Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

3D enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi udnyttes til at sonde de rumlige positioner og bevægelses forløbskurver af fluorescently mærkede proteiner i levende bakterieceller. Den forsøgs-og dataanalyse protokol, der er beskrevet heri, afgør den udbredte åbne systemer opførsel af cytosolisk proteiner baseret på poolede enkelt molekyle forløbskurver.

Abstract

Enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi soner positionen og bevægelserne af individuelle molekyler i levende celler med snesevis af nanometer rumlige og millisekund temporale opløsning. Disse kapaciteter gør enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi ideelt egnet til at studere molekylært niveau biologiske funktioner i fysiologisk relevante miljøer. Her viser vi en integreret protokol for både erhvervelse og behandling/analyse af Single-molekyle tracking data til at udtrække de forskellige difpulsive stater et protein af interesse kan udstille. Disse oplysninger kan bruges til at kvantificere molekyle kompleksdannelse i levende celler. Vi leverer en detaljeret beskrivelse af et Kamerabaseret 3D-lokaliserings eksperiment med et enkelt molekyle samt de efterfølgende databehandlings trin, der giver de enkelte molekyler forløbskurver. Disse forløbskurver analyseres derefter ved hjælp af en numerisk analyseramme til at udtrække de fremherskende åbne systemer tilstande af fluorescently mærkede molekyler og den relative overflod af disse stater. Analyse strukturen er baseret på stokastiske simuleringer af intracellulære brownian diffusion-forløbskurver, der er rumligt afgrænset af en vilkårlig celle geometri. Baseret på de simulerede forløbskurver genereres og analyseres rå single-molekyle billeder på samme måde som eksperimentelle billeder. På denne måde er eksperimentelle præcisions-og nøjagtigheds begrænsninger, som er svære at kalibrere eksperimentelt, eksplicit indarbejdet i analyse arbejdsgangen. Diffusions koefficienten og den relative populations fraktion af de fremherskende åbne systemer tilstande bestemmes ved at montere distributionerne af eksperimentelle værdier ved hjælp af lineære kombinationer af simulerede fordelinger. Vi demonstrerer nytten af vores protokol ved at løse de åbne systemer tilstande af et protein, der udviser forskellige difpulsive tilstande ved at danne homo-og hetero-oligomeriske komplekser i cytosol af et bakterielt patogen.

Introduction

Ved at undersøge den difeksive opførsel af biomolekyler giver indsigt i deres biologiske funktioner. Fluorescens mikroskopi baserede teknikker er blevet værdifulde værktøjer til observation af biomolekyler i deres oprindelige cellemiljø. Fluorescens genfinding efter foto blegning (FRAP) og fluorescens korrelations spektroskopi (FCS)1 giver ensemble-gennemsnit diffusiv adfærd. Omvendt, enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi muliggør observation af individuelle fluorescently mærkede molekyler med høj rumlig og tidsmæssig opløsning2,3,4. Observere individuelle molekyler er fordelagtigt, da et protein af interesse kan eksistere i forskellige difpulsive stater. F. eks. opstår der to let skelnelige difspøse tilstande, når en transkriptional regulator, såsom CueR i Escherichia coli, spreder sig frit i cytosol eller binder sig til en DNA-sekvens og bliver immobiliseret på måle tidsskalaen5 . Single-molekyle tracking giver et værktøj til at observere disse forskellige stater direkte, og sofistikerede analyser er ikke forpligtet til at løse dem. Det bliver dog mere udfordrende at løse flere difpulsive tilstande og deres befolknings fraktioner i tilfælde, hvor deres difpulsive rater er mere ens. For eksempel, på grund af størrelsen afhængighed af diffusions koefficienten, forskellige oligomeriserings tilstande af et protein manifestere sig som forskellige diffusionsstater6,7,8,9 , 10. sådanne tilfælde kræver en integreret tilgang med hensyn til dataindsamling,-behandling og-analyse.

En kritisk faktor, der påvirker difpulsive rater af cytosolisk molekyler er effekten af indeslutning ved celle grænsen. Restriktionerne for molekyl bevægelse ved en bakteriecelle grænse bevirker, at en cytosolisk molekyle målte diffusionshastighed forekommer langsommere, end hvis der var forekommet samme bevægelse i et uafgrænset rum. For meget langsomt sprede molekyler, effekten af cellulær indespærring er ubetydelig på grund af manglende kollisioner med grænsen. I sådanne tilfælde kan det være muligt præcist at løse diffusions tilstande ved at montere Fordelingerne af molekylære forskydninger, reller tilsyneladende diffusionskoefficienter, D *, ved hjælp af analytiske modeller baseret på ligningerne for brownian motion ( tilfældig diffusion)11,12,13. Men for hurtig sprede cytosolisk molekyler, de eksperimentelle distributioner ikke længere ligner dem, der opnås for uindskrænket brune bevægelse på grund af kollisioner af sprede molekyler med cellegrænser. Der skal redegøres for indeslutning for at bestemme de uafgrænsede diffusions koefficienter for de fluorescentreret molekyler. Flere tilgange er for nylig blevet udviklet for at højde for indeslutning virkninger enten (semi-) analytisk 5,14,15,16 eller numerisk gennem Monte Carlo simuleringer af Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.

Her leverer vi en integreret protokol til indsamling og analyse af enkelt molekyle lokaliserings mikroskopi data med særligt fokus på sporing af enkelt molekyle. Det endelige mål med protokollen er at løse diffløse tilstande af fluorescently mærket cytosolisk proteiner inde, i dette tilfælde, stang formede bakterieceller. Vores arbejde bygger på en tidligere protokol for single-molekyle tracking, hvor en DNA Polymerase, PolI, viste sig at eksistere i en DNA-bundet og ubundet tilstand ved diffusion analyse20. Her udvider vi sporings analyser med et enkelt molekyle til 3D-målinger og udfører mere realistiske beregningsmæssige simuleringer for at løse og kvantificere flere åbne systemer tilstande, som samtidig findes i celler. Dataene er erhvervet ved hjælp af en hjem-bygget 3D super-resolution fluorescens mikroskop, som er i stand til at bestemme 3D-positionen af fluorescerende udledere ved billeddannelse med dobbelt-helix punkt-Spread-funktion (dhpsf)21,22. De rå single-molekyle billeder er behandlet ved hjælp af brugerdefinerede-skrevet software til at udtrække 3D enkelt-molekyle lokaliseringer, som derefter kombineres i enkelt-molekyle forløbskurver. Tusinder af forløbskurver samles for at generere fordelinger af tilsyneladende diffusions koefficienter. I et sidste trin, de eksperimentelle distributioner er egnet med numerisk genererede fordelinger opnået gennem Monte-Carlo simuleringer af Brunisk bevægelse i en begrænset volumen. Vi anvender denne protokol til at løse de åbne systemer tilstande af type 3 sekretions system protein yscq i levende Yersinia enterocolitica. På grund af sin modulære karakter, vores protokol er generelt gældende for enhver form for enkelt-molekyle eller single-partikel tracking eksperiment i vilkårlig celle geometrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dobbelt-helix punkt-Spread-funktion kalibrering

