche cutanée 1), le réticulaire supérieur (300 \ u20121, 000 μm; la couche cutanée 2) et le derme réticulaire inférieur (> 1000 μm; couche cutanée 3) avec un dermatome. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: stratégie de blocage du FACS pour les sous-populations de fibroblastes cutanés humains. (A\u2012e) Premièrement, les cellules sont bloquées sur des cellules (B) et viables (DAPI-) simples (C). Les cellules immunitaires (CD45+), les cellules souches méenchymateuses (CD106+), les globules rouges (CD235ab+) sont exclues (C) et les cellules négatives bleues du Pacifique sont plus loin sur l’E-cadhérine (ECAD) et ITGA6 les cellules doubles négatives (canal PE, D ). E-cadhérine et ITGA6 sont des marqueurs exprimés sur les cellules épidermiques. Ensuite, les cellules positives de CD31-FITC (cellules endothéliales et lymphatiques) sont exclues (D) entraînant trois populations de fibroblastes exprimant l’un ou l’autre des deux marqueurs de fibroblastes de surface de cellules FAP et CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ et FAP-CD90+ (E). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: les fibroblastes FAP+CD90-, FAP+CD90+ et FAP-CD90+ diffèrent en termes de localisation cutanée, d’expression génique et de fonctionnalité. A) les diagrammes FACS représentatifs des fibroblastes contrôlés isolés du derme papillaire, réticulaire supérieur et réticulaire inférieur. La stratégie de gating est expliquée dans la figure 3. FAP+CD90- fibroblastes sont enrichis dans le derme papillaire (19,2%) par rapport au derme réticulaire inférieur (0,83%). Les cellules FAP+CD90+ peuvent être trouvées dans tout le derme, mais leur plus grande abondance est dans le derme réticulaire supérieur (40,7%). FAP-CD90+ sont enrichis dans le derme réticulaire inférieur (64,4%). (B) de note, les trois sous-populations triées présentent une morphologie typique des fibroblastes sur la culture pendant 7 jours (à gauche). Fait intéressant, ils se comportent différemment dans un dosage de l’adipogenèse. Après 14 jours de culture, FAP+CD90- ne se différencient pas en adipocytes tandis que FAP+CD90+ et FAP-CD90+ subissent facilement l’adipogenèse (droite; L’huile rouge O tache les cellules lipidiques rouges). Barres d’échelle = 1 000 μm. (C) trié directement FAP+CD90- fibroblastes expriment les marqueurs de fibroblastes papillaires CD26, NTN1 et PPPN, tandis que les cellules FAP-CD90+ Express CD36, ACTA2 et PPARγ, connues pour être exprimés par la lignée réticulaire. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 par rapport aux cellules FAP+/Cd90; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 par rapport aux cellules FAP-/CD90+ . S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. CD90 a été largement utilisé pour l’identification ou l’isolement des fibroblastes dermiques18,20,21. Cependant, nous avons démontré qu’outre les fibroblastes CD90 +, le derme humain héberge également une population de CD90- fibroblastes exprimant la FAP16, qui a été établie comme marqueur pour les fibroblastes activés et les fibroblastes associés au cancer ( CAFS)22,23,24,25. Il est important de noter que nous avons pu identifier trois sous-populations de fibroblastes FAP+CD90-, FAP+CD90+ et FAP-CD90+ dans les biopsies cutanées de tous les donneurs humains sains. Nous concluons donc que le FAP n’est pas seulement un marqueur des fibroblastes activés ou des CAFs, mais aussi des fibroblastes tissulaires normaux.

Il est à noter que la population de la FAP-CD90- Cell restante après application de la stratégie d’exclusion et de blocage décrite ci-dessus ne contient pas de fibroblastes, puisque ces cellules ne proliférent pas dans le milieu de culture de fibroblastes in vitro, mais la plupart probablement une population de cellules mixtes, y compris des cellules lymphatiques et des périoctets, entre autres16.

Le rendement de la cellule obtenu par l’utilisation du protocole décrit ci-dessus peut varier en fonction du corps-partie que la pièce de peau utilisée pour l’isolement provient. DermIS de différentes parties du corps diffère en ce qui concerne sa structure, l’épaisseur ainsi que la composition de collagène. Par exemple, la peau du visage ou le bras supérieur est beaucoup plus mince que la peau du ventre ou de la cuisse, qui affichent également fréquemment une couche de graisse sous-cutanée plus épaisse. En outre, l’âge et le sexe des donneurs de la peau peuvent non seulement influer sur l’efficacité de la dissociation tissulaire, mais peuvent également affecter la distribution des trois sous-populations de fibroblastes (figure 3) lorsqu’elles sont isolées de la peau pleine épaisseur. Cela résulte du fait que le derme papillaire rétrécit et que les nombres de fibroblastes totaux diminuent avec l’âge11,26,27,28. En outre, le culot cellulaire du derme papillaire sera probablement plus grand que du derme réticulaire, puisque le derme supérieur est plus densément peuplé par les fibroblastes que le derme réticulaire. En outre, le derme inférieur est également plus dur et plus dense avec du collagène, ce qui rend plus difficile de dissocier le tissu et de libérer les fibroblastes. De note, le culot de la cellule peut apparaître très rouge, ce qui explique pourquoi la lyse des globules rouges est recommandée.

