Summary
이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.
Abstract
섬유 아 세포는 많은 인간 질병의 발병 기 전에 연루 된 고도로 이종 세포 집단 이다. 인간의 피부 진 피에서, 섬유 아 세포는 전통적으로 그들의 조직학 지역화에 따라 피상적 또는 낮은 망상 진 피에 기인 했다. 마우스 진 피에서, 유 두 및 망상 섬유 아 세포는 생리 적 및 병리학 적 과정과 구별 될 수 있는 별개의 세포 표면 마커 발현 프로필에 대 한 분기 기능을 가진 2 개의 서로 다른 선 시대에서 시작 됩니다.
중요 하 게는, 피상적이 고 하 부 진 피 층에서의 익 지 않은 배양 으로부터의 증거는 적어도 2 개의 기능적으로 별개의 피부 섬유 아 세포가 인간적 인 피부병에 또한 존재 한다는 것을 건의 합니다. 그러나, 마우스 피부와 달리, 상이한 섬유 아 세포 서브 세트의 차별을 가능 하 게 하는 세포 표면 마커는 아직 인간의 피부를 위해 확립 되지 않았다. 우리는 2 개의 세포 표면 마커 섬유 아 세포 활성화 단백질 (FAP) 및 티 모 세포 항 원 (Thy1)/CD90. 사용 하 여 형광 활성 세포 선별 (FACS)을 통해 인간 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리를 위한 신규 한 프로토콜을 개발 하였다. 이 방법은 체 외 조작 없이 순수한 섬유 아 세포 서브 세트의 단 리를 가능 하 게 하 여, 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 나타나 조직 항상성 또는 질병에 관한 인간 피부 섬유 아 세포 서브 세트의 정확한 기능적 분석을 허용 병리학.
Introduction
결합 조직의 주요 세포 성분으로 서, 섬유 아 세포는 궁극적으로 세포 외 기질1을 형성 하는 콜라겐 및 탄성 섬유의 침착에 대 한 책임이 있으며, 따라서, 조직 항상성, 재생 및 질병은 오랜 시간 동안 과소 평가 되었습니다. 그러나 섬유 아 세포는 최근 연구자 들의 주목을 받고 있으며,이는 유도 만능 줄기 세포에 대 한 두드러진 세포 공급원을 나타내기 때문에2 뿐만 아니라 그들의 병 인에서 높은가 소성 및 의미 또한 있기 때문에 장기 섬유 증3,4,5 또는 암6등의 다양 한 질환.
인간 피부는 다층 상피, 표 피 및 그것의 기저 결합 조직으로 구성 되며,이는 조직 학적으로 상부 유 두 및 하 부 망상 진 피로 세분 될 수 있고 주로 섬유 아 세포로 구성 되 고 세포 외 기질8 및 피하 진 피. 조직 내에서 그들의 위치에 따라, 진 피 섬유 아 세포는 대략 유 두 및 망상 섬유 아 세포로 분류 되었다1.
중요 하 게는, 최근의 데이터는 이러한 진 피 섬유 아 하위 집단이 조직 학적으로 구별 될 뿐만 아니라, 그의 기능이 상당히 다양 하다는 것을 나타낸다. 마우스 피부에서, 유 두와 망상 섬유 아 세포는 배아 발생 시에 2 개의 별개의 선로에서 일어나9. 여러 줄의 증거가 제시 된 두 개의 선은 조직 항상성, 모 낭 형성, 상처 복구 및 섬유 증7,9,10에 뿐만 아니라 다른 역할을 발휘 하지만 그들은 또한 다른에 응답 신생 플라스틱 표 피 줄기 세포의 신호11, 암 병 인에서 분기 역할을 제안. 편리 하 게도, 두 계보는 성인 마우스 피부에 상호 배타적 인 세포 마커의 뚜렷한 집합을 표현 하 여 순수 피부 섬유 아 세포 집단의 분리를 가능 하 게 하 고 시험관 내 특정 기능에 대 한 연속적인 광범위 한 분석을 가능케 합니다.9 , 11.
상응 하 여, 별개의 형태학 및 기능을 갖는 2 개 이상의 별개의 섬유 아 세포 서브 세트, 증식 율, 조직 리 모델링 능력12,13뿐만 아니라 성장을 지 원하는 능력 표 피 줄기 세포는 시험관 내에서, 인간의 피부 진 피14,15에 대해 기술 되었다. 그러나, 인간 진 피 섬유 아 세포에 관한 대부분의 출판 된 연구는 dermatomed 피부 로부터 익 형 배양 으로부터 분리 된 혼합 섬유 아 세포 집단을 사용 하 여 진행 되었으며, 특정 세포 표면 마커 세트는 순수한 인간 유 두의 분리를 가능 하 게 하기 때문에 또는 마우스 진 피에 비유 된 망상 섬유 아 세포 수는 아직 확립 되지 않았다.
우리는 최근에 입증, 인간의 피부 유 두 및 망상 섬유 아 세포는 형광 활성 세포 선별 (FACS)를 통해 각 하위 집단의 분리를 가능 하 게 하는 특정 세포 표면 마커를 특징으로 한다: FAP + CD90- 섬유 아 세포는 상부 진 피에 주로 위치 하는 유 두 섬유 모 세포를 나타내며, 더 높은 증식 율, 뚜렷한 유전자 시그너처를 제시 하지만 지질 성 가능성은 없습니다. FAP+CD90+ 및 fap-CD90+ 섬유 아 세포는 덜 증식 하는 낮은 진 피 구획의 망상 혈통에 속하며 쉽게 지질을 겪는 다-망상 섬유 모 세포에 대 한 특징. 이 방법은 생리 적 조건 하에서 그들의 특정 기능에 관해서는 뿐만 아니라 피부 암을 포함 하는 피부병의 발병의 맥락 에서도 이러한 뚜렷한 섬유 아 세포 집단을 광범위 하 게 연구할 수 있게 한다.
그러나, 섬유 아 세포는 그들의 세포 표면 마커 발현을 시험관 내 배양16,17,19에서 변화 시키기 때문에, 우리의 프로토콜의 적용은 인간 으로부터 일차 섬유 아 세포의 단 리로 제한 된다 진 피 및 혼합 세포 배양 집단에서 유 두 또는 망상 섬유 아 세포의 동정을 허용 하지 않는다. 중요 하 게는, 세포 표면 마커의 발현이 시험관 내에서 변화 되더라도, 우리는이 하에서 설명 된 프로토콜에 따라 분리 된 섬유 아 세포 서브 세트가16일 때 그들의 특정 한 기능성을 유지 한다는 것을 입증 하 고, 따라서 가능 하 게 생리 적 또는 병리학 적 조건 하에 하위 집합 특정 속성의 시험관 연구.
결론적으로 우리는 처음으로 순수한 섬유 아 세포 집단을 인간 피부 진 피 로부터의 단 리를 허용 하는 FACS을 통해 별개의 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 위한 프로토콜을 개발 했습니다.
Protocol
인간의 피부는 26 ~ 61 세의 백인 남성과 여성에서 수 득 되었다 (햇볕에 보호 된 피부; 복 부 교정, 유 방 감소). 작성 된 정보에 입각 한 환자 동의는 헬싱키 선언에 따라 조직 수집 전에 얻어 졌으 며, 빈의과 대학 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 우리는 전체 두께 진 피에서 기능적으로 뚜렷한 섬유 아 세포 집단을 분리 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다 (섹션 1 참조) 또는 인간의 피부 진 피를 다른 층으로 절편 한 후 (섹션 1을 건너 뛰고 2 절을 직접 참조 하십시오) .
1. 전체 두께의 진 피 제조
- 표 피를 두꺼운 여과 지에서 아래쪽으로 향하게 하 여 10cm x 10cm 인간의 피부 부분 (예: 복 부 교정 또는 유 방 감소)을 배치 하십시오.
- 집게와 가장자리에 단단히 표 피를 잡고 메스와 피하 지방 층을 긁어. 그런 다음 페 트리 접시에 넣어 전에 5mm 폭 스트립으로 조직을 슬라이스.
참고: 이것은 디 카 제 II (이제 부터는 해리 효소 라고 함)의 침투를 용이 하 게 하 고, 표 피를 전체 진 피 로부터 분리 시켜야 하는 경우에 사용 된다. 이를 위해 섹션 2를 건너뛰고 섹션 3을 직접 참조 하십시오. 오염을 방지 하기 위해, 외과 적 제거 후에 조직을 멸 균 상태로 유지 하거나 에탄올 또는 요오드 용액으로 철저히 청소 하십시오. 전혀, 피부 표면의 에탄올 처리는 경미한 세포 사 멸을 야기 한다. 조직 배양 흐름 후드에서 무 균 상태에서 작업.
2. 인간의 피부 진 피를 피부 분절와 망상 층으로 절편
- 표 피를 위쪽으로 향하게 하 여 두꺼운 여과 지에서 10 cm x 10cm의 피부 조각 (예: 복 부 교정 또는 유 방 감소)을 놓습니다. 집게와 가장자리에 단단히 피부를 잡아.
- 칼 날이 피부 표면과 관련 하 여 90 ° 각도로 피부 분절, 피부 분절의 머리를 자신 으로부터 멀리 슬라이딩 하 여 절단 두께/깊이 300 µm으로 조정 된 전기으로 피부를 슬라이스 하십시오.
- 표 피 및 유 두 진 피 (300 µm 두께, ' 진 피 층 1 ', 도 1 및 도 2)로 구성 된 제 1 층을 취하고 페 트리 디쉬에 넣는다. 섹션 3으로 즉시 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오.
참고: 오염을 방지 하기 위해, 외과 적 제거 후 티슈를 멸 균 상태로 유지 하거나 에탄올 또는 요오드 용액으로 철저히 청소 하십시오. 조직 배양 흐름 후드에서 무 균 상태에서 작업.
주의: 칼 날이 매우 날 카 롭 기 때문에 조심 스럽게 피부 분절을 다루십시오. - 2.2 단계를 반복 하 여 피부 분절를 700 µm의 절단 두께로 조정 하 고 나머지 진 피를 슬라이스 한다. 상부 망상 진 피 ("피부 층 2", 도 2)로 정의 되는 상부 슬라이스를 별도의 페 트리 디쉬에 넣습니다. 즉시 섹션 4로 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오.
- 잔류 하 부 망상 진 피 층 (> 1000 µm) 으로부터 메스로 피하 지방 층을 긁어 버리고 폐기 한다. 다른 페 트리 접시에 하 부 망상 진 피 ("피부 층 3", 그림 2)를 모으십시오. 즉시 섹션 4로 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오.
참고: 양자 택일로, 대신에 메스로 지방을 긁어,가 위로 지방 층을 제거. 그것은 멀리 지방을 긁어 전에 얼음에 망상 진 피를 넣어 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
3. 표 피와 진 피의 분리
-
멸 균 1x PBS에서 3 U/m l 해리 효소 (즉, 디 스퍼 제 II) 용액을 제조 하였다. 5mm 피부 줄무늬 (제 1 항에서) 또는 표 피/유 두 진 (2.2 단계에서)을, 표 피와 함께 10cm 페 트리 디쉬에서 위쪽으로 향하게 하 여 10ml의 3U/mL 해리 효소 용액을 넣습니다. 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 접시를 배양 하였다.
- 프로토콜은 여기서 일시 중지할 수 있습니다. 대신에 4 ° c에서 냉장고에 있는 프로 테아 제에서 표 피/유 두 진을 배양 한다. 필요에 따라 다른 층 (진 피 층 1, 2 및 3)을 4°c에서 50 mL 튜브에 1x PBS에 담가 밤새 보관 한다.
주의: 프로 테아 제를 사용 하 여 신중 하 게 작업 하면 접촉 시 피부와 눈이 자극 될 수 있습니다.
- 프로토콜은 여기서 일시 중지할 수 있습니다. 대신에 4 ° c에서 냉장고에 있는 프로 테아 제에서 표 피/유 두 진을 배양 한다. 필요에 따라 다른 층 (진 피 층 1, 2 및 3)을 4°c에서 50 mL 튜브에 1x PBS에 담가 밤새 보관 한다.
- 인큐베이션 후에, 표 피/유 두와 진 피를 페 트리 디쉬의 건식 뚜껑으로 전달 하 고, 표 피 또는 진 피의 가장자리를 각각 잡고 있는 2 개의 집게와 함께 상부 진 피 (피부 층 1) 로부터 표 피를 분리 한다.
4. 피부 조직의 효소 적 소화
- 각 진 피 층 (진 피 층 1, 2 및 3)을 가능한 한가 위/메스와 별도로 분리 한다. 조각이 작을수록 조직 소화가 좋아집니다.
참고: 진 피의 인 성은 그것이 유래 하는 신체 부위 (예: 복 부 또는 팔 뚝 피부)에 따라 변할 수 있습니다. - 1.25 mg/ml 콜라 게 나아 제 i, 0.5 mg/ml 콜라 0.1 게 니 아 II, 0.5 mg/ml 콜라겐을 사용 하 여 변성 된이 글의 배지 (DMEM)에서 히 알루로 니다 제의 제조 방법 (재료 표 참조), 10% 태아 송아지 세럼 ( 1% 페니실린/streptomycin).
주의: 접촉 시 피부와 눈을 자극할 수 있으므로 collagenases으로 조심 스럽게 작업 하십시오. - 준비 된 소화 혼합물 10ml를 50 mL 튜브에 넣고 1 시간 동안 37 ° c 온수 조에서 배양 하 여 각 다진 조직을 영구 교 반 하에 넣는다. 소화 하는 동안 튜브를 여러 번 반전.
참고: 하나는 다진 된 피부 조각의 크기에 따라 소화 볼륨을 조정 고려해 야 합니다. 그렇지 않으면 세포 수율은 최소화 될 것입니다 너무 많은 조직과 10 mL 소화 믹스를 과부하 하지 마십시오. 총 부피 내 조직의 1/3 미만 (1:2)을 권장 합니다.
5. 단일 세포 현 탁 액 및 적혈구 용 해의 제조
- 소화 된 조직에 10 mL 섬유 아 세포 배지 (DMEM, 10% FCS 및 1P/s)를 추가 하 여 효소 조직 소화를 중단 하십시오. 여기에서 얼음에 대 한 작업.
- 정기적으로 멸 균 스테인리스 차 여과기를 통해 각 튜브의 내용물을 붓고 깨끗 한 페 트리 접시에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 주사기-플런저의 가장자리와 중간 및 매쉬 소화 되지 않은 조직 조각으로 여과기를 씻으십시오.
- 이후, 피 펫은 50 mL 튜브에 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 수집 하였다. 배지로 세포 여과기를 헹 구 고 동일한 튜브를 통해 흐름을 수집 합니다.
- 10 분 동안 4 ° c에서 500 x g 의 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거 하 고 버리고 5 mL 섬유 아 세포 배지로 세포 펠 렛을 세척 한다. 원심 분리 단계를 반복 한다.
- 상기 상층 액을 제거 하 고 폐기 하 고 1 mL에 상기 펠 렛을 소생 하 여 자체 제작 된 난 모 세포용 해 완충 액 (0.15 M, 10MMKHCO3, 0.1 mmn2 EDTA, pH 7.2 \\ 20127.4). 주위 온도에서 약 1 분 동안 용 해 완충 액에 세포를 남겨 주세요 (20 \\ u201222 ° c).
- 10% FCS를 사용 하 여 9 mL의 PBS를 추가 하 여 용 해를 중지 하 고 4 ° c에서 500 x g 에서 튜브를 5 분간 원심 분리기. 상층 액을 버리십시오.
주의: 적혈구 용 해에서의 인큐베이션 시간은 세포가 불완전 하 게 보일 경우 (적색 펠 렛) 조정 될 수 있다. 그러나, 세포가 섬유 아 세포와 면역 세포의 용 해를 피하기 위해 너무 오랫동안 적혈구 용 해 완충 액에 방치 하지 마십시오.
6. FACS에 대 한 섬유 아 세포를 차단 및 염색
- 인간 Fc 차단제의 100 µ L에서 10% FCS 및 소생 세포를 가진 1x PBS의 100 µ L에서 5 µ L의 인간 Fc 수용 체 차단 용액을 준비 하십시오. 10 분간 얼음을 배양 합니다.
- 인간 피부 섬유 아 세포에 얼룩을 FACS 염색 패널을 디자인 한다. 반대로 인간적 인 FAP APC (1:20), 반대로 인간적 인 CD90 1:30 AF700 (1:20), 반대로 인간적 인 CD31 FITC (1:30), 반대로 인간 CD45 태평양 블루 (1:20), 반대로 인간적 인 ITGA6 pe (1:20)를 혼합 하 고 반대로 인간적 인 CD235ab 하는 태평양 10% FCS를 가진 1x PBS에서 블루 (1:100)
-
Fc 수용 체 차단 후, 4 ° c에서 500 x g 의 세포를 3 분 동안 스핀 다운 한다. 100 µ l의 항 체 혼합에서 상층 액 및 소생 세포를 제거 하 고 폐기 한다. 4 ° c에서 20 분간 어둠 속에서 세포를 배양 한다.
- 염색 하기 전에, 미 염색 및 단일 얼룩 FACS 컨트롤을 위한 높은 세포 수와 샘플의 20 µ L을 제거 합니다.
- 스테인드 셀과 FACS 컨트롤을 10% FCS와 500 µ L 1x PBS로 두 번 세척 하 고 4°c에서 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기를 사용 합니다. 그 동안에는 1µ의 최종 농도를 만들기 위해 10% FCS를 가진 1 개의 PBS로 4 ', 6-디 아미노 디 이노 2 페니 린 돌 (DAPI)을 추가 합니다.
- 200 µ L DAPI 용액에서 상층 액을 제거 하 고, 소생 시킨 세포를 버리고 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 각 세포 현 탁 액을 5 mL FACS 튜브로 걸러 냅니다.
참고: FACS가 지연으로 수행 되는 경우, 녹화 직전에 DAPI와 필터를 추가 합니다.
7. 인간 진 피 섬유 아 세포 서브 세트 분리 및 FACS에 대 한 게이팅 전략
- 유량 분석 제어를 기록 하 고 올바른 전압 설정을 설정 하 고 적절 한 보정을 수행 합니다. 단일 세포 및 라이브 (DAPI-), 태평양 블루, PE 및 fitc 음극 세포 (CD45, CD31 CD235ab, CD106, ITGA6 및 전자 카 데인)는 3 개의 섬유 아 세포 집단을얻을 수 있습니다: FAP+ CD90 + CD90 +및 fap CD90+ 세포 그림 3을 참조 하십시오.
- 3 개의 섬유 아 세포를 분리 된 1.5 mL 스크류 캡 마이크로 원심 분리기 튜브로 분류 하 여 RNA 분리를 위한 350 µ L 용 해 완충 액 또는 350 µ L 섬유 아 세포 성장 배지 ( 물질 표참조)로 채워 세포 배양 용으로 채워 넣습니다. 정렬 직후 튜브를 반전 하 고 스냅 동결 또는 얼음에 중간 튜브를 넣어 액체 질소에 용 해 완충 튜브를 넣어.
주의: 흄 후드에 0.1% 진단을의 용 해 완충 액을 준비 하 고 흡입을 피하십시오.
8. 섬유 아 세포 및 지방 형성 분석의 배양
- 다음 FACS, 4°c에서 3 분 동안 500 x g 에서 세포를 스핀 하 고, 48-웰 세포 배양 접시에 섬유 아 세포 성장 배지 ( 재료 표참조)에서 동등한 세포 수 (5000 \\ u201210, 000 셀/우물)를 플레이트. 그들은 70%의 유창에 도달 할 때까지 성장 하는 세포를 남겨 주세요.
- 5 µ의 인슐린, 5 µ M troglitazone, 0.5 mM 3-이 소부 틸 1) 및 섬유 아 세포 성장 배지에 1 µ M dexametasone을 첨가 하 여 지방 세포 분화 배지를 제조 하였다.
- 배양 된 세포의 배지를 지방 세포 분화 배지로 대체 하 고 세포를 14 일 동안 분화 시켜 준다. 2 일째에 µ 인슐린과 5 µ M troglitazone를 함유 하는 지방 생성 배지를 감소 시켰다. 매 3rd 또는 4 일 마다 배지를 보충 합니다.
- 분화 일 14 일째에 주위 온도 (20 u201222 ° c)에서 20 분간 PFA로 세포를 고정 한다. 60%의이 소 프로 판 올로 우물을 씻고 완전히 증발 시켜 주세요. 5mm 오일 레드 O (사용 전 필터)로 세포 얼룩을 20 분간 염색 한 후 증류수로 4 회 세척 합니다. 현미경 검사를 수행 하십시오.
주의: PFA는 독성이 있고 유해 하다. 조심 스럽게 다루십시오.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 고정 된 세포는 오일 적색 O 염색이 수행 될 때까지 4°c에서 1x PBS에 저장 될 수 있다. 증발을 피하기 위해 보관 전에 파라핀 막으로 뚜껑을 덮습니다. - 이미지 셀은 투과 된 빛으로 10 배 배율로 거꾸로 된 현미경으로 물에 침 지 합니다.
Representative Results
피부 조직을 처리 하기 위한 주요 단계에 대 한 개요는 도 1에 나타난 바와 같이, 피부의 dermatoming를 표시 하 고, 상이한 진피 층 (도 1b), 피하 지방의 제거 층 (도 1c) 및 표 피와 유 두와 진 피 (도 1d)의 분리 뿐만 아니라 수동 및 효소 적 조직 해리의 상이한 단계 들 (도 1e, F)을 갖는다. 3 개의 진 피 층의 구성표가 도 2에 제공 된다.
도 3 은 인간 피부 로부터 상이한 섬유 아 세포 서브 세트를 분석 하기 위한 유 세포 분석기 염색 패널의 게이팅 전략을 디스플레이 한다. 섬유 아 세포에 발현 되지 않는 추가의 세포 표면 마커는 최대 순도를 달성 하기 위해 면역 세포, 표 피 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 적혈구 또는 내 피 세포와 같은 피부에 존재 하는 다양 한 다른 세포의 배제를 허용 고립 된 집단에서. 이러한 섬유 아 세포 집단의 동정을 위해 도 2 에 사용 된 동일한 FACS 패널을 사용 하는 것은 중요 하지 않지만, 이것은 우리의 권장 사항입니다. 하나는 다른 형광 염료로 라벨링 된 항 체를 사용 하거나 배제 마커의 조합을 변경할 수 있습니다.
참고로,이 프로토콜은 다른 피 질 국 소화, 유전자 발현 프로 파일 및 또한 기능으로 존재 하는 인간의 피부에서 3 개의 섬유 아 세포 집단의 동정을 가능 하 게 한다 (도 4). FAP+ CD90- 유 두 진 피에 풍부 하 고 fap+CD90+ 및 fapCD90+ 는 망상 진 피에 더 풍부 하다 (그림 4a). 3 개의 모든 하위 집단은 세포 배양에서 선별 시 전형적인 섬유 아 세포 형태학을 나타낸다 (도 4b). 흥미롭게도, 그 (것) 들은 망상 섬유 아 세포를 위한 특징 인 지방 세포로 분화 하는 그들의 능력에 관하여 다릅니다. 이러한 결과를 유전자 발현 프로 파일링과 결합 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)16 (도 4c)을 통해 FAP+CD90 세포가 일반적으로 기인 하는 높은 수준의 마커를 발현 한다는 것을 보여 CD90+ 세포가 높은 수준에서 CD36, ACTA2 및 p a r a와 같은 알려진 망상 마커를 표현 하는 동안 CD26와 같은 유 두 섬유 아 세포는, 우리는 FAP +CD90 세포가 유 두와 CD90에 속하는 결론 세포는 망상 혈통에 속한다.
그림 1: 온전한 인간의 피부에서 진 피 단일 세포 현 탁 액의 분리. (A) 피부는 유 두와 망상 진 피에 전기 피부 분절으로 슬라이스 된다. (B) 상부 망상 진은 700 두께 (µm) 인 반면 인접 표 피를 가진 유 두는 300 두께 (상단)입니다. (C) 피하 지방 층은 메스로 하 부 망상 진 피를 긁어 냅니다. (D) 1 시간 동안 37 ° c에서 해리 효소 용액에 유 두 진을 인큐베이션 한 후, 표 피를 핀셋으로 쉽게 제거할 수 있다. (E) 상이한 진 피 층은가 위로 다진 후 콜라 게 나아 제 i, II 및 IV 및 히 알루로 니다 제의 효소 분해 혼합물로 옮겼다. (F) 37 ° c에서 1 h 해리 후, 조직 소화가 중단 되 고 티 스 트레이너를 통해 현 탁 액이 부 어 지 고 소화 되지 않은 피부 조각을 제거 합니다. (G) 세포 현 탁 액을 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 한번 더 여과 하 고 4°c에서 10 분 동안 500 x G 에서 원심 분리 한 후, 원심 분리 후, 세포 펠 렛을 10% FCS로 1x PBS로 세척 하 고 FACS 염색을 위해 준비 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 인간의 피부 진 피를 피부 분절와 망상 층으로 절편. 전체 두께의 피부를 유 두 진으로 얇게 썰어 서 얻어진 3 개의 경 피 층 (표 피 층을 포함 하는)을 나타내는 스킴 (u2012300), 상부 망상 (300 u20121) 및 하 부 망상 > 진 피 층 3) 피부 분절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 인간 진 피 섬유 아 세포 집단에 대 한 FACS 게이팅 전략. (A\u2012e) 먼저 셀은 단일 (B) 및 실행 가능한 (dapi) 셀에서 제어 됩니다. 면역 세포 (CD45+), 중간 엽 줄기 세포 (CD106+), 적혈구 (CD235ab)및 태평양 청색 음성 세포는 전자 cadherin (Ecad) 및 ITGA6 이중 음극 세포에서 더 게이팅 된다 (PE 채널, D ). ITGA6는 표 피 세포에 표시 된 마커입니다. 다음으로, CD31 양성 세포 (내 피 및 림프 세포)가 배제 된 (D) 2 개의 세포 표면 섬유 아 세포 마커를 FAP 및 CD90 중 어느 하나 또는 둘 모두를 발현 하는 3 개의 섬유 모 세포를 포함 한다: fap+CD90-, Fap+ CD90 + 및 fapCD90+ (E) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: fap+ CD90+ CD90 +및 fap CD90+ 섬유아 세포는 피부 국 소화, 유전자 발현 및 기능 면에서 차이가 있습니다. (A) 유 두, 상 망상 및 하 부 망상 진 피 로부터 분리 된 게이트 섬유 아 세포의 대표적인 FACS 플롯. 게이팅 전략은 그림 3에 설명 되어 있습니다. FAP+CD90- 섬유 아 세포가 유 두 진 피에서 농축 된 (19.2%) 낮은 망상 진 피 (0.83%)에 비해. FAP+CD90+ 세포는 진 피 전체에 걸쳐 발견 될 수 있지만 가장 높은 풍부 함은 상부 망상 진 피 (40.7%)입니다. CD90+ 는 하 부 망상 진 피 (64.4%)에서 농축 된다. (B) 참고로, 3 개의 분류 된 집단은 모두 7 일 동안 배양 시 전형적인 섬유 아 세포 형태학을 표시 한다 (왼쪽). 흥미롭게도, 그들은 지질 분석에서 다르게 행동 합니다. 배양 14 일 후, fap +CD90- fap+CD90+ 및 fap CD90+ 가 쉽게 지질을 받는동안 지방 세포로 분화 하지 마십시오 (오른쪽; 오일 레드 O는 지질 베어링 세포 붉은 얼룩). 축척 막대 = 1000 µm 직접 정렬된 fap+CD90- 섬유 아 세포는 유 두와 섬유 아 세포 마커 CD26, NTN1 및 pdpn을 발현하는 반면, fap CD90+ 세포는 CD36, ACTA2 및 p a r γ, 망상 혈통에 의해 표현. * p ≤ 0.05; p ≤ 0.0005에 비해 FAP+/Cd90- 셀; # p ≤ 0.05; FAP-/cd90+ 셀에 비해 ≤ 0.0005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 기사에서는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하는 방법을 설명 합니다. CD90는 진 피 섬유 아 세포의 동정 또는 분리에 널리사용 되 고 있으며,20,21이다. 그러나, 우리는 CD90 + 섬유 아 세포 외에, 인간 진 피는 또한 활성 섬유 아 세포 및 암 관련 섬유 아 세포에 대 한 마커로 서 확립 된 FAP (16)를 발현 하는 CD90 섬유 모 세포 집단을 항구 ( 22, 23,25. 중요 한 것은, 우리는 모든 건강 한 인간적 인 기증자에 게 서 피부생검에 있는 3개의 섬유 아 세포 부 인구 fap+CD90 + CD90+ 및 fap CD90+ 를 찾아낼 수 있었습니다. 따라서 우리는 FAP가 활성화 된 섬유 아 세포 또는 카페 뿐만 아니라 정상 조직 섬유 아 세포에 대 한 마커로도 결론을 내릴 것입니다.
참고로, 상기한 배제및 게이팅 전략의 적용 후에 잔존 하는 CD90 세포 집단은 섬유 아 세포를 함유 하지 않으며, 이들 세포는 시험관 내에서 섬유 모 세포 배양 배지에 증식 하지 않기 때문에, 대부분 아마 다른 사람의 사이에서 림프 세포 및 심 낭을 포함 하 여 혼합 된 세포 집단16.
상술 한 프로토콜의 사용에 의해 얻어진 세포 수율은 신체-분리에 사용 되는 피부 조각이 유래 하는 부분에 따라 달라질 수 있다. 다른 신체 부위의 진 피는 구조, 두께 및 콜라겐 성분에 따라 다릅니다. 예를 들어, 얼굴이 나 팔 뚝에서 피부는 배 또는 허벅지 로부터 피부 보다 훨씬 얇 아,이는 또한 종종 두꺼운 피하 지방 층을 표시 한다. 부가적으로, 연령 및 피부 기증자의 성별은 조직 해리 효율에만 영향을 미칠 뿐만 아니라, 전체 두께의 피부 로부터 분리 되는 경우에도 3 개의 섬유 아 세포 하위 집단 (도 3)의 분포에 영향을 줄 수 있다. 이것은 유 두 진 피가 축소 되 고 총 섬유 아 세포 수가11세,26,28로 감소 한다는 사실에서 발생 합니다. 더욱이, 유 두 진 피 로부터의 세포 펠 렛은 아마도 망상 진 피 로부터 보다 더 커질 것 이며, 상층 진 피는 망상 진 피 보다 섬유 아 세포에 의해 더 조밀 하 게 채워져 있기 때문 이다. 게다가, 하 부 진 피는 또한 더 강하고 조밀 하 게 콜라겐으로 포장 되어, 조직을 해리 하 고 섬유 아 세포를 방출 하기 어렵게 합니다. 주의, 세포 펠 릿은 매우 빨간색 나타날 수 있습니다., 왜 적혈구 세포 용 해 권장.
온전한 인간 피부에서 3 개의 하위 집단을 동정 하는 것 외에도, 우리는 또한 dermatomed 피부에서 각 섬유 아 세포 서브셋이 유 두 또는 망상 진 피 (16)에서 농축 되는 것을 보여준다. 피부 분절로 피부를 정밀 하 게 슬라이스 하는 것은 서로 다른 진 피 층에서 각 부 모집단을 적절 하 게 농축 하는 데 중요 합니다. 유 두 진 피가 매우 얇기 때문에, 그것을 나타내는 dermatomed 슬라이스는 300 µm의 두께를 초과 하지 않아야 한다. 상부 망상 및 하 부 망상 섬유 아 세포 모두 망상 혈통을 나타내고 유사한 기능 및 유전자 서명을 표시, 따라서이를 분리 하지 않는 것도 고려할 수 있습니다.
중요 하 게는, 모든 3 개의 섬유 아 세포 집단은 진 피 전반에 걸쳐 발견 되 고 독점적으로 한 층에 존재 하지 않으며,이는 유 두 또는 망상 진 피에서의 외식 배양이 혼합 섬유 아 세포 배양을 초래 하는 이유 이다. 그러나 FAP +CD90- 유 두 섬유 아 세포는 유 두 진 피 층에서 가장 풍부 하 고, fap+CD90+ 및 fap-CD90+ 섬유 모 세포가 있는 동안 표면에서 하 부 피부에 그라데이션을 따라 아래에서 표면 층으로의 역 구배16. 더욱이, 유 두 진 피의 대다수의 CD90+ 섬유 아 세포는 거의 독점적으로 혈관 주위에 발견 되 고 혈관 주위 섬유 아 세포 마커 CD14629를 발현 하며, 따라서 아마 보다 다른 기능을 나타낼 남은 CD146- 망상 섬유 아 세포16. CD146는이 채우기를 제외 하기 위한 게이팅 전략의 추가 마커로 사용 될 수 있습니다.
진 피 층의 해리에 따라, 분리 된 세포는 면역 세포의 배제에 대 한 다양 한 항 체를 포함 하는 특수 설계 된 항 체 칵테일로 염색, 내 피의 및 림프 세포, 상피 세포, 적혈구 및 MSCs 순수한 섬유 아 세포 인구를 얻습니다. 참고로, MSCs의 식별 및 배제를 위한 마커를 선택 하는 것은 게시 된 MSC 마커 (30)의 수가 많기 때문에 까다로울 수 있다. MSCs express는 섬유 아 세포와 같은 CD90 때문에, CD105 또는 CD271와 같은 추가 MSC 마커는 그들의 식별을 위해 유용 하 게 증명할 수 있었습니다. 그러나, MSCs는 모든 진 피 세포의 매우 낮은 비율만을 나타내며, CD90+ 섬유 아 세포는 선별 시 섬유 아 세포의 전형적인 형태학 적 특징을 표시 하기 때문에, 별개의 세포 표면 마커의 사용에의 한 mscs의 배제를 주장할 수 있습니다 필요 하지 않습니다.
중요 하 게는, 우리는 CD90 유전자 발현을 선별 후 7-14 일 동안 배양 하 여 세포를 유지 한 후에 FAP를 분석 하 고 (데이터는 표시 되지 않음) 두 마커의 발현이 각각의 선별 된 단일 양성 (FAP+CD90에 상향 조절 됨을 발견 하였다 CD90+) 세포16. 그러므로 우리는 전술 된 마커 세트 및 프로토콜이 이전에 배양 된 혼합 섬유 아 세포 집단 으로부터 직접 조직 으로부터 1 차 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 허용 하는 것을 강조 한다.
그럼에도 불구 하 고, 우리는 섬유 아 세포가 FAP+CD90- 유 두 섬유 아 세포로 분류 되기 때문에 3 개의 모든 하위 집단의 기능이 세포 표면 마커 발현의 변경에 관계 없이 세포 배양에 유지 된다는 것을 입증 합니다 아 섬유 아 세포가 FAP+CD90+ 또는 fap CD90+ 망상 섬유 아 세포로 분류 되는 동안 배양의긴 기간 후에 지질을 겪는 능력을 습득 하 여 지방 세포로 분화 하는 능력을 유지 한다 16 . 중요 한 것은, 우리는 또한 유 두 및 망상 특이 적 유전자는 여전히 FAP+CD90 및 CD90+ 에서 더 높은 범위로 표현 된다는 것을 발견 했습니다.
결론적으로, 우리는 인간의 피부 진 피 로부터 순수 하 고 순진한 섬유 아 세포 집단의 분리 및 분석을 최초로 허용 하는 FACS를 통해 기능적으로 뚜렷한 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 위한 프로토콜을 확립 하였다. 이 방법은 (i) 피부 표면에서 피하 진 피에 존재 하는 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 대 향하는 기울기 (i)와 같이 상부 및 하 부 진 피 로부터 통상적으로 사용 되는 섬유 아 세포를 이용한 분리 프로토콜에 대 한 큰 진보를 확립 하 고 (ii) 섬유 아 세포는 시험관 내에서 그들의 유전자 서명을 변경.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Bärbel 라인하르트와 볼프강 바 우 어에의 한 FACS의 도움을 기꺼이 인정 합니다. 이 사업은 오스트리아 과학 기금 (FWF: V 525-B28)과 유럽 생화학 사회의 연맹 (FEBS, 후속 연구 기금)에서 b. m. l.에 게 보조금을 지원 했습니다. S. f. 오스트리아 과학 아카데미 (OeAW)의 DOC 원정대의 수혜자입니다. 우리는 비엔나의과 대학의 핵심 시설에서 우수한 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 우리는 인간 피부 재료를 제공 하기 위한 Bernhard Gesslbauer, 크리스틴 Radtke 및 마틴에 르 합 퍼 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material: | |||
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
| β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | CAUTION |
| C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
| Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | CAUTION |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | CAUTION |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | CAUTION |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | CAUTION |
| Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | CAUTION |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
| OilRed O | Sigma | O-0625 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ | Lonza | BE17-512F | |
| Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
| Taqman 2x Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | CAUTION Skin and eye irritant. |
| Troglitazone | Sigma | T2573 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry Antibodies: | |||
| anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
| anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
| anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
| anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
| anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
| anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
| anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
| anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
| Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| 1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
| 1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
| 5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
| 50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
| 70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
| Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
| Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
| MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
| Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
| Tea strainer | x | x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibroblast growth medium: | |||
| AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S |
References
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