Bemærk: billeder beskrevet i dette og de følgende afsnit er erhvervet ved hjælp af en specialbygget inverteret fluorescens mikroskop, som beskrevet i Rocha et al.23. Den samme procedure er gældende for forskellige mikroskop implementeringer designet til enkelt-molekyle lokalisering og sporing mikroskopi2,3,4. Al software til billed erhvervelse og databehandling, der er beskrevet i denne artikel, er tilgængelig (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. Klargøring af agrose Pads til montering af prøver på glas dæksedler, der skal ses under mikroskop.
    1. Tilsæt 1,5-2% efter vægt lavt smeltepunkt agopstået til 5 mL M2G buffer (4,9 mM na2HPO4, 3,1 mm KH2po4, 7,5 mm NH4CL, 0,5 mm Mgso4, 10 μM FeSO4, 0,5 mm CaCl2 og 0,2% glucose). Mikrobølgeovnen i flere sekunder, indtil alle agopstået er opløst. Lad ikke opløsningen koge.
    2. Lad agrose opløsningen køle af i et par minutter (2-3 min).
    3. Der afpipetteres 600 μL agopstået opløsning på en glas dækseddel (22 mm x 22 mm). Anbring forsigtigt et andet glas cover på toppen af agatonen. Dette skaber en tynd (~ 0,5 mm) agrose gel pad mellem de to glas Cover glider.
    4. Lad agrose Pads sidde for at størkne i ~ 20 min.
    5. Adskil forsigtigt glas dæksedlen. Den agrose pad vil holde sig til en af dem.
    6. Ved hjælp af en barberkniv, skær agrose pad i fire firkantede sektioner af samme størrelse. Hver firkantet sektion kan bruges til en enkelt prøve.
  2. Afpipettér 1,5 μL fluorescerende perle opløsning på én agrose pad. Perle opløsning er en 1/100000 fortynding af stamopløsningen i M2G (Se tabel over materialer).
  3. Vend agrose puden om, og Placer den på en glas dækseddel, der er blevet rengjort i en ozon renser i 30 minutter. Rengøringstiden er valgt for at eliminere fluorescerende molekyler, der klætter til dæksedlerne.
  4. Monter prøve dækglasset på prøveholderen på et inverteret fluorescens mikroskop, og Fastgør det på plads ved hjælp af klæbebånd eller fjederbelastede prøveholder clips.
  5. Tilsæt en dråbe nedsænkning olie på mikroskopet mål.
  6. Anbring prøveholderen på et mikroskop, og fastgør den på plads.
  7. Initialiser den grafiske brugergrænseflade (GUI) for at styre mikroskopet kamera, prøve fase og excitation lasere. Her bruges Custom-skrevet software i MATLAB til instrument kontrol (supplerende figur 1).
  8. Initialiser kameraets software HCImage live. Indstil eksponeringstid til 0,03 s under fanen Optag under afsnittet kamera kontrol . Klik på Live for at starte et live feed af kameraet.
  9. Tænd for laseren ved at klikke på Open 514 nm laser på GUI-grænsefladen for at ophidse de fluorescerende perler på pad og få vist fluorescens emission på kameraet ved hjælp af live-stream-tilstand (dvs. ingen data gemt på disken).
  10. Juster X-og Y-positionen for mikroskopet ved at klikke på pilene ' XY-pos ' under afsnittet ' mikro-positionerings fase ' i GUI for at placere mindst én fluorescerende perle i midten af synsfeltet (FOV). Trin størrelsen kan ændres ved at klikke på rullelisten under pilene.
  11. Juster placeringen af mikroskopet i mikroskop ved at klikke på z-pos pilene under afsnittet Nano-POSITIONERINGS fase i GUI. Indstil retningen af dobbelt-helix punkt-Spread-funktionen (DHPSF) af den fluorescerende perle til at være lodret. Denne lodrette orientering er defineret som udgangspunktet i Z-kalibreringen. Trin størrelsen kan ændres ved at klikke på rullelisten under pilene.
  12. I HCImage Live, under Capture | Udløser tilstande, hastighed og registrering, skal du ændre udløser tilstanden fra internt til eksternt niveau udløser. Dette vil gøre det muligt for MATLAB GUI at styre kameraet.
  13. Under sekvens | Scanningsindstillinger, skal du ændre antallet af billed tællinger til 1200. Vælg en Gem destinationsmappe ved at klikke på knappen mærket .... Endelig Klik på Start. Antallet af ramme optællinger er indstillet til 1200 , så der kan indsamles 10 billeder for hver 120 Z-positions trin.
  14. Scan gennem en række Z-positioner (30 trin over og under start Z-positionen i 50 nm-intervaller), og Optag 10 billeder ved hvert trin ved hjælp af en eksponeringstid på 0,03 s. Begynd den automatiserede proces ved at klikke på gå under afsnittet Z-kalibrering GUI.
    Bemærk: parametrene for kalibreringen, herunder trin længde, antal trin, kameraets eksponeringstid og antallet af billeder pr. trin, kan også justeres her. Omkring 105 fotoner kan erhverves fra en fluorescerende perle i en enkelt ramme ved hjælp af 0,03 s eksponeringstider resulterer i x, y, z lokalisering præcision på omkring 1 nm.
  15. Sluk for laser belysningen ved at klikke på luk 515 nm laser i GUI. I HCImage Live, under Capture | Udløser tilstande, hastighed og registrering, skal du ændre udløser tilstanden tilbage til intern. Under sekvens | Scanningsindstillinger ændrer antallet af ramme optællinger til 200. Vælg en Gem destinationsmappe ved at klikke på knappen mærket .... Klik på Start for at samle 200 billeder af mørke billeder med en 0,03 s eksponeringstid.
    Bemærk: selv i fravær af lys, der falder på detektoren, vil hver pixel læse et positivt tal (kaldet den mørke forskydningsværdi), som kan variere lidt mellem pixels. Den mørke forskydningsværdi kan ændre sig med tiden. Derfor er det nødvendigt at indsamle mørke rammer for hver kalibrering.
  16. Monter DHPSF med en dobbelt-Gaussian model ved hjælp af Easy-DHPSF software24 for at opnå X og Y positioner af perlen, samt en vinkel vs. Z kalibreringskurve.
    1. Initialiser Easy-DHPSF-software i MATLAB. Under Opsætningskal du indstille kanal til G og indstille tilpasningsmetode til MLE med DG-model. G refererer til den grønne kanal kamera, som det fluorescerende protein, der anvendes til dataindsamling udsender med grønne bølgelængder. MLE med DG model refererer til maksimal sandsynlighed skøn med dobbelt-Gaussian model.
      Bemærk: pixelstørrelsen og konverterings Gevinsten afhænger af den specifikke optiske opsætning og skal muligvis ændres.
    2. Klik på Kørunder afsnittet Kalibrer dhpsf . Klik på OK i følgende pop op-vindue for at beholde standardindstillingerne.
    3. Vælg den billedstak, som er gemt i trin 1.13-1.14. Vælg derefter billed stakken med den mørke baggrund, som er gemt i trin 1,15. Endelig skal du vælge den. txt-fil, der blev gemt automatisk under trin 1,14. Denne fil indeholder den Z-position af scenen i hele scanningen.
    4. I det næste pop op-vindue, hvis den fulde kamera chip ikke blev brugt til synsfeltet, input start x0 og y0 positioner på chippen. Ellers input x0 = 1 og y0 = 1. disse oplysninger kan findes i HCImage Live under Binning og SubArrary sektion.
    5. I det følgende vindue skal du ændre størrelsen på og flytte boksen, der vises over billedet af de fluorescerende perler, så den er ca. 100 x 100 pixels i størrelse og centreret over et enkelt fluorescerende DHPSF-signal. Dobbeltklik derefter for at fortsætte.
      Bemærk: de valgte DHPSF bør isoleres fra de andre DHPSF-signaler og ideelt set være den lyseste perle.
    6. Klik i midten af DHPSF-signalet, mellem de to lapper, og tryk derefter på Enter. Følgende vindue viser en zoomet-i betragtning af de valgte DHPSF. Mere præcist vælge placeringen af midten af DHPSF ved at klikke.
      Bemærk: programmet vil derefter passe til DHPSF, og vise RAW-billedet og genopbygningen fra fit. Det vil også output skabelon billeder fra Z kalibrering svarende til en DHPSF tværsnit på forskellige Z positioner. Disse vil blive brugt senere til montering af de eksperimentelle data. Programmet vil udsende X-, Y-og Z-positionen anslået i hver ramme. I et godt justeret optisk system, X og Y bør ændre meget lidt (~ 30 nm afvigelse) som Z position ændringer. Hvis output variationen er større end 30 nm, skal fase masken, der er placeret i billed systemets Fourier-plan (figur 1), justeres, og trin 1.9-1.16 gentages.
    7. Gem Easy-DHPSF GUI ved at klikke på Gem ikonet i øverste venstre hjørne af GUI. Dette kan senere indlæses ved at klikke på Load -ikonet i GUI.
      Bemærk: Z-kalibreringsproceduren skal udføres på hver dag i et eksperiment for at tilpasse ændringer i mikroskopet, som kan være opstået på grund af temperaturudsving eller mekaniske vibrationer.