En plus de l’identification de trois sous-populations dans la peau humaine intacte, nous montrons également que dans la peau dermatomed, chaque sous-ensemble de fibroblastes est enrichi soit dans le derme papillaire ou réticulaire16. Le tranchage précis de la peau avec le dermatome est essentiel pour obtenir un enrichissement adéquat de chaque sous-population de différentes couches cutanées. Étant donné que le derme papillaire est très mince, la tranche dermatée qui la représente ne doit pas dépasser une épaisseur de 300 μm. les fibroblastes réticulaires et inférieurs réticulaires supérieurs représentent la lignée réticulaire et présentent des fonctions et des signatures génétiques similaires, par conséquent, on pourrait aussi envisager de ne pas les séparer.

Il est important de noter que les trois populations de fibroblastes se retrouvent dans tout le derme et qu’elles ne sont pas exclusivement présentes dans une seule couche, ce qui explique pourquoi les cultures explantes du derme papillaire ou réticulaire entraînent des cultures mixtes de fibroblastes. Cependant, les fibroblastes FAP+CD90- papillaires sont les plus abondants dans le derme papillaire et suivent un gradient des couches superficielles à inférieures de la peau tandis que les fibroblastes FAP+CD90+ et FAP-CD90+ suivent une gradient inverse du bas vers les couches superficielles16. En outre, la majorité des fibroblastes CD90+ du derme papillaire se trouvent presque exclusivement dans les vaisseaux sanguins environnants et expriment le marqueur de fibroblastes périvasculaires CD14629, et présentent donc probablement des fonctions différentes de celles de la fibroblastes CD146- réticulaires restants16. CD146 pourrait être utilisé comme marqueur supplémentaire dans la stratégie de blocage pour exclure cette population.

Après la dissociation des couches cutanées, les cellules isolées sont colorées avec un cocktail d’anticorps spécialement conçu contenant divers anticorps pour l’exclusion des cellules immunitaires, des cellules endothéliales et lymphatiques, des cellules épidermiques, des érythrocytes et des MSCs pour d’obtenir des populations de fibroblastes pures. De noter, le choix d’un marqueur pour l’identification et l’exclusion des MSCS peut être délicat en raison du nombre élevé de marqueurs MSC publiés30,31. Comme les MSCs expriment CD90 comme les fibroblastes, des marqueurs MSC supplémentaires tels que CD105 ou CD271 pourraient s’avérer utiles pour leur identification. Cependant, les MSCs ne représentent qu’un très faible pourcentage de toutes les cellules dermiques et puisque les fibroblastes CD90+ présentent des caractéristiques morphologiques typiques des fibroblastes lors du tri, on pourrait argumenter que l’exclusion des MSCS par l’utilisation de marqueurs de surface cellulaires distincts pourrait être inutiles.

Fait important, nous avons analysé l’expression génique FAP et CD90 après avoir gardé les cellules en culture pendant 7-14 jours après le tri (données non affichées) et constaté que l’expression des deux marqueurs est uprégulée dans le seul positif trié respectif (FAP+CD90- ou FAP-CD90+) cellules16. Nous soulignons donc que les ensembles de marqueurs et le protocole décrits ci-dessus permettent l’isolement des sous-ensembles primaires de fibroblastes directement à partir du tissu, mais pas des populations de fibroblastes mixtes préalablement cultivées.

Néanmoins, nous démontrons que la fonctionnalité des trois sous-populations est conservée dans la culture cellulaire, indépendamment de l’altération de l’expression des marqueurs de surface cellulaire, puisque les fibroblastes triés comme des fibroblastes FAP+CD90- papillaires ne acquérir la capacité de subir l’adipogenèse après une plus longue période de culture, tandis que les fibroblastes triés comme FAP+CD90+ ou FAP-CD90+ fibroblastes réticulaires maintiennent leur capacité à se différencier en adipocytes 16 . Il est important de noter que les gènes papillaires et réticulaires sont encore plus largement exprimés dans les FAP+CD90 et CD90 + respectivement.

En conclusion, nous avons établi un protocole pour l’isolement des sous-ensembles de fibroblastes fonctionnellement distincts via FACS qui permet pour la première fois l’isolement et l’analyse des sous-populations pures et naïves de fibroblastes du derme cutané humain. Cette méthode établit une avancée majeure pour le protocole d’isolement de culture d’explant de fibroblastes couramment utilisé du derme supérieur et inférieur comme (i) un gradient antagoniste des fibroblastes papillaires et réticulaires existe de la surface de peau à l’hypoderme et (II) fibroblastes modifient leur signature génique in vitro.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons avec gratitude l’assistance au tri FACS par Bärbel Reininger et Wolfgang Bauer. Ce travail a été appuyé par des subventions à B. M. L. du fonds autrichien pour la science (FWF: V 525-B28), et la Fédération des sociétés biochimiques européennes (FEBS, fonds de recherche de suivi). S. F. est récipiendaire d’une bourse du DOC de l’Académie autrichienne des sciences (OeAW). Nous reconnaissons avec gratitude l’excellent soutien des installations de base de l’Université médicale de Vienne. Nous remercions Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke et Martin Vierhapper pour la fourniture de matériel de peau humaine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2x Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
  2. Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
  3. Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
  4. LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
  5. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  6. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  7. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
  8. Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  9. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  10. Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
  11. Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
  12. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
  13. Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
  14. Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
  15. Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
  16. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
  17. Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
  18. Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  19. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  20. Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
  21. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
  22. Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
  23. Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
  24. Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
  25. Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
  26. Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
  27. Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
  28. Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
  29. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  30. Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
  31. Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).

Tags

Génétique numéro 147 FACS marqueurs de surface cellulaire hétérogénéité des fibroblastes lignées de fibroblastes peau humaine fibroblastes papillaires et réticulaires
Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korosec, A., Frech, S.,… More

Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter