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Biochemistry

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Abstract

La microscopia di localizzazione a singola molecola sonda la posizione e i movimenti delle singole molecole nelle cellule viventi con decine di nanometri di risoluzione spaziale e temporale al millisecondo. Queste capacità rendono la microscopia di localizzazione a singola molecola ideale per studiare le funzioni biologiche a livello molecolare in ambienti fisiologicamente rilevanti. Qui, dimostriamo un protocollo integrato per l'acquisizione e l'elaborazione/analisi di dati di tracciamento a singola molecola per estrarre i diversi stati diffusive che una proteina di interesse può mostrare. Queste informazioni possono essere utilizzate per quantificare la formazione di complessi molecolari nelle cellule viventi. Forniamo una descrizione dettagliata di un esperimento di localizzazione 3D a singola molecola basato su telecamera, così come le successive fasi di elaborazione dei dati che producono le traiettorie delle singole molecole. Queste traiettorie vengono quindi analizzate utilizzando un quadro di analisi numerica per estrarre gli stati diffusi prevalenti delle molecole fluorescenti etichettate e l'abbondanza relativa di questi stati. Il quadro di analisi si basa su simulazioni stocastiche di traiettorie di diffusione browniana intracellulari che sono confinate spazialmente da una geometria cellulare arbitraria. Sulla base delle traiettorie simulate, le immagini a singola molecola grezze vengono generate e analizzate allo stesso modo delle immagini sperimentali. In questo modo, le limitazioni sperimentali di precisione e precisione, che sono difficili da calibrare sperimentalmente, sono esplicitamente incorporate nel flusso di lavoro di analisi. Il coefficiente di diffusione e le frazioni di popolazione relativa degli stati diffusi sono determinati adattando le distribuzioni di valori sperimentali utilizzando combinazioni lineari di distribuzioni simulate. Dimostriamo l'utilità del nostro protocollo risolvendo gli stati diffusivi di una proteina che presenta diversi stati diffusi dopo la formazione di complessi omo- ed etero-oligomerici nel citosol di un patogeno batterico.

Introduction

L'esame del comportamento diffuso delle biomolecole fornisce informazioni sulle loro funzioni biologiche. Le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare le biomolecole nel loro ambiente cellulare nativo. Il recupero della fluorescenza dopo la fotobleaching (FRAP) e la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS)1 forniscono comportamenti diffusischi con la media dell'insieme. Al contrario, la microscopia di localizzazione a singola molecola consente l'osservazione di singole molecole fluorescenti con alta risoluzione spaziale e temporale2,3,4. Osservare singole molecole è vantaggioso poiché una proteina di interesse può esistere in diversi stati diffusivi. Ad esempio, due stati diffusivi facilmente distinguibili sorgono quando un regolatore trascrizionale, come CueR in Escherichia coli, si diffonde liberamente nel citosol o si lega a una sequenza di DNA e diventa immobilizzato sulla scala cronologica della misurazione5 . Il tracciamento a singola molecola fornisce uno strumento per osservare direttamente questi diversi stati e non sono necessarie analisi sofisticate per risolverli. Tuttavia, diventa più difficile risolvere più stati diffusi e le loro frazioni di popolazione nei casi in cui i loro tassi di diffusione sono più simili. Ad esempio, a causa della dipendenza dalle dimensioni del coefficiente di diffusione, i diversi stati di oligomerizzazione di una proteina si manifestano come diversi stati diffusivi6,7,8,9 , 10. Tali casi richiedono un approccio integrato in termini di acquisizione, trattamento e analisi dei dati.

Un fattore critico che influenza i tassi diffusivi delle molecole citosoliche è l'effetto del confinamento attraverso il confine cellulare. Le restrizioni imposte al movimento molecolare da un confine cellulare batterico fanno sì che il tasso di diffusione misurato di una molecola citononica appaia più lenta rispetto a quando lo stesso movimento si fosse verificato in uno spazio non confinato. Per le molecole che si difcizzano molto lentamente, l'effetto del confinamento cellulare è trascurabile a causa della mancanza di collisioni con il confine. In questi casi, può essere possibile risolvere con precisione gli stati diffusivi adattando le distribuzioni di spostamenti molecolari, ro coefficienti di diffusione apparente, D ,utilizzando modelli analitici basati sulle equazioni per il moto browniano ( diffusione casuale)11,12,13. Tuttavia, per la rapida comfazione delle molecole citosoliche, le distribuzioni sperimentali non assomigliano più a quelle ottenute per il moto browniano non confinato a causa di collisioni di molecole che diffondevano i confini cellulari. Gli effetti di confinamento devono essere presi in considerazione per determinare con precisione i coefficienti di diffusione non confinati delle molecole fluorescenti. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per tenere conto degli effetti di confinamento (semi-)analiticamente 5,14,15,16 o numericamente attraverso simulazioni Monte Carlo di Diffusione browniana6,10,16,17,18,19.

Qui, forniamo un protocollo integrato per la raccolta e l'analisi dei dati di microscopia di localizzazione a singola molecola con particolare attenzione al tracciamento a singola molecola. L'obiettivo finale del protocollo è quello di risolvere gli stati diffusivi di proteine citosoliche fluorescenti all'interno, in questo caso, cellule batteriche a forma di asta. Il nostro lavoro si basa su un protocollo precedente per il tracciamento a singola molecola, in cui una polimerasi di DNA, PolI, ha dimostrato di esistere in uno stato legato al DNA e non legato dall'analisi di diffusione20. Qui, espandiamo l'analisi di tracciamento a singola molecola a misurazioni 3D ed eseguiamo simulazioni computazionali più realistiche per risolvere e quantificare più stati diffusi contemporaneamente presenti nelle cellule. I dati vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza a super-risoluzione 3D costruito in casa che è in grado di determinare la posizione 3D degli emettitori fluorescenti mediante l'imaging con la funzione di diffusione del punto a doppia elica (DHPSF)21,22. Le immagini a singola molecola grezze vengono elaborate utilizzando un software scritto su misura per estrarre le localizzazioni 3D a singola molecola, che vengono poi combinate in traiettorie a singola molecola. Migliaia di traiettorie sono raggruppate per generare distribuzioni di coefficienti di diffusione apparente. In una fase finale, le distribuzioni sperimentali sono in sintonia con distribuzioni generate numericamente ottenute attraverso simulazioni Monte-Carlo di moto browniano in un volume limitato. Applichiamo questo protocollo per risolvere gli stati diffusidella proteina YscQ del sistema di secrezione di tipo 3 nella Yersinia enterocoliticavivente. A causa della sua natura modulare, il nostro protocollo è generalmente applicabile a qualsiasi tipo di esperimento di tracciamento a singola molecola o a particella singola in geometrie cellulari arbitrarie.

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Protocol

1. Calibrazione a doppia elica point-spread-function

NOTA: le immagini descritte in questa e nelle sezioni seguenti vengono acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito personalizzato, come descritto in Rocha et al.23. La stessa procedura è applicabile a diverse implementazioni al microscopio progettate per la localizzazione di una singola molecola e la microscopia di tracciamento2,3,4. Tutto il software per l'acquisizione di immagini e l'elaborazione dei dati descritto in questo articolo è disponibile (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. Preparazione di cuscinetti agarose per il montaggio di campioni su vetrini di copertura da visualizzare al microscopio.
    1. Aggiungere l'1,5-2% peso basso punto di fusione agarose a 5 mL di buffer M2G (4,9 mM Na2HPO4, 3,1 mM KH2PO4, 7,5 mM NH4Cl, 0,5 mM MgSO4, 10 M FeSO4, 0,5 mM CaCl2 e 0,2 glucosio). Microonde per alcuni secondi fino a quando tutte le agarose si dissolvono. Non far bollire la soluzione.
    2. Lasciare raffreddare la soluzione di agarose per qualche minuto (2-3 min).
    3. Pipette 600 - L di soluzione agarose su uno scivolo di copertura di vetro (22 mm x 22 mm). Posizionare delicatamente un secondo coperchio di vetro sulla parte superiore dell'agarose. Questo crea un sottile tampone di gel di agarose (0,5 mm) tra i due coperchi di copertura in vetro.
    4. Lasciate che le pastiglie di agarose sedersi a solidificare per 20 dollari min.
    5. Separare delicatamente gli scivoli di copertura del vetro. Il cuscinetto di agarose si attaccherà a uno di loro.
    6. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il pad agarose in quattro sezioni quadrate di uguale dimensione. Ogni sezione quadrata può essere utilizzata per un singolo campione.
  2. Pipetta 1,5 - Soluzione di perline fluorescenti su un cuscinetto di agarose. La soluzione perline è una diluizione 1/100000 della soluzione stock in M2G (vedere Tabella dei materiali).
  3. Invertire il pad agarose e posizionare su uno scivolo di copertura di vetro che è stato pulito in un detergente per ozono per 30 min. Il tempo di pulizia viene scelto per eliminare eventuali molecole fluorescenti aderenti ai copricoperture.
  4. Montare il vetro di copertura del campione sul supporto del campione di un microscopio a fluorescenza invertito e fissarlo in posizione utilizzando nastri adesivi o clip portacampioni caricate a molla.
  5. Aggiungere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo del microscopio.
  6. Posizionare il supporto del campione su un microscopio e fissarlo in posizione.
  7. Inizializzare l'interfaccia utente grafica (GUI) per controllare la fotocamera, lo stage campione e i laser di eccitazione del microscopio. In questo caso, il software scritto su misura in MATLAB viene utilizzato per il controllo dello strumento (Supplementary Figure 1).
  8. Inizializzare il software della fotocamera HCImage Live. Nella scheda Acquisizione nella sezione Controllo videocamera, impostate il tempo di esposizione su 0,03 s. Fare clic su Live per iniziare un feed live della videocamera.
  9. Accendere il laser facendo clic su Apri laser 514 nm sull'interfaccia GUI per eccitare le perline fluorescenti sul pad e visualizzare l'emissione di fluorescenza sulla fotocamera utilizzando la modalità live-stream (cioè nessun dato salvato su disco).
  10. Regolare le posizioni X e Y dello stage del microscopio facendo clic sulle frecce 'XY-Pos' nella sezione 'Stadio di micro-posizionamento' della GUI per posizionare almeno una perla fluorescente al centro del campo visivo (FOV). La dimensione del passo può essere modificata facendo clic sulla casella a discesa sotto le frecce.
  11. Regolare la posizione del microscopio facendo clic sulle frecce zo-pos nella sezione Nano-Position stage della GUI. Impostare l'orientamento della funzione DHPSF (Double-helix point-spread-) del tallone fluorescente in verticale. Questo orientamento verticale è definito come il punto di partenza della calibrazione z. La dimensione del passo può essere modificata facendo clic sulla casella a discesa sotto le frecce.
  12. In HCImage Live, in Acquisizione . Modalità di trigger, velocità e registrazione, modificare la modalità di trigger da Interno a Trigger livello esterno. Ciò consentirà alla GUI MATLAB di controllare la telecamera.
  13. In Sequenza Impostazioni scansione, modificare il numero di conteggi dei frame in 1200. Scegliere una cartella di destinazione di salvataggio facendo clic sul pulsante con l'etichetta .... Infine, fare clic su Avvia. Il numero di conteggi dei fotogrammi è impostato su 1200 in modo che sia possibile raccogliere 10 fotogrammi per ciascuno dei 120 gradi di posizione.
  14. Eseguire la scansione di una serie di posizioni di z (30 passi sopra e sotto la posizione iniziale in incrementi di 50 nm) e registrare 10 fotogrammi ad ogni passo utilizzando un tempo di esposizione di 0,03 s. Iniziare il processo automatizzato facendo clic su GO nella sezione l'interfaccia utente grafica.
    NOTA: i parametri per la calibrazione, tra cui la lunghezza del passo, il numero di passi, il tempo di esposizione della fotocamera e il numero di fotogrammi per passo possono essere regolati anche qui. Circa 105 fotoni possono essere acquisiti da una perlina fluorescente in un singolo fotogramma utilizzando 0,03 s tempi di esposizione con conseguente x,y,z precisione di localizzazione di circa 1 nm.
  15. Disattivare l'illuminazione laser facendo clic su Chiudi laser a 515 nm nella GUI. In HCImage Live, in Acquisizione . Modalità trigger, Velocità e Registrazione, modificare la modalità trigger in Interno. In Sequenza Le impostazioni di scansione modificano il numero di conteggi dei fotogrammi in 200. Scegliere una cartella di destinazione di salvataggio facendo clic sul pulsante con l'etichetta .... Fare clic su Avvia per raccogliere 200 fotogrammi di immagini scure con un tempo di esposizione di 0,03 s.
    NOTA: anche in assenza di luce che cade sul rilevatore, ogni pixel leggerà un numero positivo (denominato valore di offset scuro), che può variare leggermente tra i pixel. Il valore di scostamento scuro può cambiare nel tempo. Pertanto, è necessario raccogliere cornici scure per ogni calibrazione.
  16. Montare il DHPSF con un modello a doppia gaussia utilizzando il software Easy-DHPSF24 per ottenere le posizioni X e Y del tallone, nonché una curva di calibrazione angolo contro calibrazione.
    1. Inizializzare il software Easy-DHPSF in MATLAB. In Configurazione, impostare Canale su G e impostare Metodo di adattamento su MLE con modello DG. G si riferisce alla telecamera del canale verde, poiché la proteina fluorescente utilizzata per l'acquisizione dei dati emette lunghezze d'onda verdi. MLE con modello DG si riferisce alla stima della massima probabilità con il modello a doppia gaussiana.
      NOTA: le dimensioni in pixel e il guadagno di conversione dipendono dalla configurazione ottica specifica e potrebbero dover essere modificati.
    2. Nella sezione Calibrate DHPSF fare clic su Esegui. Fare clic su OK nella seguente finestra popup per mantenere le impostazioni predefinite.
    3. Selezionare la pila di immagini salvata nei passaggi 1.13-1.14. Quindi, selezionare la pila di immagini con lo sfondo scuro salvato nel passaggio 1.15. Infine, selezionare il file con estensione txt salvato automaticamente durante il passaggio 1.14. Questo file contiene la posizione z della fase durante il processo di scansione.
    4. Nella finestra pop-up successiva, se il chip della fotocamera completo non è stato utilizzato per il campo visivo, inserire le posizioni x0 e y0 iniziali sul chip. In caso contrario, l'input x0 è 1 e y0 - 1.Queste informazioni sono disponibili in HCImage Live nella sezione Binning and SubArrary.
    5. Nella finestra seguente, ridimensionare e riposizionare la casella visualizzata sopra l'immagine delle perline fluorescenti in modo che abbia una dimensione di circa 100 x 100 pixel e centrata su un singolo segnale DHPSF fluorescente. Quindi, fare doppio clic per continuare.
      NOTA: il DHPSF scelto deve essere isolato dagli altri segnali DHPSF e idealmente essere il tallone più luminoso possibile.
    6. Fare clic al centro del segnale DHPSF, tra i due lobi, quindi premere Invio. La finestra seguente mostra una visualizzazione ingrandita del DHPSF scelto. Più precisamente scegliere la posizione del centro del DHPSF cliccando.
      NOTA: Il programma si adatta al DHPSF e visualizza l'immagine raw e la ricostruzione dall'adattamento. Emetterà anche immagini modello dalla calibrazione di z corrispondente a una sezione trasversale DHPSF in diverse posizioni. Questi saranno utilizzati in seguito per l'adattamento dei dati sperimentali. Il programma emetterà la posizione X, Y e s stimata in ogni fotogramma. In un sistema ottico ben allineato, X e Y dovrebbero cambiare pochissima (deviazione di 30 nm) man mano che cambia la posizione di z. Se la variazione di output è maggiore di 30 nm, la maschera di fase, situata nel piano di Fourier del sistema di imaging (Figura 1), deve essere riallineata e ripetere i passaggi 1.9-1.16.
    7. Salvare la GUI Easy-DHPSF facendo clic sull'icona Salva nell'angolo in alto a sinistra della GUI. Questo può essere caricato in seguito facendo clic sull'icona Carica nella GUI.
      NOTA: Ogni giorno di un esperimento deve essere condotta la procedura di calibrazione z per tenere conto dei cambiamenti di allineamento nel microscopio che potrebbero essersi verificati a causa di fluttuazioni di temperatura o vibrazioni meccaniche.

2. Preparazione della coltura batterica

  1. Preparare i mezzi di coltura a sostegno della crescita delle cellule batteriche. Per Y. enterocolitica, utilizzare 5 mL di BHI (Brain Heart Infusion) brodo contenente acido nalidissico (35 g/mL) e 2,6-diaminopimelico acido (80 g/mL). Qui, viene utilizzato un ceppo Y. enterocolitica che ha la proteina YscQ etichettata con la proteina fluorescente eYFP23.
  2. Inoclate i media con colture batteriche provenienti da scorte di congelatori o colture di placche.
  3. Far crescere la coltura a 28 gradi centigradi agitando durante la notte.
  4. Diluire una piccola quantità (250 dollari l) di cultura notturna satura a 5 mL utilizzando supporti di coltura fresca.
  5. Far crescere la coltura a 28 gradi centigradi con agitazione per 60-90 min.
  6. Indurre l'espressione della proteina di fusione fluorescente. Per Y. enterocolitica, il calore scuote le cellule a 37 gradi centigradi in uno shaker d'acqua per indurre il reguron yop.
  7. Incubare le cellule per un ulteriore 3 h a 37 s.C con agitazione.
  8. Centrifuga 1 mL di coltura a 5.000 x g per 3 min a temperatura ambiente. Scartare il super-attardato.
  9. Lavare il pellet 3 volte con 1 mL di supporti M2G.
  10. Sospendere nuovamente i batteri pelleta in 250 dollari ll di M2G Media.
  11. Aggiungere perline fluorescenti come marcatori fiduciari. La soluzione di perline fluorescenti deve essere aggiunta in quantità opportunamente diluite, in modo che ci siano solo 1-2 perline per FOV quando visualizzate al microscopio.
  12. Pipette o vortice le sospensioni per separare le cellule aggregate.
  13. Piastra 1,5 -L di sospensione su un pad agarose 1.5-2% realizzato con M2G.
  14. Invertire il cuscinetto di agarose e posizionarlo su uno scivolo di copertura del microscopio pulito con ozono. Lo slittamento di copertura deve essere collocato in un detergente per ozono per 30 min per ridurre qualsiasi sfondo di fluorescenza intrinseco.

3. Acquisizione dei dati

  1. Montare il vetro di copertura del campione sul supporto del campione di un microscopio a fluorescenza invertito e fissarlo in posizione utilizzando nastri adesivi o clip portacampioni caricate a molla.
  2. Aggiungere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo del microscopio, quindi posizionare il supporto del campione al microscopio e fissarlo in posizione.
  3. Inizializzare l'interfaccia utente grafica (GUI) per controllare la fotocamera, lo stadio campione e i laser di eccitazione del microscopio. Qui, il software scritto su misura in MATLAB viene utilizzato per il controllo dello strumento.
  4. Inizializzare il software della fotocamera HCImage Live. Nella scheda Acquisizione nella sezione Controllo videocamera, impostate il tempo di esposizione su 0,025 s. Fare clic su Live per iniziare un feed live della videocamera.
  5. Regolare le posizioni X e Y dello stadio del microscopio facendo clic sulle frecce XY-Pos nella sezione Micro-Positioning Stage della GUI per eseguire la scansione intorno al campione e trovare un FOV con una popolazione opportunamente densa di cellule batteriche.
    NOTA: per ottimizzare la velocità effettiva dei dati, le celle devono essere il più dense possibile, senza sovrapporre o toccare le celle. Il FOV dovrebbe inoltre includere almeno 1 perline fluorescente da utilizzare come marcatore fiduciario, preferibilmente posizionato in un angolo del FOV.
  6. Regolare la posizione del microscopio facendo clic sulle frecce zo-pos sotto la sezione Nano-Position stage della GUI, in modo che i lobi DHPSF del tallone fluorescente siano verticali.
  7. In Sequenza Impostazioni scansione, modificare il numero di conteggi dei fotogrammi in 20.000. Scegliere una cartella di destinazione di salvataggio facendo clic sul pulsante con l'etichetta .... Infine, fare clic su Start per raccogliere fino a 20.000 fotogrammi della fotocamera utilizzando un breve tempo di esposizione di 0.025 s. eYFP photoblinking viene avviato utilizzando la luce di eccitazione ad alta intensità a 514 nm19,25.
    NOTA: Qui, un'intensità laser di 350 W/cm2 sul piano focale viene utilizzata per lo sbiancamento iniziale e la successiva imaging di singole molecole EYFP. La fotoattivazione delle molecole eYFP a lunghezze d'onda UV durante l'imaging non è stata utilizzata. Dovrebbe esserci al massimo un segnale a singola molecola per cellula batterica. Se la densità del segnale a singola molecola è inizialmente troppo alta, continuare a illuminare fino a quando non si verifica un fotosbiancamento sufficiente prima di iniziare l'acquisizione dei dati.
  8. Disattivare l'illuminazione laser facendo clic su Chiudi laser a 515 nm nella GUI. Raccogli 200 fotogrammi di immagini scure utilizzando lo stesso tempo di esposizione.
  9. Nella GUI, selezionare la casella accanto a Thorlabs LED e fare clic su Toggle Mirror Up. Questo cambierà il percorso dal percorso di fluorescenza al percorso di contrasto di fase.
  10. Inizializzare il software di acquisizione dati IC Capture 2.4. Questo controlla la fotocamera nel percorso di contrasto di fase. Premi il pulsante Avvia/Interrompi Live Display per visualizzare un feed live dalla fotocamera. Fare clic su Acquisizione . Salva immagine per raccogliere un'immagine a contrasto di fase delle celle nel campo visivo.
  11. Ripetere i passaggi da 3.5-3.10 per ulteriori FOV. In questo caso, i dati acquisiti da 500 cellule batteriche in dieci diversi FOV vengono utilizzati per aumentare il numero di traiettorie a singola molecola disponibili per l'analisi.
    LEGGI: Le cellule montate sui cuscinetti di agarose per lunghi periodi di tempo possono comportarsi in modo diverso rispetto alle cellule appena montate. Inoltre, il pad agarose può perdere la sua integrità dopo qualche tempo, che può influenzare negativamente la qualità dei dati. In genere, al massimo 3 FOV (30 min al microscopio) vengono utilizzati per ogni vetrino campione.

4. Trattamento dei dati

NOTA: Una versione modificata del software Easy-DHPSF24 viene utilizzata in MATLAB per l'analisi dei fotogrammi della fotocamera raw per estrarre le localizzazioni a singola molecola. Easy-DHPSF è usato specificamente per adattarsi alle localizzazioni DHPSF nell'imaging a singola molecola. Sono state apportate modifiche personalizzate per implementare la routine di adattamento basata su MLE (Maximum Likelihood Estimation) che tiene conto delle caratteristiche di rumore dipendenti dai pixel delle moderne telecamere sCMOS26. È stato anche modificato per accettare l'output del tipo di file di immagine dal programma HCImage Live (.dcimg). Per una spiegazione più dettagliata del software e dei singoli passaggi, consultare Lew etal.

  1. Inizializzare la GUI Easy-DHPSF in MATLAB (Supplementary Figure 2). Caricare il file salvato nel passaggio 1.16.8.Load in the file saved in step 1.16.8.
  2. Determinazione dei valori di soglia per ognuno dei 7 modelli restituiti nel passaggio 1.16.7Determining threshold values for each of the 7 templates output in step 1.16.7
    1. Nella sezione Calibratura identificazione SM fare clic su Esegui. Fare clic su OK nelle due finestre popup seguenti per mantenere le impostazioni predefinite.
    2. Quando richiesto, aprire la pila di immagini contenente i dati del primo FOV.
    3. Scegliere una piccola gamma di cornici per abbinare i modelli. Tipicamente i fotogrammi 1001-2000 vengono utilizzati per evitare segnali sovrapposti densi nelle prime diverse centinaia di fotogrammi. Fare clic su OK nella seguente finestra popup per mantenere le impostazioni predefinite. Fare clic su Annulla quando viene richiesto il file di registro di sequenza nella finestra seguente.
    4. Aprire la pila di immagini con lo sfondo scuro salvato nel passaggio 3.8. Fare clic su 'OK' nella seguente finestra popup per lasciare i parametri per la stima in background impostati sul valore predefinito. L'impostazione predefinita prevede la stima dello sfondo utilizzando un filtro mediano27 che copre 100 fotogrammi successivi intorno al fotogramma corrente.
    5. Nella finestra successiva, ridimensiona la casella sovrapposta all'immagine per coprire l'intero FOV, quindi fai doppio clic per continuare.
    6. Definire l'area di interesse facendo clic su diversi punti dell'immagine per creare un poligono. La regione di interesse dovrebbe includere il più possibile il campo visivo, assicurando al contempo che le perline fluorescenti (oggetti molto luminosi) nell'immagine non si trovano all'interno del poligono, quindi fare doppio clic per continuare.
      NOTA: il software tenterà quindi di abbinare i modelli all'immagine e visualizzerà un'immagine con possibili corrispondenze cerchiate.
    7. Quando il software si è fermato, salverà molte immagini di corrispondenze del modello trovato e visualizzerà il valore di soglia corrispondente in una cartella predefinita. Un valore di soglia più alto corrisponde a una corrispondenza migliore. Per ogni numero di modello, esaminare le corrispondenze di esempio e determinare la soglia più bassa che presenta un'immagine di un DHPSF. Immettere queste soglie per ciascuno dei 7 modelli nella sezione Calibrate SM Identification nella GUI Easy-DHPSF.
      NOTA: Il programma tenterà di scegliere automaticamente e di inserire soglie, tuttavia, queste sono spesso inaffidabili e dovrebbero essere controllate manualmente. Le soglie sono scelte in modo tale che pochi segnali a singola molecola vengano persi, ma il numero di candidati falsi positivi per il raccordo rimane computazionalmente gestibile.
    8. Salvare nuovamente la GUI Easy-DHPSF facendo clic sull'icona Salva nell'angolo in alto a sinistra.
  3. Montaggio del tallone fluorescente nel FOV da utilizzare come marcatore fiduciario
    1. Nella sezione Track fiduciaries della GUI Easy-DHPSF, fare clic su Esegui. Fare clic su OK nelle due finestre popup seguenti per mantenere le impostazioni predefinite.
    2. Trascinare la casella sovrapposta all'immagine e centrarla sul segnale DHPSF dal tallone fluorescente, quindi fare doppio clic.
    3. Fare clic al centro del segnale DHPSF, nel punto medio tra i due lobi, quindi premere invio. Fare clic su Annulla quando viene richiesto il file di registro di sequenza nella finestra seguente.
      NOTA: Il software si adatta al DHPSF in tutte le cornici della fotocamera e visualizza l'immagine raw e l'immagine ricostruita. Quando il software è terminato, emetterà cifre con le posizioni X,Y, e s del tallone fluorescente per tutta la durata dell'acquisizione dell'immagine.
    4. Seleziona la casella accanto a Usa fiduciarie e salva di nuovo la GUI Easy-DHPSF facendo clic sull'icona Salva nell'angolo in alto a sinistra.
  4. Trova e adatta tutte le localizzazioni in tutti i fotogrammi della fotocamera utilizzando le soglie del modello ottenute nel passaggio 4.2.
    1. Nella sezione Localizzare Le SM DHPSF della GUI Easy-DHPSF, fare clic su Esegui. Fare clic su OK nelle seguenti finestre popup per mantenere le impostazioni predefinite. Fare clic su Annulla quando viene richiesto il file di registro di sequenza nella finestra seguente.
      NOTA: Il software troverà e si adatta al DHPSF utilizzando un modello doppio-gaussiano se la qualità della partita è superiore alla soglia definita dall'utente. Visualizzerà l'immagine grezza con cerchi intorno alle corrispondenze del modello e un'immagine delle vestibilità DHPSF ricostruite.
    2. Salvare nuovamente la GUI Easy-DHPSF facendo clic sull'icona Salva nell'angolo in alto a sinistra.
  5. Visualizzazione delle localizzazioni a singola molecola e filtrazione delle localizzazioni indesiderate o inaffidabili
    1. Nella sezione Localizzazioni SM DHPSF output fare clic su Output filtro.
    2. Fare clic su OK nelle tre finestre seguenti per eseguire un'interpolazione delle posizioni fiduciarie X, Y e z nel tempo. Nella maggior parte dei casi, le opzioni predefinite sono sufficienti. Se la linea interpolata nera non riflette un'interpolazione ragionevole della linea di posizione rossa, modificate i parametri di interpolazione nella finestra pop-up.
      NOTA: la linea interpolata viene utilizzata per correggere le localizzazioni a singola molecola.
    3. Aprire l'immagine di contrasto di fase corrispondente per il FOV analizzato quando richiesto. Fare clic su OK nelle due finestre popup seguenti per mantenere le impostazioni predefinite.
    4. Nelle due finestre popup seguenti, modificare i valori del filtro per consentire requisiti di localizzazione a singola molecola più rigorosi o più indulgenti, quindi fare clic su OK.
    5. Nella finestra visualizzata, trascinare o ridimensionare la casella sovrapposta alle immagini per visualizzare l'area di interesse desiderata e fare doppio clic per continuare.
    6. Viene visualizzata una ricostruzione 3D delle localizzazioni a singola molecola. Utilizzare gli strumenti figura per manipolare la ricostruzione (rotazione, zoom, ecc). Fare clic su Continua per visualizzare un'altra finestra di dialogo in cui viene chiesto 'Desideri ritracciare con un setdi parametri diverso? '. Se i risultati sono soddisfacenti, fare clic su No. In caso contrario, fare clic su Sì.
      NOTA: i motivi più comuni per i risultati insoddisfacenti includono l'immagine a contrasto di fase che non viene sovrapposta correttamente ai dati di localizzazione o le soglie iniziali del modello erano troppo basse creando molte localizzazioni false positive. Se è stato selezionato Sì, il software tornerà al passaggio 4.5.4 in modo che sia possibile definire nuovi valori di parametro. Se è stato selezionato No, i risultati verranno salvati.

5. Post-elaborazione dei dati

  1. Utilizzando un software scritto su misura in MATLAB, ritagliare l'immagine a contrasto di fase in modo che rimanga solo la regione che contiene le cellule che sono state immagini al microscopio a fluorescenza. Questo passaggio è necessario perché l'immagine a contrasto di fase copre un'area molto più grande dell'immagine a fluorescenza. Il ritaglio dell'immagine semplifica il passaggio successivo.
  2. Segmentare singole celle elaborando l'immagine a contrasto di fase con il software OUFTI28 (Figura supplementare 3)
    1. Inizializzare OUFTI in MATLAB. Caricare l'immagine a contrasto di fase ritagliata dal passaggio precedente facendo clic su Carica fase.
    2. Fare clic su File per scegliere e assegnare un nome a un percorso di salvataggio per il file di output.
    3. Selezionare Frame indipendenti sotto l'intestazione Rilevamento e analisi.
    4. Fare clic su Carica parametri per caricare i parametri per il rilevamento delle celle. Esempi di parametri includono l'area accettabile della cella, la larghezza della cella e una soglia di divisione delle celle.
      NOTA: Tutti questi parametri devono essere regolati per massimizzare le prestazioni specifiche delle celle e della qualità dell'immagine in uso. È importante sottolineare che il parametro dell'algoritmo deve essere impostato su subpixel per consentire una misurazione precisa dei contorni delle celle.
    5. Fare clic su Questo fotogramma per iniziare la segmentazione delle celle. I contorni delle celle appariranno sopra l'immagine di contrasto di fase al termine del processo.
    6. Utilizzando i controlli nella sezione Manuale, dividere le celle, aggiungere celle o perfezionare i contorni delle celle segmentate in modo impreciso durante il processo automatizzato.
    7. Eseguire l'output dei contorni delle celle facendo clic su Salva analisi.
  3. Utilizzare un software personalizzato in MATLAB per sovrapporre con precisione i contorni ottenuti nel passaggio precedente con le localizzazioni a singola molecola. I seguenti passaggi secondari illustrano in dettaglio i passaggi del software.
    1. Selezionare manualmente 5 coppie di punti di controllo nella finestra pop-up stimando approssimativamente e facendo clic sulla posizione dei poli cellulari delle stesse cinque celle sia nei dati di localizzazione a singola molecola che nei profili delle celle, generati nel passaggio precedente. La posizione del polo cellulare può essere stimata approssimativamente disegnando mentalmente uno scafo convesso intorno alle localizzazioni a singola molecola appartenenti a una cella e selezionando il punto di curvatura più alta (Figura supplementare 4).
    2. Generare una funzione di trasformazione affine 2D utilizzando la funzione cp2tform in MATLAB e utilizzarla per generare una sovrapposizione approssimativa dei contorni delle cellule e delle localizzazioni a singola molecola.
    3. Eliminare le celle contenenti meno di 10 localizzazioni e rimuovere le celle posizionate parzialmente all'esterno del campo di visualizzazione. Eliminare manualmente eventuali celle indesiderate aggiuntive nella finestra popup facendo clic all'interno del contorno della cella (Figura supplementare 5 ).
    4. Utilizzare il centro di massa per tutti i contorni di celle rimanenti e le localizzazioni a singola molecola al loro interno per formare un insieme più ampio di coppie di punti di controllo, ricalcolare la funzione di trasformazione 2D e utilizzarla per generare una sovrapposizione finale dei contorni delle celle e localizzazioni a singola molecola.
    5. Assegnare le localizzazioni che si trovano all'interno del contorno di una cella delineare a tale cella. Eliminare tutte le localizzazioni che non si trovano all'interno di alcuna struttura di cella (Figura 2a, Figura supplementare 6).

6. Tracciamento a singola molecola

NOTA: la sezione seguente viene completata utilizzando software personalizzato in MATLAB. Questa sezione descrive i passaggi eseguiti dal software.

  1. Per le localizzazioni assegnate alla stessa cella e nei fotogrammi successivi della videocamera, calcolate la distanza euclidea tra le localizzazioni. Se la distanza tra le localizzazioni è al di sotto di una soglia di 2,5 m, collegare le localizzazioni assegnandole alla stessa traiettoria a singola molecola.
    NOTA: è importante considerare solo le localizzazioni all'interno di una singola cella, in modo che le localizzazioni nelle celle adiacenti che soddisfano i requisiti di soglia spaziale e temporale non siano collegate. La soglia di 2,5 m è stata scelta come distanza massima che una molecola molto veloce (30 m2/s) poteva percorrere per tutta la durata del tempo di esposizione (0,025 s) più un buffer del 20%.
  2. Scarta traiettorie più brevi di 4 localizzazioni. Se due o più localizzazioni (cioè due o più emettitori fluorescianti) sono presenti contemporaneamente in una cella, eliminare le traiettorie associate. L'impostazione della lunghezza minima della traccia su 4 localizzazioni consente di calcolare la media di diverse misurazioni della distanza, producendo una stima più accurata dei coefficienti di diffusione.
  3. Calcolare lo spostamento medio al quadrato (MSD) per una determinata traiettoria:
    Equation 1(1)
    dove N è il numero totale di localizzazioni nella traiettoria e xn è la posizione della molecola nel punto temporale n.
  4. Calcolare il coefficiente di diffusione apparente, d
    Equation 2(2)
    dove m è 2 o 3 è la dimensionalità della misura e il valore di z è il tempo di esposizione della fotocamera.
    NOTA: Un esperimento tipico produrrà 5.000-100.000 dollari di traiettorie in totale, con conseguente distribuzione apparente coefficiente di diffusione con quel numero di conteggi.

7. Simulazione Monte-Carlo del moto browniano in un volume limitato

NOTA: Creare librerie di distribuzioni di coefficienti di diffusione apparente simulata eseguendo simulazioni Monte Carlo di movimento browniano confinate in un volume cilindrico, utilizzando 64 valori compresi nell'intervallo di 0,05-20m2/s come parametri di input (software disponibili su richiesta dagli autori). Questa gamma è stata scelta per coprire la gamma di coefficienti di diffusione stimati in precedenza delle proteine fluorescenti (fusione) nei batteri. 64 coefficienti di diffusione sono utilizzati per campionare sufficientemente questa gamma. Questa sezione viene eseguita utilizzando software su misura in MATLAB e descrive i passaggi eseguiti automaticamente dal software. Le cellule Y. enterocolitica a forma di asta utilizzate qui sono approssimate da un volume cilindrico di lunghezza l - 5 m e diametro d .

  1. Avviare singole traiettorie in una posizione casuale nel volume cilindrico e simularne le fasi casuali di diffusione (ad esempio Brownian) utilizzando un intervallo di tempo di 100 ns (l'intervallo di tempo dovrebbe essere molto più breve del tempo di esposizione della telecamera per consentire un tempo sufficiente la posizione nel corso di una cornice della fotocamera). Assaggia ogni passo di spostamento per un ingresso D dalla funzione di distribuzione gaussiana corrispondente ricomponendoe l'Eqn. 2 e aggiungilo alla posizione precedente:
    Equation 3(3)
    in cui la funzione randn in MATLAB campiona un numero casuale da una distribuzione normale. Se un passo fa sì che la molecola venga spostata all'esterno del volume del cilindro, riflettere la molecola all'interno del cilindro con un angolo casuale.
  2. Per ogni intervallo di tempo, generare un'immagine DHPSF che corrisponde alla posizione istantanea x,y,z dell'emettitore simulato.
    1. Per soddisfare le condizioni sperimentali, simulare immagini contenenti 1.000 fotoni per localizzazione, con uno sfondo laser di 13 fotoni per pixel e il disturbo di Poisson. Inoltre, aggiungi l'offset scuro di 50 fotoni per pixel e il rumore di lettura gaussiano (1,5 fotoni), coerente con le misurazioni sperimentali della calibrazione della fotocamera. Infine, moltiplicare l'immagine per il guadagno dipendente dai pixel misurato sperimentalmente della fotocamera sCMOS per ottenere l'immagine in unità di conteggi del rivelatore.
      NOTA: Dopo queste manipolazioni, il rapporto segnale-rumore dell'immagine finale è di 2 USD.
    2. Genera immagini sfocate dal movimento che riflettano la mutevole posizione delle molecole sommando 50 immagini DHPSF simulate durante il tempo di esposizione utilizzato durante l'acquisizione di dati sperimentali. Per limitare le spese di calcolo, sono state scelte solo 50 posizioni campionate periodicamente per generare un'immagine (invece di tutte le 250.000 posizioni campionate durante un tempo di esposizione di 0,025 s ad un intervallo di campionamento di 100 ns).
      NOTA: la lunghezza (numero di fotogrammi) delle traiettorie simulate deve corrispondere alla lunghezza media delle traiettorie sperimentali. In questo caso, il numero di fotogrammi per traiettoria è 6.
  3. Genera 5.000 traiettorie per ciascuno dei 64 coefficienti simulati di diffusione dell'input.
  4. Analizzare i fotogrammi della fotocamera simulati come descritto nella sezione Elaborazione dati.
  5. Collegare le localizzazioni nelle traiettorie come descritto nella sezione Monitoraggio a singola molecola.
  6. Interpolare la funzione di distribuzione cumulativa (CDF) per ogni distribuzione simulata utilizzando l'interpolazione B-spline dell'ordine 25. Le distribuzioni interpolate sono necessarie per poter essere interrogate in punti arbitrari.
  7. Interpolare le curve B-spline risultanti lungo l'asse D(D è il vero coefficiente di diffusione non confinata che governa il movimento degli emettitori simulati) utilizzando la funzione scatteredInterpolant in MATLAB (specificare il ' metodo di interpolazione naturale). Ciò fornisce una funzione 2D continua da cui è possibile eseguire una query su qualsiasi distribuzione del coefficiente di diffusione apparente corrispondente a un valore di coefficiente di diffusione reale compreso nell'intervallo di 0,05-20 m2/s.

8. Raccordo di distribuzione coefficiente di diffusione apparente sperimentale

NOTA: Adattare distribuzioni misurate sperimentalmente di coefficienti di diffusione apparente utilizzando combinazioni lineari delle distribuzioni simulate generate nella sezione precedente (simulazione Monte-Carlo del moto browniano in un volume limitato). Questa sezione viene eseguita utilizzando software su misura in MATLAB e descrive i passaggi eseguiti automaticamente dal software. Per ulteriori informazioni ed esempi di applicazione, vedere Rocha etal.

  1. Eseguire un adattamento lineare limitato dei minimi quadrati (utilizzando la funzione lsqlin in MATLAB) del CDF sperimentale utilizzando una matrice campionata periodicamente di CF simulate dalla libreria creata nella sezione 7. L'output di questo passaggio è un vettore di parametro contenente i coefficienti di diffusione e le frazioni di popolazione degli stati diffusi prevalenti nella distribuzione sperimentale.
  2. Combinare gli stati diffusivi con i valori dei coefficienti di diffusione entro il 20% l'uno dell'altro in un unico stato diffuso in base alla media del peso in base alla frazione di popolazione relativa. Questo è il vettore di parametro iniziale.
    NOTA: per ridurre la complessità del modello, gli stati diffusivi con coefficienti di diffusione inferiori a 0,5 m2/s possono essere mantenuti costanti durante tutti i passaggi seguenti.
  3. Creare matrici di vettori di parametri di raccordo di prova con diversi numeri di stati diffusivi, che vanno da un singolo stato di diffusivo a un numero massimo di stati definito dall'utente.
    1. Utilizzando il vettore parametro iniziale, combinare gli stati diffusivi adiacenti attraverso la media ponderata e dividere gli stati diffusi in due stati con frazioni di popolazione uguali e coefficienti di diffusione del 20% sopra e sotto il valore originale. Ripetere l'operazione per tutte le possibilità di combinazione di stato e di suddivisione.
  4. Utilizzare ogni vettore di parametro di raccordo di prova per inizializzare un raccordo quadrato minimo non lineare di 5 sottoinsiemi separati di dati (utilizzando la funzione fmincon in MATLAB). Determinare la qualità dell'adattamento trovando la somma residua dei quadrati tra l'adattamento e la distribuzione corrispondente ai sottoinsiemi rimanenti (convalida incrociata dei dati).
  5. Utilizzare la somma residua media dei quadrati dei 5 raccordi separati per ogni vettore di prova come qualità complessiva della vestibilità, determinare il vettore di prova con la migliore qualità di adattamento per ogni numero di stati diffusivi.
  6. Determinare il numero ottimale di stati identificando il vettore di prova per il quale l'aggiunta di uno stato aggiuntivo non comporta un miglioramento di almeno il 5% della qualità della vestibilità.
  7. Utilizzare questo vettore di prova per inizializzare l'adattamento dei minimi quadrati non lineari del set di dati completo.
  8. Stimare l'errore per i singoli parametri ricampionando i dati eseguendo il bootstrap e il refitting con lo stesso vettore di prova.

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Representative Results

Nelle condizioni sperimentali qui descritte (20.000 fotogrammi, lunghezza minima di 4 localizzazioni) e a seconda dei livelli di espressione delle proteine di fusione fluorescenti, circa 200-3.000 localizzazioni che producono 10-150 le traiettorie possono essere generate per cella (Figura 2a,b). Un gran numero di traiettorie è necessario per produrre una distribuzione ben campionata di coefficienti di diffusione apparente. La dimensione del FOV qui raccolto è di 55 x 55 m, con 10 FOV raccolti per esperimento. Pertanto, per ottenere >5.000 traiettorie per esperimento ogni FOV deve contenere almeno 50 celle. Idealmente, la popolazione cellulare dovrebbe essere resa il più densa possibile, ma senza che le cellule si tocchino l'un l'altra. Se la densità delle celle è troppo alta, la presenza di celle toccanti o sovrapposte rende difficile segmentarle con successo utilizzando OUFTI(28), come descritto in Data Post Processing. Una segmentazione scadente può portare a localizzazioni e traiettorie assegnate in modo non corretto tra le celle.

Qui, presentiamo dati apparenti sul coefficiente di diffusione sulla proteina di secrezione Y. enterocolitica Tipo 3 YscQ, che abbiamo etichettato N-terminalmente con la proteina fluorescente eYFP. YscQ è un componente strutturale di una macchina molecolare che si estende a membrana, chiamata iniettorio. L'iniettore è composto da oltre 20 proteine diverse, molte delle quali sono presenti in più numeri di copia. Gli iniettori di secrezione di tipo 3 sono ampiamente utilizzati da batteri patogeni gram-negativi per fornire proteine eftori virulente direttamente nella cellula ospite durante l'infezione. YscQ si lega dinamicamente e si slega dal lato citosolico dell'iniettore. Di conseguenza, YscQ si trova anche liberamente diffondendo nel citosol. Applicando il protocollo di acquisizione, elaborazione e analisi dei dati descritto in precedenza, è stato determinato che YscQ non associato esiste in almeno 3 stati di diffusi distinti (Figura 3). Questi 3 stati diffusivi corrispondono a diversi complessi omo- ed etero-oligomerici di YscQ e altre proteine di secrezione di tipo 323.

Figure 1
Figura 1: Diagramma ottico delle vie del microscopio. Il microscopio ha un percorso per il rilevamento del segnale di fluorescenza e un percorso separato per scattare un'immagine di contrasto di fase. Un 'flip-mirror' motorizzato viene utilizzato per passare da un percorso all'altro. I rilevatori di telecamere, i laser di eccitazione, i LED e lo "flip-mirror" sono controllati in remoto dal computer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: localizzazioni e traiettorie a singola molecola. (A). Localizzazione a singola molecola di eYFP-YscQ in una cellula Y. enterocolitica ottenuta in diversi fotogrammi (1.766 localizzazioni). Le localizzazioni sono sovrapposte a un'immagine a contrasto di fase della cella. La linea verde indica il contorno della cella in base all'immagine di contrasto di fase. (B). Traiettorie 3D a singola molecola di eYFP-YscQ ottenute dalle localizzazioni mostrate nel pannello A (142 traiettorie). Colori diversi rappresentano diverse traiettorie a singola molecola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Adattamento della distribuzione coefficiente di diffusione apparente di eYFP-YscQ in Y. enterocolitica. L'apparente distribuzione del coefficiente di diffusione per eYFP-YscQ in Y. enterocolitca era più adatta a 3 stati diffusivi. Si noti che la funzione di densità di probabilità (PDF) è mostrata qui, mentre il raccordo dei dati è stato fatto adattando la funzione di distribuzione cumulativa (CDF, Experimental Apparent Diffusion Coefficient Distribution Fitting). Figura adattata da Rocha et al23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare Figura 1. GUI di controllo del microscopio. La GUI al microscopio controlla il micropositioner dello stadio, i laser di eccitazione, i LED e le telecamere per l'emissione di fluorescenza. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2. Interfaccia utente grafica facile da parte di DHPSF. Il software Easy-DHPSF viene utilizzato per estrarre localizzazioni a singola molecola dai segnali DHPSF. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3. Segmentazione di Oufti. Il software open source OUFTI28 viene utilizzato per sigillare le cellule. Qui, i risultati della segmentazione cellulare sono mostrati in verde. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4 . Selezione dei punti di controllo. Vengono selezionati cinque punti sia nei dati della struttura delle celle che nei dati di localizzazione. I poli della cella vengono utilizzati come punti di riferimento. Questi punti vengono utilizzati per trasformare i dati in modo che i contorni e le localizzazioni delle celle vengano sovrapposti correttamente. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5 . Eliminare le celle indesiderate. Dopo la sovrapposizione delle celle, le celle indesiderate vengono eliminate manualmente. Le celle con quantità insolitamente basse / elevate di localizzazioni devono essere eliminate, così come tutte le celle che si trovano ai margini del FOV. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6 . Sovrapposizione finale di contorni di celle e localizzazioni. Dopo la cancellazione delle cellule indesiderate, i contorni delle cellule e le localizzazioni a singola molecola vengono finemente trasformati per ottenere la sovrapposizione finale. Le localizzazioni all'esterno dei contorni delle celle vengono eliminate. Fare clic qui per scaricare questo file.

1: dati grezzi per una traiettoria a singola molecola. Esempio di rilevamento di eYFP-YscQ sulla telecamera sCMOS. Nel fotogramma 1 non è presente alcun segnale di fluorescenza. Nei fotogrammi 2-10, la fluorescenza viene rilevata da una singola molecola. In ogni fotogramma successivo, la posizione e l'orientamento del DHPSF cambiano, indicando la diffusione di questa molecola. Infine, nel fotogramma 11, c'è ancora una volta un'assenza di segnale di fluorescenza, che indica la fine della traiettoria. Ogni pixel è 108 x 108 nm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Supplementare Mov. 2: Dati grezzi per una traiettoria a singola molecola persa. I fotogrammi 1-3 mostrano il segnale di fluorescenza per un singolo emettitore. Tuttavia, i fotogrammi 4-6 mostrano la presenza di due DHPSF sovrapposti, che indicano la presenza di due emettitori nelle immediate vicinanze. In questi casi, i singoli DHPSF potrebbero non essere adattati correttamente a causa della loro sovrapposizione. Anche se entrambi i DHPSF sono in grado di adattarsi con successo, qualsiasi traiettoria osservata contenente queste localizzazioni verrebbe scartata. Due o più localizzazioni nella stessa cella possono portare a assegnazioni errate delle localizzazioni a una determinata traiettoria. Ogni pixel è 108 x 108 nm. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Un fattore critico per la corretta applicazione del protocollo presentato è quello di garantire che i segnali a singola molecola siano ben separati l'uno dall'altro (cioè, devono essere sparse nello spazio e nel tempo (Supplementary Mov. 1)). Se c'è più di una molecola fluorente in una cellula allo stesso tempo, la localizzazione potrebbe essere erroneamente assegnata alla traiettoria di un'altra molecola. Questo è indicato come il problema di collegamento30. Per evitare il problema di collegamento, è possibile scegliere condizioni sperimentali, come i livelli di espressione delle proteine e l'intensità laser dell'eccitazione. Tuttavia, occorre prestare attenzione a ottenere livelli di espressione proteica di tipo selvaggio per garantire risultati rappresentativi. Qui, abbiamo usato sostituzioni alleliche sotto il controllo dei promotori nativi invece di un'espressione chimicamente inducibile, per garantire livelli di espressione nativa delle proteine etichettate. Pertanto, l'intensità laser di eccitazione (per eYFP lampeggiante) o l'intensità laser di attivazione (per le sonde fluorescenti foto-attivabili) possono essere utilizzate per controllare la concentrazione di emettitori attivi nel tempo. In alternativa, quando l'etichettatura chimica dei tinri viene utilizzata in combinazione con i tag HALO e SNAP31,32, la concentrazione di tintura può essere ridotta fino a quando i segnali fluorescenti non sono sufficientemente scarsi da tracciare singole molecole33. Il protocollo qui presentato elimina ulteriormente il problema di collegamento scartando tutte le traiettorie per le quali due o più localizzazioni sono simultaneamente presenti nella stessa cella (Supplementary Mov. 2). Pertanto, se i segnali a singola molecola sono troppo densi, una grande quantità di dati viene automaticamente eliminata durante l'elaborazione. Nelle condizioni di eccitazione utilizzate in questa sede (514 nm a 350 W/cm2),abbiamo ottenuto 10-150 traiettorie per cellula batterica acquistando 20.000 fotogrammi nel corso di 8 min. D'altra parte, se si precano condizioni sperimentali in modo che i segnali a singola molecola siano scarsi, la velocità effettiva di acquisizione dei dati può essere bassa, in modo che l'ottenimento di un numero sufficientemente elevato di traiettorie a singola molecola richieda l'imaging ulteriori celle in altri campi di visualizzazione. L'acquisizione di un gran numero di traiettorie è utile, perché gli errori nei parametri adattati (i coefficienti di diffusione e le frazioni di popolazione) diminuiscono con l'aumentare del numero di traiettorie analizzatedi 29.