2. forberedelse af bakteriel kultur

  1. Forbered kultur medier, som understøtter bakteriecelle vækst. For Y. enterocoliticaanvendes 5 ml BHI (Hjernehjertets infusion) bouillon indeholdende nalidixinsyre (35 μg/ml) og 2, 6-diaminopimelisk syre (80 μg/ml). Her anvendes en Y. enterocolitica stamme, der har proteinet YscQ mærket med fluorescerende protein eyfp23.
  2. Inokulere medier med bakterielle kulturer fra fryselagre eller plade kulturer.
  3. Dyrk kulturen ved 28 °C med omrystning natten over.
  4. Der fortyndes en lille mængde (~ 250 μL) af mættet natkultur til 5 mL ved hjælp af friske kultur medier.
  5. Dyrk kulturen ved 28 °C med omrystning i 60-90 min.
  6. Inducerer ekspression af fluorescerende fusionsprotein. For Y. enterocoliticaopvarmes cellerne til 37 °c i en vand shaker for at inducere yop regulon.
  7. Cellerne inkubates i yderligere 3 timer ved 37 °C ved omrystning.
  8. 1 mL kultur centrifugeres på 5.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
  9. Du vasker pellet 3 gange med 1 mL M2G medier.
  10. Re-suspendere de foderpiller bakterier i ~ 250 μl af M2G medier.
  11. Tilsæt fluorescerende perler som fiducial markører. Fluorescerende perle opløsning bør tilsættes i passende fortyndede mængder, således at der kun er 1-2 perler per FOV, når de ses i mikroskopet.
  12. Pipette eller vortex forsigtigt suspensionen for at adskille aggregerede celler.
  13. Plade 1,5 μL suspension på en 1,5-2% agopstået pad lavet med M2G.
  14. Vend agrose pad om, og Placer den på et ozon renset mikroskop Cover-slip. Dæksedlen skal anbringes i en ozon renser i 30 minutter for at reducere enhver iboende fluorescens baggrund.

3. data indsamling

  1. Monter prøve dækglasset på prøveholderen på et inverteret fluorescens mikroskop, og Fastgør det på plads ved hjælp af klæbebånd eller fjederbelastede prøveholder clips.
  2. Tilsæt en dråbe nedsænknings olie på mikroskopet, og Anbring prøveholderen på mikroskop og fastgør den på plads.
  3. Initialiser grafisk brugergrænseflade (GUI) for at styre mikroskopet kamera, prøve fase og excitation lasere. Her bruges Custom-skrevet software i MATLAB til instrument kontrol.
  4. Initialiser kamera software HCImage live. Indstil eksponeringstid til 0,025 s under fanen Optag under afsnittet kamera kontrol . Klik på Live for at starte et live feed af kameraet.
  5. Juster X-og Y-positionerne for mikroskopet ved at klikke på XY-pos pilene under afsnittet mikro-POSITIONERINGS fase i GUI for at scanne rundt i prøven og finde en FOV med en passende tæt population af bakterieceller.
    Bemærk: for at maksimere dataoverførselshastigheden skal cellerne være så tætte som muligt uden at overlappe eller røre ved celler. FOV bør også omfatte mindst 1 fluorescerende perle, der skal anvendes som en fiducial markør, fortrinsvis placeret i et hjørne af FOV.
  6. Justér z-positionen for mikroskopet ved at klikke på z-pos pilene under Nano-positionerings fasen af GUI, således at fluorescerende vulst-dhpsf-lapper er lodrette.
  7. Under sekvens | Scanningsindstillinger, skal du ændre antallet af billed tællinger til 20.000. Vælg en Gem destinationsmappe ved at klikke på knappen mærket .... Endelig skal du klikke på Start for at samle op til 20.000 kamera rammer ved hjælp af en kort eksponeringstid på 0,025 s. eyfp photoblink initieres ved hjælp af højintensiv excitation Light ved 514 nm19,25.
    Bemærk: her anvendes en laser intensitet på ~ 350 W/cm2 ved brændplanet til Initial blegning og efterfølgende billeddannelse af enkelt-eyfp-molekyler. Der blev ikke anvendt fotoaktivering af eYFP-molekyler ved UV-bølgelængder under billeddannelse. Der bør højst være et enkelt molekyle signal pr. bakteriecelle. Hvis tætheden af et enkelt molekyle signal er for høj i første omgang, skal du fortsætte med at belyse, indtil der opstår tilstrækkelig foto blegning, før dataindsamlingen påbegyndes.
  8. Sluk for laser belysningen ved at klikke på luk 515 nm laser i GUI. Saml 200 billeder af mørke billeder med den samme eksponeringstid.
  9. I GUI skal du markere feltet ved siden af Thorlabs led og klikke på Skift spejl op. Dette vil skifte vejen fra fluorescens vejen til fasekontrast vejen.
  10. Initialiser dataindsamlingen software IC Capture 2,4. Dette styrer kameraet i fasekontrast vejen. Tryk på knappen Start/stop Live display for at få vist et live feed fra kameraet. Klik på Optag | Gem billede for at indsamle et fasekontrast billede af cellerne i synsfeltet.
  11. Gentag trin 3.5-3.10 for yderligere FOVs. Her, data erhvervet fra ~ 500 bakterielle celler i ti forskellige FOVs bruges til at øge antallet af enkelt-molekyle forløbskurver til rådighed for analyse.
    Forsigtig: celler monteret på agrose Pads i lange perioder kan opføre sig anderledes end nymonterede celler. Desuden kan agrose pad miste sin integritet efter et stykke tid, hvilket kan påvirke datakvaliteten negativt. Typisk, højst 3 FOV (~ 30 min på mikroskopet) anvendes pr prøve slide.

