Summary
3D 单分子定位显微镜用于探测活细菌细胞中荧光标记蛋白质的空间位置和运动轨迹。本文描述的实验和数据分析方案根据集合的单分子轨迹确定细胞蛋白的普遍扩散行为。
Abstract
单分子定位显微镜可探测活细胞中单个分子的位置和运动，具有几十纳米空间和毫秒的时间分辨率。这些功能使单分子定位显微镜非常适合研究生理相关环境中的分子级生物功能。在这里，我们演示了单分子跟踪数据的采集和处理/分析的集成协议，以提取感兴趣的蛋白质可能表现出的不同扩散状态。这些信息可用于量化活细胞中的分子复合形成。我们详细介绍了基于摄像头的 3D 单分子定位实验，以及随后产生单个分子轨迹的数据处理步骤。然后，使用数值分析框架对这些轨迹进行分析，以提取荧光标记分子的普遍扩散状态和这些状态的相对丰度。分析框架基于细胞内布朗扩散轨迹的随机模拟，这些轨迹在空间上被任意细胞几何体所限制。基于模拟轨迹，以与实验图像相同的方式生成和分析原始单分子图像。通过这种方式，实验精度和精度限制被明确纳入分析工作流中，这些限制很难进行实验校准。使用模拟分布的线性组合拟合实验值的分布，确定普遍扩散状态的扩散系数和相对总体分数。通过解决在细菌病原体的细胞溶质中形成同质和异寡体复合物时表现出不同扩散状态的蛋白质，我们证明了我们的协议效用。
Introduction
研究生物分子的扩散行为可以深入了解其生物功能。基于荧光显微镜的技术已成为观察其原生细胞环境中的生物分子的宝贵工具。光漂白 （FRAP） 和荧光相关光谱 （FCS）1之后的荧光恢复提供整体平均扩散行为。相反，单分子定位显微镜能够观察具有高空间和时间分辨率2、3、4的单个荧光标记分子。观察单个分子是有利的，因为感兴趣的蛋白质可能存在于不同的扩散状态。例如，当转录调节器（如大肠杆菌中的 CueR）在细胞醇中自由扩散或与DNA序列结合，并在测量时间尺度上固定时，会出现两种易于区分的扩散状态。.单分子跟踪为直接观察这些不同状态提供了工具，并且不需要复杂的分析来解析它们。然而，在扩散率更相似的情况下，解决多种扩散状态及其人口分数就变得更加困难。例如，由于扩散系数的大小依赖性，蛋白质的不同寡聚状态表现为不同的扩散状态6、7、8、9,10.这类案件需要在数据采集、处理和分析方面采取综合办法。
影响细胞分子扩散率的一个关键因素是细胞边界约束的影响。细菌细胞边界对分子运动的限制导致细胞分子的测量扩散速率看起来比在未封闭空间中发生相同运动时要慢。对于非常缓慢的扩散分子，由于没有与边界碰撞，细胞禁闭的影响可以忽略不计。在这种情况下，可以使用基于布朗运动方程的分析模型，通过拟合分子位移、r或表观扩散系数D+的分布，可以准确求解扩散状态（随机扩散）11，12，13。然而，对于快速扩散的细胞分子，由于扩散分子与细胞边界的碰撞，实验分布不再类似于未限制的布朗运动。必须考虑约束效应，以准确确定荧光标记分子的未封闭扩散系数。最近已经开发出几种方法，通过蒙特卡罗模拟，从分析上解释5、14、15、16或数字的禁闭效果。布朗扩散6，10，16，17，18，19。
在这里，我们提供一个集成协议，用于收集和分析单分子定位显微镜数据，特别注重单分子跟踪。该协议的最终目标是解决荧光标记的细胞蛋白内部（本例中为棒状细菌细胞）的扩散状态。我们的工作建立在以前的单分子跟踪协议之上，其中DNA聚合酶PolI通过扩散分析20证明存在于DNA结合和未结合状态。在这里，我们将单分子跟踪分析扩展到 3D 测量，并执行更逼真的计算模拟，以解决和量化同时存在于细胞中的多种扩散状态。这些数据是使用自制3D超分辨率荧光显微镜获取的，该显微镜能够通过双螺旋点扩散功能（DHPSF）21、22的成像来确定荧光发射器的3D位置。使用定制软件处理原始单分子图像，提取 3D 单分子定位，然后组合成单分子轨迹。数千个轨迹被汇集在一起，以产生表观扩散系数的分布。在最后一步中，实验分布与通过蒙特卡洛模拟布朗运动在密闭体积中获得的数值生成的分布相得一拟。我们应用这个协议来解决3型分泌系统蛋白YscQ在活叶尔西尼亚肠胆病中扩散状态。由于其模块化性质，我们的协议通常适用于任意细胞几何结构中的任何类型的单分子或单粒子跟踪实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 双螺旋点扩散功能校准
注：本部分和以下各节中描述的图像是使用定制内向荧光显微镜获取的，如Rocha等人23所述。相同的程序适用于不同的显微镜实现设计单分子定位和跟踪显微镜2，3，4。本文中描述的所有图像采集和数据处理软件均可用（https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git）。
- 准备用于在玻璃盖滑轨上安装样品的甘蔗垫，供显微镜下观察。
- 通过重量将1.5-2%的低熔点甘油添加到5 mL的M2G缓冲液（4.9 mM Na2HPO 4，3.1mM KH2PO4，7.5 mM NH4Cl，0.5 mM MgSO4， 10 μM FeSO4， 0.5 mM CaCl2和 0.2% 葡萄糖）。微波几秒钟，直到所有的甘蔗溶解。不要让溶液沸腾。
- 让甘蔗溶液冷却几分钟（2-3分钟）。
- 将600 μL的甘蔗溶液移液到玻璃盖滑（22毫米x22毫米）上。轻轻地将第二个玻璃盖滑在蔗甘蔗顶部。这将在两个玻璃盖滑片之间创建一个薄（±0.5 mm）的甘蔗胶垫。
- 让甘蔗垫坐至凝固约20分钟。
- 轻轻分离玻璃盖滑。阿加松垫将粘在其中之一。
- 使用剃刀刀片，将甘蔗垫切成四个大小相等的方形部分。每个方形部分可用于单个样本。
- 将荧光珠溶液1.5μL移液器放在一个甘蔗垫上。珠子溶液是M2G中库存溶液的1/100000稀释（见材料表）。
- 倒置的Agarose垫，放在玻璃盖滑道上，在臭氧清洁剂中清洁了30分钟。选择清洁时间以消除附着在盖玻片上的任何荧光分子。
- 将样品盖玻璃安装到倒置荧光显微镜的样品支架上，并使用胶带或弹簧加载的样品支架夹将其固定到位。
- 在显微镜物镜上加入一滴浸入油。
- 将样品架放在显微镜上，并将其固定到位。
- 初始化图形用户界面 （GUI） 以控制显微镜的摄像机、样品级和激励激光器。在这里，MATLAB 中的自定义编写软件用于仪器控制 （补充图 1）。
- 初始化相机软件 HCImage 实时。在"相机控制"部分下的"捕捉"选项卡中，将曝光时间设置为 0.03 s。
- 单击 GUI 接口上的打开 514 nm 激光以激发焊盘上的荧光珠，并使用实时流模式（即没有保存到磁盘的数据）查看摄像机上的荧光发射，从而打开激光。
- 通过单击 GUI 的"微定位阶段"部分下的"XY-Pos"箭头来调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置，以在视场 （FOV） 的中心放置至少一个荧光珠。可以通过单击箭头下方的下拉框来更改步长大小。
- 通过单击 GUI 的纳米定位阶段部分下的Z-Pos箭头来调整显微镜阶段的 Z 位置。将荧光珠的双螺旋点扩散函数 （DHPSF） 的方向设置为垂直方向。此垂直方向定义为 Z 校准的起始点。可以通过单击箭头下方的下拉框来更改步长大小。
- 在 HCImage 实时中，在捕获|触发模式，速度和注册，将触发模式从内部级别触发更改为外部级别触发。这将允许 MATLAB GUI 控制摄像机。
- 在"序列"下 |扫描设置，将帧计数数更改为1200。单击标记为...最后单击"开始"。帧计数数设置为1200，以便对于 120 Z 位置步骤中每个步骤可以收集 10 帧。
- 扫描 Z 位置范围（以 50 nm 的增量在起始 Z 位置上方和下方 30 步），并使用 0.03 秒的曝光时间在每一步记录 10 帧。 GUI。
注： 校准的参数（包括步长、步数、摄像机曝光时间和每步帧数）也可以在此处调整。使用 0.03 s 的曝光时间，从单个帧中的荧光珠中获取大约 105 个光子，从而获得约 1 nm 的 x、y、z 定位精度。 - 单击 GUI中的"关闭 515 nm 激光"关闭激光照明。在 HCImage 实时中，在捕获|触发模式，速度和注册，将触发模式更改回内部。在"序列"下 |扫描设置将帧计数数更改为 200。单击标记为...单击"开始"以收集 200 帧曝光时间为 0.03 秒的黑暗图像。
注： 即使在探测器上没有光线照射的情况下，每个像素也会读出一个正数（称为暗偏移值），该数字在像素之间可能略有不同。暗偏移值可能会随时间而变化。因此，有必要为每个校准收集暗帧。 - 使用 Easy-DHPSF 软件24将 DHPSF 与双高斯模型配合，以获得珠子的X和Y位置，以及角度与 Z 校准曲线。
- 在 MATLAB 中初始化易 DHPSF 软件。在"设置"下，将通道设置为G，并将拟合方法设置为使用 DG 模型的 MLE。G是指绿色通道摄像机，因为用于数据采集的荧光蛋白发出绿色波长。带 DG 模型的 MLE是指使用双高斯模型的最大可能性估计。
注： 像素大小和转换增益取决于特定的光学设置，可能需要更改。 - 在"校准 DHPSF"部分下，单击"运行"。单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。
- 选择在步骤 1.13-1.14 中保存的图像堆栈。接下来，选择在步骤 1.15 中保存深色背景的图像堆栈。最后，选择在步骤 1.14 期间自动保存的 .txt 文件。此文件包含整个扫描过程中的阶段的 Z 位置。
- 在下一个弹出窗口中，如果整个摄像机芯片未用于视野，则输入芯片上的起始 x0 和 y0 位置。否则，输入 x0 = 1 和 y0 = 1.此信息可以在"Binin 和 SubArrary"部分下的 HCImage Live 中找到。
- 在以下窗口中，调整和重新定位出现在荧光珠图像上的框，使其大小约为 100 x 100 像素，并居中于单个荧光 DHPSF 信号。然后，双击以继续。
注： 所选 DHPSF 应与其他 DHPSF 信号隔离，理想情况下是可能最亮的珠子。 - 单击 DHPSF 信号的中心，在两个波瓣之间，然后点击Enter。以下窗口显示所选 DHPSF 的放大视图。通过单击更精确地选择 DHPSF 中心的位置。
注： 程序随后将适合 DHPSF，并显示原始图像和从拟合的重建。它还将输出与不同 Z 位置的 DHPSF 横截面对应的 Z 校准的模板图像。这些将在以后用于安装实验数据。程序将输出每个帧中估计的 X、Y 和 Z 位置。在对齐良好的光学系统中，X 和 Y 在 Z 位置变化时应变化很小（±30 nm 偏差）。如果输出变化大于 30 nm，则位于成像系统傅立叶平面的相位掩膜（图 1）应重新对齐并重复步骤 1.9-1.16。 - 单击 GUI 左上角的"保存"图标，保存易 DHPSF GUI。稍后可以通过单击 GUI中的"加载"图标来加载此功能。
注：Z 校准程序应在实验的每一天进行，以考虑显微镜中可能因温度波动或机械振动而发生的校准变化。
- 在 MATLAB 中初始化易 DHPSF 软件。在"设置"下，将通道设置为G，并将拟合方法设置为使用 DG 模型的 MLE。G是指绿色通道摄像机，因为用于数据采集的荧光蛋白发出绿色波长。带 DG 模型的 MLE是指使用双高斯模型的最大可能性估计。
2. 细菌培养制剂
- 准备支持细菌细胞生长的培养基。对于Y. 肠杆菌，使用 5 mL 的 BHI（脑心脏输注）汤，含有纳利迪克酸 （35 μg/mL） 和 2，6-二氨基甲酸 （80 μg/mL）。在这里，使用一种Y.肠杆菌菌株，其蛋白质YscQ与荧光蛋白eYFP23标记。
- 用冷冻剂或板培养物的细菌培养物接种介质。
- 在 28°C 下生长培养，一夜之间摇动。
- 使用新鲜的培养培养剂将少量（±250 μL）的饱和过夜培养剂稀释至5 mL。
- 在 28°C 下生长培养，摇动 60-90 分钟。
- 荧光融合蛋白的诱导表达。对于Y.肠球菌，热冲击细胞到37°C在水摇床诱导yop反应。
- 在37°C下，在37°C下，在颤抖下，将细胞孵育3小时。
- 在室温下在5，000 x g下将培养机1 mL离心3分钟。丢弃上清液。
- 使用 1 mL M2G 介质清洗颗粒 3 次。
- 在 M2G 介质的 ±250 μL 中重新悬浮颗粒细菌。
- 添加荧光珠作为基准标记。荧光珠溶液应加入适当稀释量，以便在显微镜中观察时，每个FOV只有1-2个珠子。
- 轻轻移液器或涡旋悬浮液以分离聚合的细胞。
- 在使用 M2G 制成的 1.5-2% 甘蔗垫上，板 1.5 μL 悬架。
- 反转甘蔗垫并将其放在臭氧清洁的显微镜盖玻片上。盖玻片应放置在臭氧清洁剂中 30 分钟，以减少任何固有的荧光背景。
3. 数据采集
- 将样品盖玻璃安装到倒置荧光显微镜的样品支架上，并使用胶带或弹簧加载的样品支架夹将其固定到位。
- 在显微镜物镜上加入一滴浸入油，然后将样品架放在显微镜上，并将其固定到位。
- 初始化图形用户界面 （GUI） 以控制显微镜的摄像机、样品级和激励激光器。在这里，MATLAB 中的自定义编写软件用于仪器控制。
- 初始化相机软件HCImage实时。在"相机控制"部分下的"捕捉"选项卡中，将曝光时间设置为 0.025 s。单击"实时"开始实时馈送摄像机。
- 通过单击 GUI的微定位阶段部分下的XY-Pos箭头来调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置，以扫描样品周围，并找到具有适当密集细菌细胞群的 FOV。
注： 为了最大化数据吞吐量，单元格应尽可能密集，不要重叠或接触单元格。FOV 还应包含至少 1 个荧光珠，用作基准标记，最好位于 FOV 的一角。 - 通过单击 GUI 的纳米定位阶段部分下的Z-Pos箭头来调整显微镜阶段的 Z 位置，以便荧光珠的 DHPSF 波瓣是垂直的。
- 在"序列"下 |扫描设置，将帧计数数更改为 20，000。单击标记为...最后点击"开始"，使用0.025秒的短曝光时间收集多达20，000个相机帧。 eYFP光闪烁在514nm19，25的高强度激发光下启动。
注：此处，在焦平面处使用 ±350 W/cm2的激光强度，用于单个 EYFP 分子的初始漂白和随后的成像。在成像过程中，未使用电子紫外线波长的eYFP分子的光活化。每个细菌细胞最多应该有一个单分子信号。如果单分子信号的密度最初过高，则继续照明，直到在开始数据采集之前进行足够的光漂白。 - 单击 GUI中的"关闭 515 nm 激光"关闭激光照明。使用相同的曝光时间收集 200 帧深色图像。
- 在 GUI 中，选中Thorlabs LED旁边的复选框，然后单击"向上切换镜像"。这将从荧光通路切换到相对比通路。
- 初始化数据采集软件IC捕获2.4。这将控制相位对比度路径中的摄像机。按"开始/停止实时显示"按钮，从摄像机查看实时源。单击"捕获|保存图像以收集视场中单元格的相位对比度图像。
- 对于其他 FOV，请重复步骤 3.5-3.10。在这里，从10个不同FOV中的+500个细菌细胞获得的数据用于增加可用于分析的单分子轨迹的数量。
注意：长时间安装在甘蔗垫上的细胞的行为可能与新装的细胞不同。此外，Agarose 垫可能在一段时间后失去完整性，从而可能对数据质量产生不利影响。通常，每个样品幻灯片最多使用 3 个 FOV（显微镜上约 30 分钟）。
4. 数据处理
注： MATLAB 中使用了 Easy-DHPSF 软件24的修改版本，用于分析原始摄像机帧以提取单分子定位。易DHPSF专门用于在单分子成像中安装DHPSF定位。进行了自定义更改，以实现基于最大可能性估计 （MLE） 的拟合例程，该例程考虑了现代 sCMOS 摄像机26的像素相关噪声特征。它还被修改为接受来自 HCImage Live 程序 （.dcimg） 的图像文件类型输出。有关软件及其各个步骤的更详细说明，请参阅 Lew 等人24
- 在 MATLAB 中初始化易 DHPSF GUI （补充图 2）。加载在步骤 1.16.8 中保存的文件。
- 确定步骤 1.16.7 中输出的 7 个模板的每个阈值
- 在"校准 SM 标识"部分下，单击"运行"。单击以下两个弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。
- 在提示时打开包含来自第一个 FOV 的数据的图像堆栈。
- 选择少量框架以匹配模板。通常帧 1001-2000 用于避免前几百帧中的密集重叠信号。单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。单击"取消"，在以下窗口中提示序列日志文件。
- 打开图像堆栈，并在步骤 3.8 中保存了深色背景。在下面的弹出窗口中单击"确定"，将后台估计集的参数保留为默认值。默认值是使用中值滤镜27估计背景，该滤镜覆盖当前帧周围的 100 个后续摄像机帧。
- 在下一个窗口中，调整图像上覆盖的框的大小以覆盖整个 FOV，然后双击以继续。
- 通过单击图像上的多个点来创建多边形来定义感兴趣的区域。感兴趣的区域应包含尽可能多的视野，同时确保图像中的任何荧光珠子（非常明亮的对象）不位于多边形内，然后双击以继续。
注： 然后，软件将尝试将模板与图像匹配，并显示一个可能匹配的图像。 - 软件停止后，它将保存找到的模板匹配的许多图像，并在预定义的文件夹中显示相应的阈值。较高的阈值对应于更好的匹配项。对于每个模板编号，检查示例匹配，并确定显示 DHPSF 图像的最低阈值。在易 DHPSF GUI中的"校准 SM 标识"部分下，为 7 个模板中的每个模板输入这些阈值。
注：程序将尝试自动选择和输入阈值，但是，这些阈值通常不可靠，应手动检查。选择阈值时，很少会忽略真正的单分子信号，但拟合的误报候选数在计算上仍可管理。 - 单击左上角的"保存"图标，再次保存"轻松 DHPSF GUI"。
- 将荧光珠在 FOV 中安装，用作基准标记
- 在"易 DHPSF GUI"的"跟踪受托"部分下，单击"运行"。单击以下两个弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。
- 将覆盖在图像上的框拖到荧光珠的 DHPSF 信号上，然后双击。
- 单击 DHPSF 信号的中心，在两个波瓣之间的中点，然后点击进入。单击"取消"，在以下窗口中提示序列日志文件。
注： 该软件将适合DHPSF在所有相机帧，并显示原始图像和重建的图像。软件完成后，它将在图像采集期间输出具有荧光珠的 X、Y 和 Z 位置的数字。 - 选中"使用信托"旁边的复选框，然后单击左上角的"保存"图标，再次保存 Easy-DHPSF GUI。
- 使用步骤 4.2 中获取的模板阈值查找并适合所有摄像机帧中的所有本地化。
- 在"易 DHPSF GUI 的本地化 DHPSF SM"部分下，单击"运行"。单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。单击"取消"，在以下窗口中提示序列日志文件。
注： 如果匹配质量高于用户定义的阈值，则软件将使用双高斯模型查找并适合 DHPSF。它将显示原始图像与周围的模板匹配的圆圈，以及重建的 DHPSF 适合的图像。 - 单击左上角的"保存"图标，再次保存"轻松 DHPSF GUI"。
- 在"易 DHPSF GUI 的本地化 DHPSF SM"部分下，单击"运行"。单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。单击"取消"，在以下窗口中提示序列日志文件。
- 查看单分子定位并过滤掉不需要或不可靠的定位
- 在"输出 DHPSF SM 本地化"部分下，单击"筛选器输出"。
- 在以下三个窗口中单击"确定"，以随时间推算执行基准 X、Y 和 Z 位置的插值。在大多数情况下，默认选项就足够了。如果黑色插值线不反映红色位置线的合理插值，则更改弹出窗口中的插值参数。
注： 插值线用于阶段漂移校正单分子定位。 - 在提示时打开正在分析的 FOV 的相应相位对比度图像。单击以下两个弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。
- 在以下两个弹出窗口中，更改筛选器值以允许更严格或更宽松的单分子定位要求，然后单击"确定"。
- 在显示的窗口中，拖动或调整图像上覆盖的框以查看所需感兴趣区域，然后双击以继续。
- 显示单分子定位的 3D 重建。使用图形工具操作重建（旋转、缩放等）。单击"继续"以显示另一个对话框，询问"您是否希望使用不同的参数集重新绘制？"如果结果令人满意，请单击"否"。如果没有，请单击"是"。
注： 结果不令人满意的常见原因包括相位对比度图像未正确覆盖本地化数据，或者初始模板阈值过低，导致许多误报本地化。如果选择了"是"，软件将返回到步骤 4.5.4，以便可以定义新的参数值。如果选择了"否"，则将保存结果。
5. 数据后处理
- 在 MATLAB 中使用自定义编写的软件，裁剪相对比图像，以便仅保留包含荧光显微镜下成像的细胞的区域。此步骤是必要的，因为相位对比度图像覆盖的区域远远大于荧光图像。裁剪图像可简化下一步。
- 使用OUFTI28软件处理相位对比图像对单个单元进行分割（补充图3）
- 在 MATLAB 中初始化 OUFTI。单击"加载阶段"，加载上一步中裁剪的相位对比度图像。
- 单击"文件"可选择并命名输出文件的保存位置。
- 在"检测和分析"标题下选择独立帧。
- 单击加载参数以加载用于单元格检测的参数。参数示例包括可接受的单元格区域、单元格宽度和单元格拆分阈值。
注： 应调整所有这些参数，以最大限度地提高所使用的特定像元大小和图像质量的性能。重要的是，算法参数应设置为子像素，以便精确测量单元格轮廓。 - 单击此帧以开始单元格分段。该过程完成后，单元格轮廓将显示在相间对比度图像上。
- 使用"手动"部分下的控件，拆分单元格、添加单元格或优化单元格轮廓，以获取在自动过程中未准确分割的单元格的轮廓。
- 单击"保存分析"输出单元格轮廓。
- 在 MATLAB 中使用自定义编写的软件，将上一步中获得的轮廓与单分子定位精确叠加。以下子步骤详细介绍了软件的步骤。
- 通过粗略估计和单击上一步生成的单分子定位数据和细胞轮廓中相同五个细胞的细胞极的位置，在弹出窗口中手动选择 5 个控制点对。细胞杆的位置可以通过在属于一个细胞的单分子定位周围绘制一个凸包并选择最高曲率点来粗略估计（补充图4）。
- 使用 MATLAB 中的cp2tform函数生成 2D 仿数变换函数，并用它来生成细胞轮廓和单分子定位的粗糙叠加。
- 删除包含少于 10 个本地化的单元格，并删除部分位于视野外的单元格。通过单击单元格轮廓内部（补充图 5 ），手动删除弹出窗口中任何其他不需要的单元格。
- 使用所有剩余细胞轮廓和其中单分子定位的质量中心，形成一组更大的控制点对，重新计算 2D 变换函数，并用它来生成细胞轮廓和单分子定位。
- 将驻留在单元格轮廓的边界内的定位分配给该单元格。放弃任何单元格轮廓中未包含的任何本地化（图 2a，补充图 6）。
6. 单分子跟踪
注：以下部分使用 MATLAB 中的自定义软件完成。本节介绍软件执行的步骤。
- 对于分配给同一单元格和后续摄像机帧的定位，计算本地化之间的欧氏距离。如果定位之间的距离低于 2.5 μm 的阈值，则通过将它们分配给相同的单分子轨迹来链接定位。
注： 只考虑单个单元中的定位很重要，这样，在满足空间和时间阈值要求的相邻单元格中的定位不会链接。选择 2.5 μm 阈值作为极快分子（30 μm2/s）可在暴露时间长度（0.025 s）加上 20% 缓冲液中移动的最大距离。 - 丢弃短于 4 个本地化的轨迹。如果两个或多个定位（即两个或多个荧光发射体）同时存在于一个单元中，则丢弃关联的轨迹。将轨道长度最小设置为 4 定位允许对多个距离测量进行平均，从而对扩散系数进行更准确的估计。
- 计算给定轨迹的平均平方位移 （MSD）：
(1)
其中N是轨迹中定位的总数，x n是分子在时间点n的位置。 - 计算表观扩散系数，D=
(2)
其中m = 2 或 3 是测量的维数，μt是摄像机的曝光时间。
注：一个典型的实验将总共产生5，000-100，000个轨迹，从而产生具有许多计数的明显的扩散系数分布。
(1)
(2)7. 密闭卷中布朗运动的蒙特卡洛模拟
注：通过执行限制在圆柱体积范围内的布朗运动蒙特卡罗模拟，使用 0.05-20 μm2/s 范围内的 64 个值作为输入参数（软件）创建模拟表观扩散系数分布库可应作者要求提供）。选择这个范围是为了覆盖细菌中荧光（融合）蛋白先前估计的扩散系数范围。64个扩散系数用于充分采样这个范围。本部分使用 MATLAB 中的自定义软件执行，并介绍软件自动采取的步骤。此处使用的棒状Y. 肠球状细胞近似于长度l = 5 μm 和直径d = 0.8 μm 的圆柱形体积。
- 在圆柱形体积的随机位置启动单个轨迹，并使用 100 ns 的时间间隔（时间间隔应比摄像机曝光时间短得多，以启用足够的时间间隔）模拟其随机（即 Brownian）扩散步骤在摄像机帧过程中对位置进行采样）。通过重新排列 Eqn. 2，对相应高斯分布函数中的输入 D 的每个位移步进行采样，并将其添加到上一个位置：
(3)
其中 MATLAB 中的兰特函数从正态分布中采样随机数。如果一步导致分子在圆柱体体积外置换，则以随机角度将分子反射回圆柱体内部。 - 对于每个时间间隔，生成对应于模拟发射器的瞬时x、y、z位置的 DHPSF 图像。
- 为了匹配实验条件，模拟每个定位包含 1，000 个光子的图像，每个像素的激光背景为 13 个光子，以及泊瓦森噪声。此外，添加每像素 ±50 光子的暗偏移和高斯读取噪声（±±1.5光子），与实验摄像机校准测量一致。最后，将图像乘以sCMOS相机的实验测量像素相关增益，以探测器计数单位获得图像。
注：这些操作完成后，最终图像的信号噪比为+2。 - 通过求和实验数据采集期间在曝光时间内模拟的 50 个 DHPSF 图像，生成反映分子位置变化的运动模糊图像。为了限制计算费用，只选择 50 个定期采样位置来生成图像（而不是在 0.025 秒的曝光时间（采样间隔为 100 ns）期间采样的所有 250，000 个仓位）。
注： 模拟轨迹的长度（帧数）应与实验轨迹的平均长度相匹配。在这种情况下，每个轨迹的帧数为 6。
- 为了匹配实验条件，模拟每个定位包含 1，000 个光子的图像，每个像素的激光背景为 13 个光子，以及泊瓦森噪声。此外，添加每像素 ±50 光子的暗偏移和高斯读取噪声（±±1.5光子），与实验摄像机校准测量一致。最后，将图像乘以sCMOS相机的实验测量像素相关增益，以探测器计数单位获得图像。
- 为 64 个模拟输入扩散系数中的每个系数生成 5，000 个轨迹。
- 如数据处理部分所述，分析模拟摄像机帧。
- 如单分子跟踪部分所述，将定位链接到轨迹。
- 使用订单 25 的 B 样条插值为每个模拟分布的累积分布函数 （CDF） 插值。插值分布是必需的，以便可以在任意点查询它们。
- 使用 MATLAB 中的散射内插值函数（指定" 自然的插值法）。这提供了一个连续的 2D 函数，从该函数中可以查询与 0.05-20 μm2/s 范围内的真实扩散系数值对应的任何明显扩散系数分布。
(3)8. 实验表观扩散系数分布拟合
注：使用上一节中生成的模拟分布的线性组合（密量中布朗运动的蒙特卡洛模拟），拟合实验测量的表观扩散系数分布。本部分使用 MATLAB 中的自定义软件执行，并介绍软件自动采取的步骤。有关详细信息和申请示例，请参阅 Rocha 等人29
- 使用第 7 节中创建的库中的模拟 CDF 的定期采样数组，对实验 CDF 执行约束线性最小二乘（使用 MATLAB 中的lsqlin函数）。该步骤的输出是一个参数向量，包含实验分布中普遍存在的扩散状态的扩散系数和总体分数。
- 通过基于相对总体分数的权重平均，将扩散状态与彼此 20% 以内的扩散系数值合并为单个扩散状态。这是起始参数矢量。
注： 为了降低模型复杂性，扩散系数低于 0.5 μm2/s 的扩散状态可在以下所有步骤中保持恒定。 - 创建具有不同数量扩散状态的试管用参数矢量数组，范围从单个扩散状态到用户定义的最大状态数。
- 使用起始参数矢量，通过加权平均将相邻扩散状态合并，并将扩散状态拆分为两个状态，其总体分数和扩散系数在原始值之上和下方为 20%。对所有状态组合和拆分可能性重复上述步骤。
- 使用每个试合参数矢量初始化非线性最小平方拟合的 5 个单独的数据子集（使用 MATLAB 中的fmincon函数）。通过查找拟合和与其余子集对应的分布（数据交叉验证）之间的剩余平方和来确定拟合的质量。
- 使用每个试验向量的 5 个独立管件的平均剩余平方和作为总体拟合质量，确定针对每个扩散状态的最佳拟合质量的试验向量。
- 通过确定添加附加状态不会至少使拟合质量提高 5% 的试验向量来确定最佳状态数。
- 使用此试验矢量初始化完整数据集的非线性最小二乘拟合。
- 通过引导和重新拟合相同的试验向量重新采样数据来估计各个参数的误差。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在此描述的实验条件下（20，000 帧，轨迹长度最小为 4 个定位），并根据荧光标记融合蛋白的表达水平，大约 200-3，000 个定位，产生 10-150每个细胞可以生成轨迹 （图 2a， b）。大量的轨迹是产生表观扩散系数的采样分布所必需的。这里收集的FOV大小为+55 x 55 μm，每个实验收集10个FOV。因此，要获得每个实验的 >5，000 个轨迹，每个 FOV 应包含至少 50 个细胞。理想情况下，细胞群应尽可能密集，但不要让细胞相互接触。如果细胞密度过高，则接触或重叠的细胞的存在使得使用OUFTI（28）成功分割细胞变得困难，如数据后处理中所述。分割不良会导致细胞之间的定位和轨迹分配不正确。
在这里，我们提出了Y.肠杆菌3型分泌蛋白YscQ的明显扩散系数数据，我们用荧光蛋白eYFP在N端标记。YscQ是膜跨度分子机的结构成分，称为注射体。注射体由20多种蛋白质组成，其中许多蛋白质以多个拷贝数存在。3型分泌体注射体被致病性革兰氏阴性细菌广泛使用，在感染期间将毒性效应蛋白直接输送到宿主细胞。YscQ 动态结合和解除结合，并从注射体的细胞侧。因此，YscQ 也被发现在细胞醇中自由扩散。通过应用上述数据采集、处理和分析协议，我们确定未绑定 YscQ 至少存在于 3 种不同的扩散状态中（图 3）。这3种扩散状态对应于YscQ和其他3型分泌蛋白23的不同同质和异体-寡聚复合物。
图1：显微镜通路的光学图。显微镜具有用于检测荧光信号的通路和用于拍摄相位对比度图像的单独通路。电动"翻转镜"用于在路径之间切换。摄像机探测器、激励激光器、LED 和"翻转镜"由计算机远程控制。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：单分子定位和轨迹。（A）.在不同帧（1，766个定位）中获得的Y.肠球菌细胞中eYFP-YscQ的3D单分子定位。定位覆盖在单元格的相位对比度图像上。绿线表示基于相位对比度图像的单元格轮廓。（B） eYFP-YscQ的3D单分子轨迹从面板A（142轨道）所示的定位中获得。不同的颜色代表不同的单分子轨迹。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：Y.肠杆菌中eYFP-YscQ的表观扩散系数分布拟合。 Y.肠胆碱地eYFP-YscQ的表观扩散系数分布与3种扩散状态最合适。请注意，概率密度函数 （PDF） 如下所示，而数据拟合是通过拟合累积分布函数（CDF、实验表观扩散系数分布拟合）来完成的。图改编自罗查等人23。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1。显微镜控制GUI。显微镜 GUI 控制舞台的微定位器、激励激光器、LED 和摄像机的荧光发射。请点击此处下载此文件。
补充图2。易于 DHPSF GUI。Easy-DHPSF 软件用于从 DHPSF 信号中提取单分子定位。请点击此处下载此文件。
补充图3。乌夫蒂分割。开源软件OUFTI28用于对细胞进行软件。此处，细胞分割的结果以绿色显示。请点击此处下载此文件。
补充图4.选择控制点。在单元格大纲数据和本地化数据中选择五个点。细胞杆用作参考点。这些点用于转换数据，以便正确叠加单元格轮廓和定位。请点击此处下载此文件。
补充图5.删除不需要的单元格。单元格叠加后，将手动删除不需要的单元格。应删除本地化量异常低/高的单元格，以及 FOV 边缘的任何单元格。请点击此处下载此文件。
补充图6.单元格轮廓和本地化的最终叠加。删除不需要的细胞后，细胞轮廓和单分子定位被精细地变换，以获得最终的覆盖。删除单元格轮廓外的本地化。请点击此处下载此文件。
补充移动1：单分子轨迹的原始数据。sCMOS 摄像机上 eYFP-YscQ 检测示例。在帧 1 中，没有荧光信号。在帧 2-10 中，从单个分子中检测到荧光。在每个连续帧中，DHPSF 的位置和方向发生变化，表明此分子的扩散。最后，在帧 11 中，荧光信号再次出现缺失，指示轨迹的结束。每个像素为 108 x 108 nm。请点击此处下载此文件。
补充移动2：缺失的单分子轨迹的原始数据。帧 1-3 显示单个发射器的荧光信号。但是，帧 4-6 显示存在两个重叠的 DHPSF，表明两个发射器离较近。在这种情况下，单个 DhPSF 可能由于重叠而无法正确拟合。即使两个 DHPSF 都成功适合，任何包含这些定位的轨迹都将被丢弃。同一单元格中的两个或多个定位可能导致对给定轨迹的本地化分配不正确。每个像素为 108 x 108 nm。请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
成功应用所提出的协议的一个关键因素是确保单分子信号彼此很好地分离（即，它们需要在空间和时间上稀疏（补充Mov.1）。如果同时细胞中有多个荧光分子，则定位可能错误地分配给另一个分子的轨迹。这称为链接问题30。可以选择蛋白质表达水平和激发激光强度等实验条件，以避免连接问题。然而，应注意获得野生型蛋白质表达水平，以确保有代表性的结果。在这里，我们使用原生启动子控制下的等位替代物，而不是化学诱导表达，以确保标记蛋白质的本地表达水平。因此，激发激光强度（用于eYFP闪烁）或活化激光强度（用于光活化荧光探头）可用于及时控制有源发射体的浓度。或者，当化学染料标记与HALO和SNAP标签31，32结合使用时，染料的浓度可以降低，直到荧光信号稀疏到足以跟踪单个分子33。此处介绍的协议通过丢弃同一单元中同时存在两个或多个定位的轨迹，进一步消除了链接问题（补充 Mov. 2）。因此，如果单分子信号过于密集，则在处理过程中会自动丢弃大量数据。在本文使用的激励条件下（在350 W/cm2时，当在8分钟内获得20，000帧时，我们获得了每个细菌细胞10-150个轨迹）。另一方面，如果选择实验条件，使单分子信号稀疏，那么数据采集吞吐量可能较低，因此获得足够数量的单分子轨迹将需要成像其他视场中的其他单元格。获取大量轨迹是有益的，因为拟合参数（扩散系数和总体分数）中的误差随着被分析的轨迹数增加29而减小。
实现大量的单分子轨迹需要高数据采集吞吐量。作为一种宽领域技术，单分子定位显微镜可同时获取FOV中每个细胞的数据，研究人员已开始利用新的sCMOS探测器，提供大型FOVs26，3435.然而，在大型FOV中，需要几瓦的激发激光功率，才能达到均匀的强度，足以进行单分子定位显微。这种激光功率可能高于市售的物镜的损伤阈值。用于使激发激光强度在大型FOV中均匀的透镜阵列也许能够绕过这个问题34。此外，当成像远离光轴时，光学畸变变得明显。因此，DHPSF 的形状可能变得过于扭曲，无法被简单 DHPSF 中使用的双高斯模型成功拟合。在超宽范围FOV中成像时，需要更复杂的空间变化PSF模型36。为了避免这些复杂的因素，这里提供的数据是在相对较小的FOV（直径= 55 μm）中获取的，并且汇集来自10个FOV的数据，以获得超过75，000个单分子轨迹。
将实验测量的表观扩散系数分布与模拟分布拟合，需要对实验数据进行逼真的模拟。基于摄像头的跟踪中的静态和动态定位错误会影响测量11、13的质量。静态定位误差是由于每个荧光发射体收集的光子数量有限，导致PSF形状不精确，从而导致精度有限的单分子定位2，37，38.动态定位错误是由于移动的发射器产生模糊的PSFs39。当应用算法来拟合PSF的形状时，运动模糊图像可提供精度和精度有限的定位39。在分子快速移动的严重情况下，图像可能太扭曲，无法适应，导致配合不成功，因此没有记录的定位。使用逼真的信号噪声比模拟空间模糊的 PSF，并采用与实验数据相同的拟合算法进行定位，同时考虑静态和动态定位误差。其次，快速扩散的分子可以强烈限制在小体积，如细菌细胞的细胞醇。因此，表面扩散系数平均小于未封闭运动的预期扩散系数。空间限制导致分布整体向左移向较小的扩散值。重要的是，分布的形状不再作为分析函数来表达。通过随机模拟，明确考虑运动模糊和约束效应引起的静态和动态定位误差，可以得到23个真实的分布。
所述扩散分析依赖于关于分子在生物环境中的动态行为的两个关键假设。它假定扩散状态由有限的布朗运动来描述，并且它们不会在单分子轨迹的时间尺度上相互转换。我们已经实验验证，在Y.肠杆菌23中，有限布朗运动的假设对于自由eYFP扩散是合理的。这些结果与各种细菌物种的一些研究一致，这些研究已经确定，小于30纳米的细胞蛋白、融合蛋白和生物分子复合物的运动可以通过布朗运动18来描述。 40，41，42，43，44，45.小荧光标记蛋白质与其他细胞成分的非特异性碰撞可能会减慢扩散速率，45，46，但不会导致与布朗扩散的偏差。相比之下，与共和结合伙伴的特定相互作用可以产生扩散系数的变化，如最近显示的Y.肠杆菌3型分泌蛋白YscQ23。第二个假设的有效性很难评估，特别是对于既不了解扩散状态也不为结合动力学所知的系统。情况更加复杂，因为任何在体外测量的寡头状态和结合动力学，可能无法反映体内发生的结构和动力学。最近一项基于此处分析框架的理论研究表明，除了扩散系数和总体分数29之外，还可以提取状态开关动力学。
总之，我们提出了一个综合方案，用于解决荧光标记分子基于活细菌细胞中测量的单分子轨迹的扩散状态。如本文所介绍的，该协议应用于3D单分子定位显微镜，使用双螺旋PSF在细菌病原体Y.肠杆菌中进行成像。然而，只需稍作修改，该协议即可应用于任何类型的2D或3D单分子定位显微镜和试样几何。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢阿列西亚·阿希莫维奇和丁燕对手稿的批判性阅读。我们感谢弗吉尼亚大学高级研究计算服务小组的高级职员科学家Ed Hall帮助建立这项工作中使用的优化例程。这项工作的资金由弗吉尼亚大学提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
| 4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
| 514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
| agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
| ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
| bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
| Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
| calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
| camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
| dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
| disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
| flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
| fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
| glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
| glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
| immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
| iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
| long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
| magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
| microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
| nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
| objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
| Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
| potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
| Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
| short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
| Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
| Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
| zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |
References
- Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
- Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
- Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
- Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
- Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
- Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
- Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
- Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
- Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
- Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
- Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
- Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
- Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
- Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
- Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
- Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
- Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
- Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Berglund, A. J.
- Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
- English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
- Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
- Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
- Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
- Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
- Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).