Il raggiungimento di un numero elevato di traiettorie a singola molecola richiede un'elevata velocità di acquisizione dei dati. Come tecnica a campo largo, la microscopia di localizzazione a singola molecola acquisisce dati per ogni cellula del FOV contemporaneamente, e i ricercatori hanno iniziato a sfruttare i nuovi rivelatori sCMOS che offrono grandi FOV26,34, 35. Tuttavia, le potenze laser di eccitazione di diversi Watt sono necessarie per ottenere intensità uniformi sufficienti per la microscopia di localizzazione a singola molecola in tali GRANDI FOV. Tali poteri laser possono essere al di sopra della soglia di danno delle lenti obiettivo disponibili in commercio. Gli array Lenslet impiegati per rendere uniformi le intensità laser di eccitazione nei FOV di grandi dimensioni possono essere in grado di aggirare questo problema34. Inoltre, le aberrazioni ottiche diventano pronunciate quando si crea un'immagine lontana dall'asse ottico. Di conseguenza, la forma del DHPSF può diventare troppo distorta per essere adattata con successo da un doppio modello gaussiano impiegato in DHPSF facile. Quando si crea immagini in un FOV ultra wide, sono necessari modelli PSF più sofisticati a variabili spaziari36. Per evitare questi fattori complicanti, i dati qui presentati sono stati acquisiti in un FOV relativamente piccolo (diametro , 55 m) e i dati provenienti da 10 FOV sono stati raggruppati per ottenere più di 75.000 traiettorie a singola molecola.

Il montaggio delle distribuzioni di coefficienti di diffusione apparente misurata sperimentalmente con distribuzioni simulate richiede una simulazione realistica dei dati sperimentali. Gli errori di localizzazione statici e dinamici nel tracciamento basato su fotocamera possono influire sulla qualità della misurazione11,13. Gli errori di localizzazione statica sono dovuti al numero finito di fotoni raccolti per emettitore di fluorescenza, che si traduce in una forma imprecisa di PSF e quindi si traducono in localizzazioni a singola molecola di precisione limitata2,37, 38.Gli errori di localizzazione dinamica sorgono a causa di emettitori in movimento che generano fPF sfocati39 . Quando viene applicato un algoritmo per adattarsi alla forma del PSF, le immagini sfocate dal movimento forniscono localizzazioni con precisione e precisione39. Nei casi più gravi di rapido movimento delle molecole, l'immagine può essere troppo distorta per adattarsi, con conseguente adattamento infruttuoso e quindi nessuna localizzazione registrata. La simulazione di FPF sfocati spazialmente con rapporti segnale-rumore realistici e la localizzazione con lo stesso algoritmo di adattamento dei dati sperimentali tiene conto sia dell'errore di localizzazione statica che di dinamico. In secondo luogo, le molecole che si difoncono rapidamente possono essere fortemente confinate a piccoli volumi, come il citosol di una cellula batterica. Di conseguenza, i coefficienti di diffusione apparente sono in media più piccoli di quelli previsti per il movimento non confinato. Il confinamento spaziale si traduce in uno spostamento generale a sinistra della distribuzione verso valori diffusivi più piccoli. È importante sottolineare che la forma della distribuzione non è più esprimibile come funzione analitica. Tenendo conto esplicitamente degli errori di localizzazione statici e dinamici dovuti agli effetti di sfocatura del movimento e al confinamento attraverso simulazioni stocastiche, è possibile ottenere distribuzioni realistiche23.

L'analisi di diffusione descritta si basa su due presupposti chiave per quanto riguarda il comportamento dinamico delle molecole nell'ambiente biologico. Si presume che gli stati diffusivi siano descritti dal moto browniano confinato e che non si interconvertano sulla scala cronologica di una traiettoria a singola molecola. Abbiamo verificato sperimentalmente che l'assunzione del moto browniano confinato è giustificata per la diffusione gratuita di eYFP in Y. enterocolitica23. Questi risultati sono in accordo con una serie di studi in varie specie batteriche che hanno stabilito che il movimento delle proteine citosoliche, proteine di fusione, e complessi biomolecolari più piccoli di 30 nm può essere descritto dal moto browniano18, 40,41,42,43,44,45. Le collisioni non specifiche di piccole proteine fluorescenti etichettate con altri componenti cellulari possono rallentare i tassi di diffusione,45,46 ma non portano a deviazioni dalla diffusione browniana. Al contrario, un'interazione specifica con i partner leganti cognati può produrre un cambiamento nel coefficiente di diffusione, come recentemente dimostrato per la proteina secrezione Y. enterocolitica Type 3 YscQ23. La validità della seconda ipotesi è difficile da valutare, soprattutto per i sistemi per i quali non sono noti né gli Stati diffusi né la cinetica vincolante. La situazione è ulteriormente complicata perché qualsiasi stato di oligomerizzazione e cinetica vincolante misurata in vitro, potrebbe non riflettere le strutture e le dinamiche che si verificano in vivo. Un recente studio teorico basato sul quadro di analisi qui presentato suggerisce che potrebbe essere possibile estrarre la cinetica di commutazione di stato oltre ai coefficienti di diffusione e alle frazioni di popolazione29.

In sintesi, presentiamo un protocollo integrato per risolvere gli stati diffusivi delle molecole fluorescenti basate su traiettorie a singola molecola misurate nelle cellule batteriche viventi. Come presentato qui, il protocollo viene applicato alla microscopia di localizzazione 3D a singola molecola utilizzando il PSF a doppia elica per l'imaging in Y. enterocolitica, un patogeno batterico. Tuttavia, con poche modifiche, il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di microscopia di localizzazione 2D o 3D a singola molecola e geometria del campione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Alecia Achimovich e Ting Yan per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Ed Hall, senior staff scientist del gruppo Advanced Research Computing Services presso l'Università della Virginia, per l'impostazione delle routine di ottimizzazione utilizzate in questo lavoro. I finanziamenti per questo lavoro sono stati forniti dall'Università della Virginia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

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References

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Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).

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