4. data behandling

Bemærk: en modificeret version af Easy-DHPSF software24 bruges i MATLAB til analyse af RAW kamera rammer til at udtrække enkelt-molekyle lokaliseringer. Easy-DHPSF anvendes specifikt til at montere DHPSF-lokaliseringer i et enkelt molekyle billede. Brugerdefinerede ændringer blev foretaget for at implementere maksimal sandsynlighed estimering (MLE)-baseret fitting rutine, der tegner sig for pixel-afhængige støj egenskaber af moderne sCMOS kameraer26. Det blev også ændret til at acceptere billedet filtype output fra HCImage Live-programmet (. dcimg). For en mere detaljeret forklaring af softwaren og de enkelte trin, se venligst Lew et al.24

  1. Initialiser Easy-DHPSF GUI i MATLAB (supplerende figur 2). Indlæsning i filen gemt i trin 1.16.8.
  2. Fastlæggelse af tærskelværdier for hver af de 7 skabeloner output i trin 1.16.7
    1. Klik på Kørunder afsnittet kalibrering af SM-identifikation . Klik på OK i følgende to pop op-vinduer for at beholde standardindstillingerne.
    2. Åbn den billedstak, der indeholder dataene fra den første FOV, når du bliver bedt om det.
    3. Vælg et lille udvalg af rammer, der passer til skabelonerne. Typisk rammer 1001-2000 bruges til at undgå tætte overlappende signaler i de første flere hundrede rammer. Klik på OK i følgende pop op-vindue for at beholde standardindstillingerne. Klik på Annuller , når du bliver bedt om sekvens logfilen i det følgende vindue.
    4. Åbn billed stakken med den mørke baggrund, som blev gemt i trin 3,8. Klik på "OK" i følgende pop op-vindue for at lade parametrene for baggrunds estimatet være indstillet til standard. Standarden er at estimere baggrunden ved hjælp af et median filter27 , der dækker 100 efterfølgende kamera rammer omkring det aktuelle billede.
    5. I det næste vindue skal du ændre størrelsen på boksen, der er overlagt på billedet, for at dække hele FOV, og derefter dobbeltklikke for at fortsætte.
    6. Definer interesseområdet ved at klikke på flere punkter på billedet for at oprette en polygon. Regionen af interesse bør omfatte så meget af synsfeltet som muligt, samtidig med at sikre, at eventuelle fluorescerende perler (meget lyse objekter) i billedet ikke lå inden for polygonen, så Dobbeltklik for at fortsætte.
      Bemærk: softwaren vil derefter forsøge at matche skabelonerne til billedet, og vil vise et billede med mulige kampe cirklede.
    7. Når softwaren er stoppet, vil det spare mange billeder af fundne skabelon kampe og vise den tilsvarende tærskelværdi i en foruddefineret mappe. En højere tærskelværdi svarer til en bedre match. For hvert skabelonnummer, undersøge eksemplet kampe og bestemme den laveste tærskel, der udviser et billede af en DHPSF. Input disse tærskler for hver af de 7 skabeloner under kalibrere SM identifikation sektion i Easy-DHPSF GUI.
      Bemærk: programmet vil forsøge automatisk at vælge og input tærskler, men disse er ofte upålidelige og bør kontrolleres manuelt. Tærskler er valgt således, at få sande single-molekyle signaler er savnet, men antallet af falske positive kandidater til montering forbliver beregningsmæssigt håndterbare.
    8. Gem Easy-DHPSF GUI igen ved at klikke på Gem -ikonet i øverste venstre hjørne.
  3. Montering af fluorescerende perle i FOV til brug som en fiducial markør
    1. Klik på Kørunder afsnittet spor hos tilsynsførende i GUI-Easy-dhpsf. Klik på OK i følgende to pop op-vinduer for at beholde standardindstillingerne.
    2. Træk boksen overlagt på billedet og centrere den over DHPSF-signalet fra den fluorescerende perle, og dobbeltklik derefter.
    3. Klik i midten af DHPSF-signalet, på midtpunktet mellem de to lapper, og tryk derefter på ENTER. Klik på Annuller , når du bliver bedt om sekvens logfilen i det følgende vindue.
      Bemærk: softwaren vil passe til DHPSF i alle kamera rammer, og vise RAW-billedet og det rekonstruerede billede. Når softwaren er færdig, det vil output tal med X, Y, og Z positioner af fluorescerende perle i løbet af varigheden af billedet erhvervelse.
    4. Markér feltet ud for Brug hos tilsynsførende og Gem Easy-dhpsf GUI igen ved at klikke på Gem ikonet i øverste venstre hjørne.
  4. Find og tilpas alle lokaliseringer i alle kamera rammer ved hjælp af de skabelon tærskler, som er opnået i trin 4,2.
    1. Under afsnittet Localize Dhpsf SMS i Easy-DHPSF GUI skal du klikke på Kør. Klik på OK i følgende pop op-vinduer for at beholde standardindstillingerne. Klik på Annuller , når du bliver bedt om sekvens logfilen i det følgende vindue.
      Bemærk: softwaren vil finde og montere DHPSF ved hjælp af en dobbelt-Gaussian model, hvis kvaliteten af kampen er over den brugerdefinerede tærskel. Det vil vise RAW-billedet med cirkler omkring skabelon kampe samt et billede af de rekonstruerede DHPSF passer.
    2. Gem Easy-DHPSF GUI igen ved at klikke på Gem -ikonet i øverste venstre hjørne.
  5. Visning af et enkelt molekyle lokaliseringer og filtrering af uønskede eller upålidelige lokaliseringer
    1. Klik på Filtrer outputunder afsnittet output dhpsf SM-lokaliseringer .
    2. Klik på OK i de følgende tre vinduer for at udføre en interpolation af de fiducial X-, Y-og Z-positioner over tid. I de fleste tilfælde er standardindstillingerne tilstrækkelige. Hvis den sorte interpolerede linje ikke afspejler en fornuftig interpolation af den røde positions linje, kan du ændre interpolations parametrene i pop op-vinduet.
      Bemærk: den interpolerede linje bruges til fase-drift korrigere enkelt-molekyle lokaliseringer.
    3. Åbn det tilsvarende fasekontrast billede for FOV, der analyseres, når du bliver bedt om det. Klik på OK i følgende to pop op-vinduer for at beholde standardindstillingerne.
    4. I de følgende to pop op-vinduer skal du ændre filterværdierne for at tillade mere strenge eller mere lempelige krav til lokalisering af et enkelt molekyle og derefter klikke på OK.
    5. I det vindue, der vises, skal du trække eller ændre størrelsen på boksen overlagt på billederne for at få vist den ønskede interesseregion og dobbeltklikke for at fortsætte.
    6. En 3D-rekonstruktion af enkelt-molekyle-lokaliseringer vises. Brug figuren værktøjer til at manipulere genopbygningen (rotere, zoom, osv.). Klik på Fortsæt for at få vist en anden dialogboks, hvor du bliver spurgt,om du vil af med et andet parametersæt? Klik på Nej, hvis resultaterne er tilfredsstillende. Hvis de ikke er det, skal du klikke på Ja.
      Bemærk: de almindelige årsager til utilfredsstillende resultater omfatter det fasekontrast billede, der ikke er korrekt overlagt med lokaliseringsdataene, eller de første skabelon tærskler var for lave og skabte mange falske positive lokaliseringer. Hvis Ja er valgt, vil softwaren vende tilbage til trin 4.5.4, så der kan defineres nye parameterværdier. Hvis Nej blev valgt, vil resultaterne blive gemt.

5. data efter behandling

  1. Ved hjælp af brugerdefineret software i MATLAB beskærer du billedet af fase kontrasten, så kun det område, der indeholder celler, der er afbildet under fluorescens mikroskop, forbliver. Dette trin er nødvendigt, fordi billedet af fase kontrasten dækker et område, der er meget større end fluorescens billedet. Beskæring af billedet forenkler det næste trin.
  2. Segmentér individuelle celler ved at behandle fasekontrast billedet med OUFTI28 -softwaren (supplerende figur 3)
    1. Initialiser OUFTI i MATLAB. Indlæs det beskårne fasekontrast billede fra forrige trin ved at klikke på belastningsfase.
    2. Klik på filer for at vælge og navngive en gemme placering for outputfilen.
    3. Vælg uafhængige rammer under overskriften registrering og analyse .
    4. Klik på Indlæs parametre for at indlæse parametre for celle registrering. Eksempler på parametre omfatter acceptabelt celleområde, cellebredde og en celledelings tærskel.
      Bemærk: alle disse parametre skal justeres for at maksimere ydeevnen for de specifikke cellestørrelser og billedkvalitet, der anvendes. Vigtigst er det, at algoritmen parameter skal indstilles til subpixel for at give mulighed for præcis måling af celle konturer.
    5. Klik på denne ramme for at begynde celle segmentering. Celle konturer vises over fasekontrast billedet, når processen er færdig.
    6. Brug kontrolelementerne under afsnittet Manuel , Opdel celler, Tilføj celler, eller Juster celle konturer for at opnå konturer for celler, der er blevet segmenteret upræcist under den automatiserede proces.
    7. Uddata celle konturer ved at klikke på Gem analyse.
  3. Brug Custom-skrevet software i MATLAB til præcist overlay konturerne opnået i det foregående trin med enkelt-molekyle lokaliseringer. De følgende under trin detaljeret trinene i softwaren.
    1. Vælg manuelt 5 kontrolpunkts par i pop op-vinduet ved at anslå og klikke på placeringen af celle polerne i de samme fem celler i både lokaliseringsdata og celle konturer med et enkelt molekyle, der genereres i det foregående trin. Celle stavens position kan groft anslås ved mentalt at tegne et konveks skrog omkring de enkelt-molekyle lokaliseringer, der tilhører en celle og vælge punktet af højeste krumning (supplerende figur 4).
    2. Generer en 2D kryb stjerne transformation funktion ved hjælp af funktionen cp2tform i MATLAB og bruge den til at generere en grov overlay af celle konturer og enkelt-molekyle lokaliseringer.
    3. Slet celler, der indeholder færre end 10 lokaliseringer, og fjern celler, der er placeret delvist uden for feltvisningen. Manuelt slette eventuelle yderligere uønskede celler i pop-up-vinduet ved at klikke inde i deres celle kontur (supplerende figur 5).
    4. Brug midten af massen for alle resterende celle konturer og enkelt-molekyle lokaliseringer i dem til at danne et større sæt af kontrolpunkt par, re-beregne 2D transformation funktion, og bruge det til at generere en endelig overlay af celle konturer og enkelt-molekyle lokaliseringer.
    5. Tildel lokaliseringer, der er placeret inden for kanten af en celle, der er kontur til cellen. Kassér eventuelle lokaliseringer, som ikke er placeret i nogen celle kontur (figur 2a, supplerende figur 6).

6. sporing af enkelt molekyle

Bemærk: følgende afsnit er udfyldt med brugerdefineret software i MATLAB. I dette afsnit beskrives de trin, softwaren udfører.

  1. For lokaliseringer, der er tildelt den samme celle og i efterfølgende kamera rammer, beregnes den euklidiske afstand mellem lokaliseringer. Hvis afstanden mellem lokaliseringer er under en tærskel på 2,5 μm, link lokaliseringer ved at tildele dem til den samme enkelt-molekyle bane.
    Bemærk: det er vigtigt kun at overveje lokaliseringer i en enkelt celle, så lokaliseringer i tilstødende celler, der tilfældigvis opfylder de rumlige og tidsmæssige tærskel krav, ikke er forbundet. Tærsklen på 2,5 μm blev valgt som den maksimale afstand et meget hurtigt molekyle (30 μm2/s) kunne rejse i længden af eksponeringstid (0,025 s) plus en 20% buffer.
  2. Bortskaf forløbskurver, som er kortere end 4 lokaliseringer. Hvis to eller flere lokaliseringer (dvs. to eller flere fluorescerende emittere) samtidig er til stede i en celle, kasseres de tilhørende forløbskurver. Indstilling af spor længde minimum til 4 lokaliseringer gør det muligt at gennemsnit flere afstandsmålinger, hvilket giver et mere nøjagtigt estimat af diffusions koefficienterne.
  3. Beregn den gennemsnitlige kvadrerede forskydning (MSD) for et givet forløb ved at:
    Equation 11
    hvor N er det samlede antal lokaliseringer i bane og xN er placeringen af molekylet på tidspunkt N.
  4. Beregn den tilsyneladende diffusions koefficient, D * ved
    Equation 22
    hvor m = 2 eller 3 er dimensionaliteten af målingen, og Δt er kameraets eksponeringstid.
    Bemærk: et typisk eksperiment vil producere ~ 5000-100000 forløbskurver i alt, hvilket resulterer i en tilsyneladende diffusion koefficient fordeling med, at mange tæller.

7. Monte-Carlo simulering af brun bevægelse i en begrænset mængde

Bemærk: Opret biblioteker med simulerede tilsyneladende sprednings koefficient fordelinger ved at udføre Monte Carlo simuleringer af brownian motion begrænset til en cylindrisk volumen, ved hjælp af 64 værdier i intervallet 0,05-20 μm2/s som inputparametre (software kan fås fra forfatterne efter anmodning). Dette sortiment blev valgt til at dække intervallet af tidligere estimerede diffusions koefficienter for fluorescerende (fusion) proteiner i bakterier. 64 diffusions koefficienter anvendes til at udtage et tilstrækkeligt udsnit af dette område. Dette afsnit udføres ved hjælp af brugerdefineret software i MATLAB og beskriver de trin, som softwaren automatisk tager. De stang formede Y. enterocolitica -celler, der anvendes her, tilnærmede en cylindrisk volumen længde l = 5 μm og diameter d = 0,8 μm.

  1. Påbegynd individuelle baner ved en tilfældig position i det cylindriske volumen, og simulerer deres tilfældige (dvs. brune) diffusions trin ved hjælp af et tidsinterval på 100 NS (tidsintervallet skal være meget kortere end kameraets eksponeringstid for at muliggøre tilstrækkelig stikprøveudtagning af positionen i løbet af en kamera ramme). Prøve hvert forskydnings trin for et input D fra den tilsvarende Gaussian fordelingsfunktion ved omorganisering af EQN. 2 og Føj det til den forrige position:
    Equation 33
    hvor randn funktion i MATLAB prøver et tilfældigt tal fra en normal fordeling. Hvis et trin får molekylet til at blive fordrevet uden for volumenet af cylinderen, afspejle molekylet tilbage inde i cylinderen i en tilfældig vinkel.
  2. For hvert tidsinterval skal du generere et DHPSF-billede, der svarer til den øjeblikkelige x-, y -og z-position for den simulerede emitter.
    1. For at matche eksperimentelle forhold, simulere billeder, der indeholder 1.000 fotoner pr. lokalisering, med en laser baggrund på 13 fotoner pr. pixel og Poisson-støj. Hertil kommer, at tilføje mørk offset på ~ 50 fotoner pr pixel og Gaussian læse støj (σ ~ 1,5 fotoner), i overensstemmelse med eksperimentelle kamerakalibrering målinger. Endelig multipliceres billedet med den eksperimentelt målte pixel afhængige gevinst af sCMOS-kameraet for at opnå billedet i enheder af detektor tæller.
      Bemærk: efter disse manipulationer er signal-til-støj forholdet for det endelige billede ~ 2.
    2. Generer bevægelses udviskede billeder, der afspejler molekylernes skiftende position ved at sammenlægge 50 DHPSF-billeder simuleret under den eksponeringstid, der anvendes under eksperimentel dataindsamling. For at begrænse udgifterne til beregning blev kun 50 periodisk udtagne positioner valgt til at generere et billede (i stedet for alle 250.000 positioner udtaget under en 0,025 s eksponeringstid ved et prøvetagningsinterval på 100 NS).
      Bemærk: længden (antallet af rammer) af simulerede forløbskurver skal svare til den gennemsnitlige længde af eksperimentelle forløbskurver. I dette tilfælde er antallet af frames pr. bane 6.
  3. Generer 5.000 forløbskurver for hver af de 64 simulerede indgangs diffusions koefficienter.
  4. Analysér simulerede kamera rammer som beskrevet i afsnittet data behandling .
  5. Sammenkæd lokaliseringer med forløbskurver som beskrevet i afsnittet sporing af enkelt molekyle .
  6. Interpolere den kumulative fordelingsfunktion (CDF) for hver simuleret fordeling ved hjælp af B-spline interpolation af ordre 25. Interpolerede fordelinger er nødvendige, så de kan forespørges på vilkårlige punkter.
  7. Interpolere den resulterende B-spline kurver langs d-aksen (d er den sande uindskrænket diffusions koefficient, der regulerer bevægelsen af de simulerede emittere) ved hjælp af Scatteredinterpolant funktion i MATLAB (Angiv ' naturlig» interpolationsmetode «). Dette giver en kontinuerlig 2D-funktion, hvorfra enhver tilsyneladende fordelingskoefficient fordeling svarende til en sand diffusions koefficient værdi i intervallet 0,05-20 μm2/s kan forespørges.

8. eksperimentel tilsyneladende diffusions koefficient fordeling montering

Bemærk: Tilpas eksperimentelt målte fordelinger af tilsyneladende diffusions koefficienter ved hjælp af lineære kombinationer af de simulerede fordelinger, der genereres i det foregående afsnit (Monte-Carlo simulation af brunligt bevægelse i en begrænset mængde). Dette afsnit udføres ved hjælp af brugerdefineret software i MATLAB og beskriver de trin, som softwaren automatisk tager. Du kan finde flere oplysninger og eksempler på anvendelse i Rocha et al.29

  1. Udfør en begrænset lineær mindste kvadraters pasform (ved hjælp af lsqlin -funktionen i MATLAB) i den eksperimentelle CDF ved hjælp af en periodisk afprøvet matrix af simulerede cdf'er fra biblioteket oprettet i afsnit 7. Produktionen af dette trin er en parameter vektor, der indeholder diffusions koefficienterne og befolknings fraktioner af udbredte åbne systemer tilstande i forsøgs distributionen.
  2. Kombiner åbne systemer tilstande med diffusions koefficient værdier inden for 20% af hinanden i en enkelt diffusions tilstand efter vægt gennemsnit baseret på relativ populations fraktion. Dette er startparameter vektor.
    Bemærk: for at reducere kompleksiteten af modellen kan diffusions tilstande med sprednings koefficienter under 0,5 μm2/s holdes konstante under alle de følgende trin.
  3. Opret arrays af prøve tilpasning parameter vektorer med forskellige numre af åbne systemer tilstande, der spænder fra en enkelt åbne systemer tilstand til et brugerdefineret maksimum antal stater.
    1. Ved hjælp af startparameter vektor, kombinere tilstødende diffusions tilstande gennem vægtede gennemsnits-og split diffusions tilstande i to stater med lige befolknings fraktioner og diffusion koefficienter 20% over og under den oprindelige værdi. Gentag for alle tilstand kombination og opdeling muligheder.
  4. Brug hver prøve tilpasnings parameter vektor til at initialisere en ikke-lineær mindste kvadratisk montering af 5 separate undergrupper af dataene (ved hjælp af fmincon -funktionen i MATLAB). Bestem kvaliteten af pasformen ved at finde den resterende sum af kvadrater mellem pasformen og fordelingen, som svarer til de resterende delsæt (data kryds validering).
  5. Brug den gennemsnitlige restsummen af kvadrater af de 5 separate fittings for hver prøve vektor som den overordnede kvalitet af pasform, bestemme prøve vektoren med den bedste kvalitet af pasform for hvert antal åbne systemer tilstande.
  6. Bestem det optimale antal stater ved at identificere den retssag vektor, som tilføjer en ekstra stat ikke resulterer i mindst en 5% forbedring i kvaliteten af pasformen.
  7. Brug denne prøve vektor til at initialisere den ikke-lineære mindste kvadraters montering af hele datasættet.
  8. Estimat fejl for de enkelte parametre ved at gensample dataene ved at bootstrapping og genmontere med den samme prøve vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet her (20.000 rammer, mindst 4 lokaliseringer af forløbs længde) og afhængigt af udtryks niveauerne for de fluorescently mærkede fusions proteiner, giver ca. 200-3000 lokaliseringer 10-150 der kan genereres forløbskurver pr. celle (figur 2a, b). Et stort antal forløbskurver er nødvendige for at producere en velafprøvet fordeling af tilsyneladende diffusions koefficienter. Størrelsen af FOV indsamlet her er ~ 55 x 55 μm, med 10 FOV indsamlet per eksperiment. For at opnå > 5000 forløbskurver pr. eksperiment skal hver FOV derfor indeholde mindst 50 celler. Ideelt set bør celle populationen gøres så tæt som muligt, men uden at cellerne rører hinanden. Hvis celletætheden er for høj, gør tilstedeværelsen af berørende eller overlappende celler det udfordrende at segmentere dem med succes ved hjælp af OUFTI (28), som beskrevet i data efter behandling. Dårlig segmentering kan føre til lokaliseringer og forløbskurver, der er tildelt forkert mellem cellerne.

Her præsenterer vi tilsyneladende diffusions koefficient data på Y. enterocolitica type 3 sekretions protein YscQ, som vi N-terminalt mærket med fluorescerende protein-eyfp. YscQ er en strukturel bestanddel af en membran-spænder molekyl maskine, kaldet injektionerne. Injektiviteten består af over 20 forskellige proteiner, hvoraf mange er til stede i flere kopi numre. Type 3 sekretions injektorer er bredt udnyttet af patogene gram-negative bakterier til at levere virulente Effector proteiner direkte i værtscellen under infektion. Yscq binder og frigør dynamisk til og fra cytosolisk siden af injektiviteten. Som et resultat, yscq er også fundet frit sprede i cytosol. Ved at anvende dataindsamlingen, behandlingen og analyse protokollen, der er beskrevet ovenfor, fastslår vi, at ubundet yscq findes i mindst 3 forskellige åbne systemer tilstande (figur 3). Disse 3 åbne systemer tilstande svarer til forskellige homo-og hetero-oligomeriske komplekser af yscq og andre type 3-sekretions proteiner23.

Figure 1
Figur 1: optisk diagram over mikroskop veje. Mikroskopet har en sti til påvisning af fluorescens signal og en separat vej til at tage et fasekontrast billede. Et motoriseret ' flip-Mirror ' bruges til at skifte mellem stierne. Kamera detektorerne, excitation lasere, LED og ' flip-Mirror ' styres eksternt af computer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: enkelt-molekyle lokaliseringer og forløbskurver. (A). 3D enkelt-molekyle lokaliseringer af eYFP-YscQ i en Y. enterocolitica celle opnået i forskellige rammer (1.766 localiseringer). Lokaliseringer er overlagt på en fasekontrast billede af cellen. Den grønne linje angiver celle dispositionen baseret på billedet af fase kontrasten. (B). 3D enkelt-molekyle forløbskurver af eyfp-YscQ opnået fra lokaliseringer vist i panel A (142 forløbskurver). Forskellige farver repræsenterer forskellige enkelt-molekyle forløbskurver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: den tilsyneladende fordelingskoefficient fordeling montering af eYFP-YscQ i Y. enterocolitica. Den tilsyneladende fordelingskoefficient fordeling for eYFP-YscQ i Y. enterocolitca var bedst egnet til 3 diffusions tilstande. Bemærk, at sandsynlighedstæthedsfunktionen (PDF) vises her, mens data tilpasningen blev udført ved at montere den kumulative fordelingsfunktion (CDF, eksperimentel tilsyneladende diffusions koefficient fordeling fitting). Figur tilpasset fra Rocha et al23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Mikroskop kontrol GUI. Mikroskop GUI styrer mikromanipulator af scenen, excitation lasere, LED, og kameraer til fluorescens emission. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Easy-DHPSF GUI. Easy-dhpsf-softwaren bruges til at udtrække enkelt-molekyle-lokaliseringer fra dhpsf-signalerne. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3. Oufti segmentering. Open source software OUFTI28 bruges til at sement cellerne. Her vises resultaterne af celle segmentering med grønt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4 . Udvælgelse af kontrolpunkter. Der er valgt fem punkter i både celle dispositions dataene og lokaliseringsdataene. Celle polerne bruges som referencepunkter. Disse punkter bruges til at omdanne data, så celle konturer og lokaliseringer er korrekt overlagt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5 . Slet uønskede celler. Efter celle overlay slettes uønskede celler manuelt. Celler med usædvanligt lave/høje mængder af lokaliseringer bør slettes, samt eventuelle celler, der er på kanten af FOV. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6 . Endelig overlejring af celle konturer og lokaliseringer. Efter sletning af uønskede celler, celle konturer og single-molekyle lokaliseringer er fint omdannet til at få den endelige overlay. Lokaliseringer uden for celle konturer slettes. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende MOV. 1: rå data for en enkelt-molekyle bane. Eksempel på påvisning af eYFP-YscQ på sCMOS-kameraet. I ramme 1 er der intet fluorescens signal. I frames 2-10 detekteres fluorescens fra et enkelt molekyle. I hver efterfølgende ramme ændres positionen og retningen af DHPSF, hvilket indikerer diffusion af dette molekyle. Endelig er der i ramme 11 endnu en gang et fravær i fluorescens signalet, hvilket indikerer enden af banen. Hver pixel er 108 x 108 nm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende MOV. 2: rå data for en savnet enkelt-molekyle bane. Frames 1-3 viser fluorescens signal for en enkelt udleder. Frames 4-6 viser imidlertid tilstedeværelsen af to overlappende Dhpsf'er, hvilket indikerer tilstedeværelsen af to emittere i umiddelbar nærhed. I sådanne tilfælde passer de enkelte Dhpsf'er muligvis ikke korrekt på grund af deres overlap. Selv hvis begge Dhpsf'er er godt egnet, vil alle observerede forløb, der indeholder disse lokaliseringer, blive kasseret. To eller flere lokaliseringer i samme celle kan føre til ukorrekte tildelinger af lokaliseringer til en given bane. Hver pixel er 108 x 108 nm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En afgørende faktor for en vellykket anvendelse af den præsenterede protokol er at sikre, at enkelt-molekyle signaler er godt adskilt fra hinanden (dvs. de skal være sparsomme i rummet og i tid (supplerende MOV. 1)). Hvis der er mere end ét fluorescerende molekyle i en celle på samme tid, kan lokalisering være forkert tildelt til en anden molekyler ' bane. Dette kaldes sammenkædning problem30. Eksperimentelle betingelser, såsom protein ekspression niveauer og excitation laser intensitet kan vælges for at undgå sammenkædning problem. Der bør dog udvises forsigtighed for at opnå vildtypeprotein ekspressionsniveauer for at sikre repræsentative resultater. Her brugte vi alleliske udskiftninger under kontrol af de indfødte initiativtagere i stedet for kemisk inducerbar udtryk, for at sikre indfødte udtryk niveauer af de mærkede proteiner. Således, excitation laser intensitet (for eYFP blinkende) eller aktivering laser intensitet (for foto-aktivatable fluorescerende sonder) kan bruges til at styre koncentrationen af aktive emittere i tide. Alternativt, når kemisk farvestof mærkning bruges sammen med Halo og snap Tags31,32, så kan farvestoffet koncentrationen reduceres, indtil fluorescerende signaler er sparsomme nok til at spore enkelte molekyler33. Den protokol, der præsenteres her, eliminerer yderligere sammenkædnings problemet ved at kassere alle forløbskurver, hvor to eller flere lokaliseringer samtidig findes i den samme celle (supplerende MOV. 2). Således, hvis single-molekyle signaler er for tætte, en stor mængde data automatisk kasseres under behandlingen. Under de udmagnetiserings betingelser, der anvendes her (λex = 514 nm ved 350 W/cm2), opnåede vi 10-150 forløbskurver pr. bakteriecelle, når de erhverver 20.000 frames i løbet af 8 min. På den anden side, hvis eksperimentelle betingelser er valgt sådan, at single-molekyle signaler er sparsom, så dataindsamlingen gennemløb kan være lav, således at opnå et tilstrækkeligt stort antal enkelt-molekyle forløbskurver ville kræve billeddannelse yderligere celler i yderligere felter-af-View. Erhvervelse af et stort antal forløbskurver er gavnlig, fordi fejlene i de monterede parametre (diffusions koefficienter og befolknings fraktioner) falder, da antallet af forløbskurver, der analyseres, stiger29.

Opnåelse af et stort antal enkelt molekyle forløbskurver kræver høj dataoverførselshastighed. Som en bred-felt teknik, enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi erhverver data for hver celle i FOV samtidig, og forskerne er begyndt at drage fordel af nye scmos detektorer, der har råd til store fovs26,34, 35. men excitation laser beføjelser af flere watt er forpligtet til at opnå ensartede intensiteter tilstrækkelig til enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi i hele sådanne store fovs. Sådanne laser beføjelser kan være over skadestærsklen for kommercielt tilgængelige objektiv linser. Lenslet arrays ansat til at gøre excitation laser intensiteter uniform i store FOVs kan være i stand til at omgå dette problem34. Desuden bliver optiske aberrationer udtalt, når Imaging langt væk fra den optiske akse. Som følge heraf kan form af DHPSF blive for forvrænget til at kunne tilpasses med en dobbelt Gaussian model, der anvendes i Easy DHPSF. Ved billeddannelse i et ultrabredt FOV kræves der mere sofistikerede, rumligt varierende PSF-modeller36. For at undgå disse komplicerende faktorer, de data, der præsenteres her blev erhvervet i en relativt lille FOV (diameter = 55 μm) og data fra 10 FOVs blev samlet for at opnå mere end 75.000 enkelt-molekyle forløbskurver.

Montering af de eksperimentelt målte tilsyneladende diffusions koefficient fordelinger med simulerede fordelinger kræver en realistisk simulering af forsøgsdataene. Statiske og dynamiske lokaliserings fejl i Kamerabaseret sporing kan påvirke kvaliteten af målingen11,13. Statiske lokaliserings fejl skyldes det endelige antal fotoner indsamlet pr. fluorescens emitter, hvilket resulterer i en upræcis polyester fiber form og dermed resulterer i et enkelt molekyle lokaliseringer med begrænset præcision2,37, 38. der opstår dynamiske lokaliserings fejl på grund af bevægelige emittere, som genererer sløret psfs39. Når en algoritme anvendes til at passe til formen af polyesterfibre, giver bevægelses sløret billeder lokaliseringer med begrænset nøjagtighed og præcision39. I svære tilfælde af hurtig molekyle bevægelse kan billedet være for forvrænget til at passe, hvilket resulterer i en mislykket pasform og dermed ingen registreret lokalisering. Simulering af rumligt slørede Psf'er med realistiske signal til støjforhold og lokalisering med den samme tilpasnings algoritme som eksperimentelle data konti for både statisk og dynamisk lokaliserings fejl. For det andet kan hurtigt sprede molekyler være stærkt begrænset til små volumener, såsom cytosol af en bakteriel celle. Som følge heraf er de tilsyneladende diffusions koefficienter i gennemsnit mindre end dem, der forventes for uindskrænket bevægelse. Rumlig indespærring resulterer i en overordnet venstre forskydning af fordelingen mod mindre difeløse værdier. Vigtigere er, at formen af fordelingen ikke længere udtryksfulde som en analytisk funktion. Ved eksplicit at angive statiske og dynamiske lokaliserings fejl på grund af Bevægelsessløring og indeslutning ved hjælp af stokastiske simuleringer kan der opnås realistiske fordelinger23.

Den beskrevne diffusions analyse bygger på to centrale antagelser vedrørende molekylens dynamiske opførsel i det biologiske miljø. Det antages, at difpulsive stater er beskrevet ved begrænset brunlig bevægelse, og at de ikke interkonvertér på tidsskalaen af en enkelt-molekyle bane. Vi har eksperimentelt verificeret, at antagelsen om begrænset brownian motion er berettiget til fri eYFP diffusion i Y. enterocolitica23. Disse resultater er i enighed med en række undersøgelser i forskellige bakteriearter, der har konstateret, at bevægelsen af cytosolisk proteiner, fusions proteiner, og biomolekyler komplekser mindre end 30 nm kan beskrives ved brownian motion18, 40,41,42,43,44,45. Ikke-specifikke kollisioner af små fluorescently mærkede proteiner med andre cellulære komponenter kan bremse diffusions raterne,45,46 , men fører ikke til afvigelser fra brunlig diffusion. Derimod kan specifik interaktion med cognate bindende partnere medføre en ændring i diffusions koefficienten, som for nylig vist for Y. enterocolitica type 3-sekretions protein YscQ23. Det er vanskeligt at vurdere gyldigheden af den anden antagelse, især for systemer, hvor der hverken er kendskab til de difpulsive tilstande eller den bindende kinetik. Situationen er yderligere kompliceret, fordi alle oligomeriserings tilstande og bindende kinetik målt in vitro, måske ikke afspejler de strukturer og den dynamik, der forekommer in vivo. En nylig teoretisk undersøgelse baseret på den analyseramme, der præsenteres her, tyder på, at det kan være muligt at udtrække den tilstands skifte kinetik ud over diffusions koefficienterne og populations fraktionerne29.

Sammenfattende præsenterer vi en integreret protokol for at løse de diffløse tilstande af fluorescently mærkede molekyler baseret på enkelt-molekyle forløbskurver målt i levende bakterieceller. Som præsenteret her, protokollen anvendes på 3D enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi ved hjælp af dobbelt-helix PSF til billeddannelse i Y. enterocolitica, en bakteriel patogen. Men med kun et par modifikationer, kan protokollen anvendes til enhver form for 2D eller 3D enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi og objekt geometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Alecia Achimovich og ting Yan for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker ed Hall, Senior videnskabsmand i den avancerede Research computing Services-gruppe på University of Virginia, for at få hjælp til at opsætte de optimerings rutiner, der bruges i dette arbejde. Finansieringen af dette arbejde blev ydet af University of Virginia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Biokemi fysisk kemi organismer bakterier kemi og materialer uorganiske organisk og fysisk kemi biovidenskab biovidenskab (generelt) matematisk og datalogi numerisk analyse super-resolution Enkelt-molekyle fluorescens tracking Diffusion levende celle
Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rocha, J. M., Gahlmann, A.… More

Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter