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Biochemistry

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

3 डी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी जीवित जीवाणु कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के स्थानिक पदों और गति tractories की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित पूल एकल अणु tracectories के आधार पर साइटोसोलिक प्रोटीन के प्रचलित diffusive व्यवहार निर्धारित करता है.

Abstract

एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी नैनोमीटर स्थानिक और मिलीसेकंड अस्थायी संकल्प के दसियों के साथ जीवित कोशिकाओं में अलग-अलग अणुओं की स्थिति और गति की जांच करता है। इन क्षमताओं एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी आदर्श शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण में आणविक स्तर जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाते हैं। यहाँ, हम दोनों अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन / यह जानकारी जीवित कोशिकाओं में आणविक जटिल गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक कैमरा आधारित 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण प्रयोग का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, साथ ही बाद के डेटा प्रसंस्करण कदम है कि व्यक्तिगत अणुओं के tracectories उपज. इन tracectories तो एक संख्यात्मक विश्लेषण ढांचे का उपयोग कर फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं और इन राज्यों के रिश्तेदार बहुतायत के प्रचलित diffusive राज्यों को निकालने का विश्लेषण कर रहे हैं. विश्लेषण ढांचा इंट्रासेल्यूलर ब्राउनियन प्रसार त्रासदियों के स्टोचैस्टिक सिमुलेशन पर आधारित है जो एक मनमाना सेल ज्यामिति द्वारा स्थानिक रूप से सीमित हैं। नकली tracectories के आधार पर, कच्चे एकल अणु छवियों उत्पन्न कर रहे हैं और प्रयोगात्मक छवियों के रूप में एक ही रास्ते में विश्लेषण किया. इस तरह, प्रयोगात्मक परिशुद्धता और सटीकता सीमाएं, जो प्रयोगात्मक जांचना मुश्किल है, स्पष्ट रूप से विश्लेषण कार्यप्रवाह में शामिल हैं। प्रचलित विधुर ीय राज्यों के प्रसार गुणांक और सापेक्ष जनसंख्या भिन्नों का निर्धारण नकली वितरणों के रैखिक संयोजनों का उपयोग करके प्रयोगात्मक मानों के वितरण को उपयुक्त करके किया जाता है। हम एक प्रोटीन है कि एक जीवाणु रोगज़नक़ के cytosol में होमो और विषम-ओलिगोमेरिक परिसरों के गठन पर विभिन्न diffusive राज्यों को दर्शाती है की diffusive राज्यों को हल करके हमारे प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन.

Introduction

जैव अणुओं के विच्छेत व्यवहार की जांच करने से उनके जैविक कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त होती है। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक अपने मूल कोशिका वातावरण में जैव अणुओं को देखने के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं। photobleaching के बाद फ्लोरोसेंट वसूली (FRAP) और फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस)1 पहनावा औसत diffusive व्यवहार प्रदान करते हैं. इसके विपरीत, एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प 2 ,3,4के साथ व्यक्तिगत फ्लोरोसेंटटैग अणुओं के अवलोकनमेंसक्षम बनाता है। व्यक्तिगत अणुओं को अवलोकन लाभप्रद है क्योंकि ब्याज की एक प्रोटीन विभिन्न विसरणीय राज्यों में मौजूद हो सकता है. उदाहरण के लिए, दो आसानी से भेद करने योग्य diffusive राज्यों उठता है जब एक प्रतिलिपि नियामक, जैसे Escherichia कोलाईमें CueR के रूप में, cytosol में स्वतंत्र रूप से diffuses या एक डीएनए अनुक्रम के लिए बांधता है और माप के timescale पर स्थिर हो जाता है5 . एकल अणु ट्रैकिंग इन विभिन्न राज्यों को सीधे देखने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है, और परिष्कृत विश्लेषण उन्हें हल करने के लिए आवश्यक नहीं हैं. हालांकि, कई विसारक राज्यों और उनकी जनसंख्या के भिन्नों को उन मामलों में हल करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है जहां उनकी विसरणदर दरें अधिक समान होती हैं। उदाहरण के लिए, विसरण गुणांक की आकार निर्भरता के कारण, प्रोटीन के विभिन्न अल्पीकरण अवस्थाएँ स्वयं को विभिन्न विसारक अवस्थाओं के रूप में प्रकट करती हैं6,7,8,9 , 10.ऐसे मामलों में डेटा अधिग्रहण, प्रसंस्करण और विश्लेषण के संदर्भ में एक एकीकृत दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

कोशिकाकोशिका अणुओं की विरूपक दरों को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक कोशिका सीमा द्वारा परिरोध का प्रभाव है। जीवाणु कोशिका सीमा द्वारा आण्विक गति पर लगाए गए प्रतिबंधों के कारण एक साइटोसोलिक अणुओं की मापित विसरण दर धीमी दिखाई देती है यदि एक ही गति एक अप्रतिबंधित स्थान में हुई थी। बहुत धीरे धीरे diffusing अणुओं के लिए, सेलुलर कारावास का प्रभाव सीमा के साथ टकराव की कमी के कारण नगण्य है. ऐसे मामलों में, ब्राउनियन गति के समीकरणों के आधार पर विश्लेषणात्मक मॉडलों का उपयोग करके आणविक विस्थापन, त,या स्पष्ट विसरण गुणांक, डी *के वितरण को सही ढंग से हल करना संभव हो सकता है ( यादृच्छिक विसरण)11,12,13. हालांकि, तेजी से diffusing cytosolic अणुओं के लिए, प्रयोगात्मक वितरण अब कोशिका सीमाओं के साथ diffusing अणुओं की टक्कर के कारण unconfined ब्राउनियन गति के लिए प्राप्त उन लोगों के समान. Confinement प्रभाव सही फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं के unconfined प्रसार गुणांक निर्धारित करने के लिए जिम्मेदार होना चाहिए. कई दृष्टिकोण हाल ही में कारावास प्रभाव या तो (अर्द्ध)) विश्लेषणात्मक 5, 14,15,16 या संख्यात्मक मोंटे कार्लो सिमुलेशन के माध्यम से खाते में विकसित किया गया है ब्राउनियन विसरण6,10,16,17,18,19.

यहाँ, हम एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी डेटा को एकत्रित करने और विश्लेषण करने के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें एकल-अणु ट्रैकिंग पर विशेष ध्यान दिया जाता है। प्रोटोकॉल के अंतिम लक्ष्य के अंदर फ्लोरोसेंट लेबल cytosolic प्रोटीन के diffusive राज्यों को हल करने के लिए है, इस मामले में, रॉड के आकार का जीवाणु कोशिकाओं. हमारा काम एकल अणु ट्रैकिंग के लिए पिछले प्रोटोकॉल पर बनाता है, जिसमें एक डीएनए पॉलिमरेज, पोली, प्रसार विश्लेषण20द्वारा डीएनए बाध्य और असीम राज्य में मौजूद दिखाई दिया गया था। यहाँ, हम 3 डी माप करने के लिए एकल अणु ट्रैकिंग विश्लेषण का विस्तार और अधिक यथार्थवादी गणना सिमुलेशन करने के लिए हल करने और कई diffusive राज्यों एक साथ कोशिकाओं में मौजूद मात्रा. डेटा एक घर में निर्मित 3 डी सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप जो डबल हेलिक्स बिंदु-स्प्रेड-फ़ंक्शन (DHPSF)21,22के साथ इमेजिंग द्वारा फ्लोरोसेंट emitters के 3 डी स्थिति का निर्धारण करने में सक्षम है का उपयोग कर हासिल कर लिया है। कच्चे एकल अणु छवियों कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण, जो तब एकल अणु tracectories में संयुक्त कर रहे हैं निकालने के लिए संसाधित कर रहे हैं. हजारों ट्रैजिकरी को स्पष्ट विसरण गुणांकों के वितरण के लिए एकत्रित किया जाता है। एक अंतिम चरण में, प्रयोगात्मक वितरण एक सीमित मात्रा में ब्राउनियन गति के मोंटे-कार्लो सिमुलेशन के माध्यम से प्राप्त संख्यात्मक रूप से उत्पन्न वितरण के साथ फिट हैं। हम इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए प्रकार 3 स्राव प्रणाली प्रोटीन YscQ के diffusive राज्यों को हल करने के लिए रहने वाले Yersinia enterocoliticaमें . इसकी मॉड्यूलर प्रकृति के कारण, हमारा प्रोटोकॉल आमतौर पर किसी भी प्रकार के एकल-अणु या एकल-कण ट्रैकिंग प्रयोग पर लागू होता है जो मनमाने सेल जियोमेटरी में होता है।

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Protocol

1. डबल-हेलिक्स बिंदु-स्प्रेड-फ़ंक्शन अंशांकन

नोट: इस में वर्णित छवियाँ और निम्नलिखित वर्गों एक कस्टम निर्मित उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में Rocha एट अल23में वर्णित है. यही प्रक्रिया एकल-अणु स्थानीयकरण और ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी 2,3,4के लिए अभिकल्पित विभिन्न सूक्ष्मदर्शी कार्यान्वयनों पर भी लागू होती है। छवि प्राप्ति और इस आलेख में वर्णित डेटा संसाधन के लिए सभी सॉफ़्टवेयर उपलब्ध है (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. कांच के आवरण पर्चियों पर नमूने लगाने के लिए अग्रोसो पैड तैयार करना माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाएगा।
    1. वजन कम पिघलने बिंदु agarose द्वारा 1.5-2% जोड़ें M2G बफर के 5 एमएल (4.9 mM ना2HPO4, 3.1 एमएम KH2पीओ4, 7.5 एमएम एनएच4सीएल , 0.5 एमएम MgSO4, 10 $M FeSO4, 0.5 m CaCl2 और 0.2% ग्लूकोज). कई सेकंड के लिए माइक्रोवेव जब तक सभी agarose भंग है. घोल को उबालने न दें।
    2. agarose समाधान कुछ मिनट (2-3 मिनट) के लिए शांत चलो.
    3. पिपेट 600 डिग्री सेल्सियस का एग्रोस विलयन कांच की आवरण स्लिप (22 मिमी x 22 मिमी)। धीरे से agarose के शीर्ष पर एक दूसरे गिलास कवर पर्ची जगह है. यह दो गिलास कवर फिसल जाता है के बीच एक पतली ($0.5 मिमी) agarose जेल पैड बनाता है.
    4. Agarose पैड $ 20 मिनट के लिए ठोस करने के लिए बैठते हैं।
    5. कांच के आवरण की पर्चियों को धीरे से अलग करें। Agarose पैड उनमें से एक के लिए रहना होगा।
    6. एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करना, बराबर आकार के चार वर्ग वर्गों में agarose पैड में कटौती. प्रत्येक वर्ग अनुभाग एक नमूना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. एक agarose पैड पर फ्लोरोसेंट मनका समाधान के Pipette 1.5 डिग्री सेल्सियस. बीड विलयन M2G में स्टॉक विलयन का 1/100000 कमजोर पड़ने है (सामग्री की सारणीदेखें) |
  3. agarose पैड उलटा और एक गिलास कवर पर्ची है कि 30 मिनट के लिए एक ओजोन क्लीनर में साफ किया गया है पर जगह है. सफाई के समय किसी भी फ्लोरोसेंट अणुओं coverslips के लिए पालन को खत्म करने के लिए चुना जाता है.
  4. एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर नमूना कवर ग्लास माउंट और चिपकने वाला टेप या वसंत भरी हुई नमूना धारक क्लिप का उपयोग कर जगह में सुरक्षित।
  5. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें.
  6. नमूना धारक को माइक्रोस्कोप पर रखें और उसे सुरक्षित रखें।
  7. माइक्रोस्कोप के कैमरे, नमूना चरण, और उत्तेजना लेज़रों को नियंत्रित करने के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) को प्रारंभ करें। यहाँ, MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ्टवेयर का प्रयोग यंत्र नियंत्रण के लिए किया जाता है (अनुपूरक चित्र 1)।
  8. कैमरा सॉफ्टवेयर HCImage लाइव प्रारंभ करें. कैमरा नियंत्रण अनुभाग के अंतर्गत कैप्चर टैब में, 0.03 s. कैमरे की लाइव फ़ीड शुरू करने के लिए लाइव क्लिक करें करने के लिए जोखिम समय सेट करें.
  9. पैड पर फ्लोरोसेंट मोती उत्तेजित और लाइव-स्ट्रीम मोड (यानी, कोई डेटा डिस्क के लिए बचाया) का उपयोग कर कैमरे पर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को देखने के लिए जीयूआई इंटरफ़ेस पर ओपन 514 एनएम लेजर पर क्लिक करके लेजर चालू करें।
  10. जीयूआई के 'माइक्रो-पोज स्टेज' अनुभाग के अंतर्गत 'XY-Pos' तीरों को क्लिक करके माइक्रोस्कोप चरण के X और Y स्थितियों को समायोजित करें ताकि क्षेत्र-की-दृश्य (एफओवी) के केंद्र में कम से कम एक फ्लोरोसेंट मनका की स्थिति हो। तीर के नीचे ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करके चरण आकार को बदला जा सकता है।
  11. जीयूआई के नैनो-पोजिशनिंग स्टेज अनुभाग के अंतर्गत जेड-पोस तीरों पर क्लिक करके माइक्रोस्कोप अवस्था की स्थिति को समायोजित करें। फ्लोरोसेंट मनका के डबल-हेलिक्स पॉइंट-स्प्रेड-फ़ंक्शन (DHPSF) के अभिविन्यास को ऊर्ध्वाधर होना निर्धारित करें। इस अनुलंब अभिविन्यास में प्रारंभिक बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है $-कैलिब्रेशन. तीर के नीचे ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करके चरण आकार को बदला जा सकता है।
  12. HCImage लाइव में, कब्जा के तहत | ट्रिगर मोड, गति और पंजीकरण, आंतरिक से बाहरी स्तर ट्रिगरकरने के लिए ट्रिगर मोड बदल जाते हैं। यह MATLAB GUI कैमरे को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देगा.
  13. अनुक्रम के तहत | स्कैन सेटिंग्स, 1200करने के लिए फ्रेम गिनती की संख्या बदल जाते हैं। लेबल बटन पर क्लिक करके एक सहेजें गंतव्य फ़ोल्डर चुनें .... अंत में प्रारंभ करें क्लिक करें. फ़्रेम गणनाओं की संख्या 1200 पर सेट की गई है ताकि 10 फ़्रेम्स को 120 स्थिति चरणों में से प्रत्येक के लिए संग्रहीत किया जा सके.
  14. $ पदों की एक श्रेणी के माध्यम से स्कैन करें (30 कदम ऊपर और 50 एनएम वेतन वृद्धि में प्रारंभिक स्थिति के नीचे) और रिकॉर्ड 10 फ्रेम 0.03 s के एक जोखिम समय का उपयोग कर प्रत्येक चरण पर. के तहत जाओ क्लिक करके स्वचालित प्रक्रिया शुरू जीयूआई.
    नोट: अंशांकन के लिए पैरामीटर, कदम लंबाई सहित, कदम की संख्या, कैमरा जोखिम समय, और कदम प्रति फ्रेम की संख्या यहाँ के रूप में अच्छी तरह से समायोजित किया जा सकता. के बारे में 105 फोटॉनों एक एकल फ्रेम में एक फ्लोरोसेंट मनका से प्राप्त किया जा सकता है 0.03 s जोखिम समय का उपयोग कर x, y, z स्थानीयकरण परिशुद्धता के बारे में 1 एनएम के परिणामस्वरूप.
  15. जीयूआई में बंद 515 एनएम लेजर पर क्लिक करके लेजर रोशनी बंद करें। HCImage लाइव में, कब्जा के तहत | ट्रिगर मोड, गति और पंजीकरण, आंतरिककरने के लिए वापस ट्रिगर मोड बदल जाते हैं। अनुक्रम के तहत | स्कैन सेटिंग्स 200 करने के लिए फ्रेम गिनती की संख्या बदल जाते हैं। लेबल बटन पर क्लिक करके एक सहेजें गंतव्य फ़ोल्डर चुनें .... 0.03 s जोखिम समय के साथ अंधेरे छवियों के 200 फ्रेम इकट्ठा करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें।
    नोट: यहां तक कि डिटेक्टर पर गिरने प्रकाश के अभाव में, प्रत्येक पिक्सेल एक सकारात्मक संख्या (अंधेरे ऑफसेट मूल्य के रूप में संदर्भित) पढ़ा होगा, जो पिक्सल के बीच थोड़ा भिन्न हो सकते हैं. समय के साथ अंधेरे ऑफ़सेट मान परिवर्तित हो सकता है। इसलिए, यह प्रत्येक अंशांकन के लिए अंधेरे फ्रेम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है।
  16. मनका के एक्स और वाई पदों को प्राप्त करने के लिए आसान-DHPSF सॉफ्टवेयर24 का उपयोग कर एक डबल-Gausian मॉडल के साथ DHPSF फ़िट, साथ ही एक कोण बनाम - अंशांकन वक्र.
    1. MATLAB में आसान-DHPSF सॉफ्टवेयर शुरू करें। सेटअपके अंतर्गत , चैनल को G पर सेट करें और डीजी मॉडल के साथ MLEके लिए फिटिंग विधि सेट करें . जी हरी चैनल कैमरा को संदर्भित करता है, के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेटा अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हरे रंग की तरंगदैर्ध्य के साथ उत्सर्जन करता है. डीजी मॉडल के साथ MLE डबल-गाऊसी मॉडल के साथ अधिकतम संभावना अनुमान को संदर्भित करता है।
      नोट: पिक्सेल आकार और कनवर्ज़न लाभ विशिष्ट ऑप्टिकल सेटअप पर निर्भर हैं, और परिवर्तित करने के लिए आवश्यकता हो सकती है।
    2. Calibrate DHPSF अनुभाग के अंतर्गत, चलाएँक्लिक करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें.
    3. चरण 1.13-1.14 में सहेजे गए छवि स्टैक का चयन करें. अगला, चरण 1.15 में सहेजी गई अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ छवि स्टैक का चयन करें. अंत में, चरण 1.14 के दौरान स्वचालित रूप से सहेजी गई .txt फ़ाइल का चयन करें. इस फ़ाइल में स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान चरण की $ स्थिति है.
    4. अगले पॉप-अप विंडो में, अगर पूर्ण कैमरा चिप को देखने के क्षेत्र के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, इनपुट चिप पर शुरू x0 और y0 पदों. अन्यथा, इनपुट x0 ] 1 और y0 $ 1.यह जानकारी Binning और SubArrary अनुभाग के तहत HCImage लाइव में पाया जा सकता है.
    5. निम्न विंडो में, आकार और यह आकार में लगभग 100 x 100 पिक्सेल है और एक एकल फ्लोरोसेंट DHPSF संकेत पर केंद्रित है ताकि फ्लोरोसेंट मोती की छवि पर प्रकट होता है कि बॉक्स का आकार और स्थिति। उसके बाद, जारी रखने के लिए डबल-क्लिक करें।
      नोट: चुना DHPSF अन्य DHPSF संकेतों से अलग किया जाना चाहिए और आदर्श प्रतिभाशाली मनका संभव हो.
    6. DHPSF संकेत के केंद्र में क्लिक करें, दो पालियों के बीच में, तो हिट दर्ज करें| निम्न विंडो चुना DHPSF का ज़ूम-इन दृश्य दिखाता है। अधिक ठीक क्लिक करके DHPSF के केंद्र के स्थान का चयन करें.
      नोट: कार्यक्रम तो DHPSF फिट होगा, और कच्चे छवि और फिट से पुनर्निर्माण प्रदर्शित करें. यह भी अलग अलग स्थानों पर एक DHPSF पार अनुभाग के लिए इसी से $ अंशांकन से टेम्पलेट छवियों का उत्पादन होगा. इनका उपयोग बाद में प्रयोगात्मक आंकड़ों की फिटिंग के लिए किया जाएगा। कार्यक्रम एक्स, वाई उत्पादन होगा, और प्रत्येक फ्रेम में अनुमानित जेड स्थिति. एक अच्छी तरह से गठबंधन ऑप्टिकल प्रणाली में, एक्स और Y बहुत कम परिवर्तन करना चाहिए ($ 30 एनएम विचलन) के रूप में $ स्थिति में परिवर्तन. यदि आउटपुट भिन्नता 30 दउ से अधिक है, तो इमेजिंग सिस्टम के फूरी तल में स्थित प्रावस्था मास्क (चित्र 1)को पुनर्संरेखित किया जाना चाहिए तथा 1-9-1-16 के चरण दोहराए जाने चाहिए।
    7. GUI के ऊपरी बाएँ कोने में सहेजें चिह्न पर क्लिक करके आसान-DHPSF GUI सहेजें। यह बाद में GUI में लोड आइकन पर क्लिक करके लोड किया जा सकता है.
      नोट: तापमान में उतार-चढ़ाव या यांत्रिक कंपन के कारण हुई हो सकता है कि माइक्रोस्कोप में संरेखण परिवर्तन के लिए खाते के लिए एक प्रयोग के प्रत्येक दिन पर अंशांकन प्रक्रिया आयोजित किया जाना चाहिए।

2. बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी

  1. बैक्टीरियल सेल के विकास का समर्थन संस्कृति मीडिया तैयार करें। Y. enteroolitica केलिए, BHI के 5 एमएल का उपयोग करें (ब्रेन हार्ट इन्फ्यूजन) शोरबा युक्त nalidixic एसिड (35 g/mL) और 2,6-diaminopimelic एसिड (80 g/ यहाँ, एक वाई enterocolitica तनाव का उपयोग किया जाता है कि प्रोटीन YscQ फ्लोरोसेंट प्रोटीन eYFP23के साथ टैग किया गया है.
  2. फ्रीजर स्टॉक या प्लेट संस्कृतियों से जीवाणु संस्कृतियों के साथ मीडिया टीका.
  3. रात भर मिलाते हुए के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हो जाना।
  4. ताजा संस्कृति मीडिया का उपयोग कर 5 एमएल के लिए संतृप्त रात भर संस्कृति की एक छोटी राशि ($250 जेडएल) को हल।
  5. 60-90 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हो जाना।
  6. फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। Y. enterocoliticaके लिए, गर्मी एक पानी शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को झटका योप regulon प्रेरित करने के लिए.
  7. झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 3 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर संस्कृति के 1 एमएल सेंट्रीफ्यूज। महादलित को त्याग दें।
  9. M2G मीडिया के 1 एमएल के साथ 3 बार गोली धो लो.
  10. M2G मीडिया के $ 250 डिग्री एल में गोलीदार बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें।
  11. fiducial मार्करों के रूप में फ्लोरोसेंट मोती जोड़ें. फ्लोरोसेंट मनका समाधान उचित रूप से पतला मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए, ताकि माइक्रोस्कोप में देखे जाने पर प्रति FOV केवल 1-2 मोती हों।
  12. एकत्रित कोशिकाओं को अलग करने के लिए निलंबन को धीरे-धीरे पिपेट या भंवर।
  13. प्लेट 1.5 $L निलंबन के एक 1.5-2% agarose पैड M2G के साथ बनाया पर.
  14. अगारोस पैड को उलटें और इसे ओजोन-क्लीन माइक्रोस्कोप कवर स्लिप पर रखें। कवर पर्ची किसी भी अंतर्निहित फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए 30 मिनट के लिए एक ओजोन क्लीनर में रखा जाना चाहिए।

3. डेटा अधिग्रहण

  1. एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर नमूना कवर ग्लास माउंट और चिपकने वाला टेप या वसंत भरी हुई नमूना धारक क्लिप का उपयोग कर जगह में सुरक्षित।
  2. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें, तो माइक्रोस्कोप पर नमूना धारक जगह है और यह जगह में सुरक्षित.
  3. माइक्रोस्कोप के कैमरे, नमूना चरण, और उत्तेजना लेज़रों को नियंत्रित करने के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) को प्रारंभ करें। यहाँ, MATLAB में कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर साधन नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है.
  4. कैमरा सॉफ्टवेयर HCImage लाइव प्रारंभ करें. कैमरा नियंत्रण अनुभाग के अंतर्गत कैप्चर टैब में, प्रदर्शन समय को 0.025 s पर सेट करें. कैमरे की लाइव फ़ीड शुरू करने के लिए लाइव क्लिक करें.
  5. नमूने के चारों ओर स्कैन और जीवाणु कोशिकाओं की एक उचित रूप से घनी आबादी के साथ एक FOV खोजने के लिए जीयूआई के माइक्रो-पोज चरण अनुभाग के तहत XY-Pos तीर पर क्लिक करके माइक्रोस्कोप चरण के एक्स और वाई पदों को समायोजित करें।
    नोट: डेटा थ्रूपुट को अधिकतम करने के लिए, कोशिकाओं को ओवरलैपिंग या स्पर्श कोशिकाओं के बिना, जितना संभव हो उतना घना होना चाहिए। FOV भी शामिल होना चाहिए कम से कम 1 फ्लोरोसेंट मनका एक fiducial मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, अधिमानतः FOV के एक कोने में तैनात.
  6. जीयूआई के नैनो-पोजिशनिंग स्टेज सेक्शन के अंतर्गत जेड-पोस तीरों को क्लिक करके माइक्रोस्कोप चरण की स्थिति को समायोजित करें, ताकि फ्लोरोसेंट मनका के DHPSF लोब ऊर्ध्वाधर हों।
  7. अनुक्रम के तहत | स्कैन सेटिंग्स,20,000 करने के लिए फ्रेम मायने रखता है की संख्या बदल जाते हैं। लेबल बटन पर क्लिक करके एक सहेजें गंतव्य फ़ोल्डर चुनें .... अंत में 0.025 s. eYFP photoblinking के एक कम जोखिम समय का उपयोग कर 20,000 कैमरा फ्रेम को इकट्ठा करने के लिए शुरू क्लिक करें 514 एनएम19,25पर उच्च तीव्रता उत्तेजना प्रकाश का उपयोग शुरू की है .
    नोट: यहाँ, फोकल विमान में $ 350 W/cm2 की एक लेजर तीव्रता प्रारंभिक विरंजन और एकल EYFP अणुओं के बाद इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. इमेजिंग के दौरान यूवी तरंगदैर्ध्य पर ईवाईएफपी अणुओं के प्रकाश सक्रियण का उपयोग नहीं किया गया था। जीवाणु कोशिका प्रति अधिकांश एक अणु संकेत होना चाहिए। एकल अणु संकेत का घनत्व शुरू में बहुत अधिक है, तो डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले पर्याप्त photobleaching होता है जब तक रोशन करने के लिए जारी.
  8. जीयूआई में बंद 515 एनएम लेजर पर क्लिक करके लेजर रोशनी बंद करें। एक ही जोखिम समय का उपयोग कर अंधेरे छवियों के 200 फ्रेम ले लीजिए।
  9. GUI में, Thorlabs एलईडी के बगल में बॉक्स की जाँच करें और टॉगल मिरर अपक्लिक करें। यह फ्लोरोसेंट मार्ग से चरण विपरीत मार्ग के लिए मार्ग स्विच जाएगा.
  10. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर आईसी कैप्चर 2.4प्रारंभ करें। यह चरण विपरीत मार्ग में कैमरे को नियंत्रित करता है. कैमरे से लाइव फ़ीड देखने के लिए प्रारंभ/स्टॉप लाइव प्रदर्शन बटन दबाएँ. कैप्चर क्लिक करें ] फ़ील्ड-ऑफ-व्यू में कक्षों की चरण कंट्रास्ट छवि एकत्रित करने के लिए छवि सहेजें.
  11. अतिरिक्त FOVs के लिए चरण 3.5-3.10 दोहराएँ. यहाँ, दस अलग FOVs में 500 बैक्टीरिया कोशिकाओं से प्राप्त डेटा विश्लेषण के लिए उपलब्ध एकल अणु tracectories की संख्या में वृद्धि करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    चेतावनी: लंबे समय के लिए agarose पैड पर घुड़सवार कोशिकाओं ताजा घुड़सवार कोशिकाओं की तुलना में अलग ढंग से व्यवहार कर सकते हैं. साथ ही, agarose पैड अपनी अखंडता कुछ समय के बाद खो सकते हैं, जो प्रतिकूल रूप से डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. आमतौर पर, सबसे अधिक 3 FOV (माइक्रोस्कोप पर $ 30 मिनट) नमूना स्लाइड प्रति उपयोग किया जाता है.

4. डेटा प्रसंस्करण

नोट: आसान DHPSF सॉफ्टवेयर24 का एक संशोधित संस्करण एकल अणु स्थानीयकरण निकालने के लिए कच्चे कैमरे के फ्रेम के विश्लेषण के लिए MATLAB में प्रयोग किया जाता है। आसान DHPSF एकल अणु इमेजिंग में DHPSF स्थानीयकरण फिट करने के लिए विशेष रूप से प्रयोग किया जाता है. कस्टम परिवर्तन अधिकतम संभावना अनुमान (MLE) आधारित फिटिंग दिनचर्या है कि आधुनिक sCMOS कैमरों26के पिक्सेल पर निर्भर शोर विशेषताओं के लिए खातों को लागू करने के लिए किए गए थे. यह भी HCImage लाइव प्रोग्राम (.dcimg) से छवि फ़ाइल प्रकार उत्पादन को स्वीकार करने के लिए संशोधित किया गया था. सॉफ़्टवेयर और व्यक्तिगत चरणों के अधिक विस्तृत विवरण के लिए, कृपया Lew et al.24 देखें

  1. MATLAB में आसान-DHPSF GUI प्रारंभ करें(पूरक चित्र 2). चरण 1.16.8 में सहेजी गई फ़ाइल में लोड.
  2. चरण 1.16.7 में 7 टेम्पलेट आउटपुट में से प्रत्येक के लिए थ्रेशोल्ड मानों का निर्धारण
    1. कैलिब्रेट SM पहचान अनुभाग के अंतर्गत, चलाएँक्लिक करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न दो पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें.
    2. संकेत मिलने पर पहले FOV से डेटा युक्त छवि स्टैक खोलें.
    3. टेम्पलेट से मेल खाने के लिए फ़्रेम्स की एक छोटी श्रेणी चुनें. आमतौर पर फ्रेम 1001-2000 पहले कई सौ फ्रेम में घने ओवरलैपिंग संकेतों से बचने के लिए उपयोग किया जाता है। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें. निम्न विंडो में अनुक्रम लॉग फ़ाइल के लिए संकेत दिए जाने पर रद्द करें क्लिक करें।
    4. चरण 3.8 में सहेजी गई अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ छवि स्टैक खोलें. डिफ़ॉल्ट पर सेट पृष्ठभूमि estimation के लिए पैरामीटर छोड़ने के लिए निम्न पॉप-अप विंडो में 'ठीक' क्लिक करें। डिफ़ॉल्ट वर्तमान फ्रेम के आसपास 100 बाद कैमरा फ्रेम को कवर एक औसत फिल्टर27 का उपयोग कर पृष्ठभूमि का अनुमान है.
    5. अगली विंडो में, पूर्ण FOV को कवर करने के लिए छवि पर मढ़ा हुआ बॉक्स का आकार बदलें, फिर जारी रखने के लिए डबल-क्लिक करें.
    6. एक बहुभुज बनाने के लिए छवि पर कई बिंदुओं पर क्लिक करके ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें. ब्याज के क्षेत्र के रूप में संभव के रूप में देखने के क्षेत्र के रूप में ज्यादा शामिल होना चाहिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि किसी भी फ्लोरोसेंट मोती (बहुत उज्ज्वल वस्तुओं) छवि में बहुभुज के भीतर रखना नहीं है, तो जारी रखने के लिए डबल क्लिक करें.
      नोट: सॉफ्टवेयर तो छवि के लिए टेम्पलेट्स से मेल करने का प्रयास करेंगे, और संभव मेल वृत्त के साथ एक छवि प्रदर्शित करेगा.
    7. जब सॉफ्टवेयर बंद कर दिया है, यह पाया टेम्पलेट मैचों के कई छवियों को बचाने के लिए और एक पूर्व निर्धारित फ़ोल्डर में इसी सीमा मान प्रदर्शित करेगा. उच्च थ्रेशोल्ड मान एक बेहतर मिलान से संबंधित है. प्रत्येक टेम्पलेट संख्या के लिए, उदाहरण से मेल खाता है की जाँच करें और DHPSF की छवि दर्शाती सबसे कम थ्रेशोल्ड निर्धारित करें। आसान-DHPSF GUI में कैलिब्रेट SM पहचान अनुभाग के अंतर्गत 7 टेम्पलेट्स में से प्रत्येक के लिए इन थ्रेशोल्ड इनपुट करें।
      नोट: प्रोग्राम स्वचालित रूप से चुनने का प्रयास करेगा और इनपुट थ्रेशोल्ड, हालांकि, ये अक्सर अविश्वसनीय होते हैं और मैन्युअल रूप से चेक किया जाना चाहिए। थ्रेसहोल्ड को इस तरह चुना जाता है कि कुछ सच्चे एकल-अणु संकेतों को याद किया जाता है, लेकिन फिटिंग के लिए झूठे सकारात्मक उम्मीदवारों की संख्या गणनात्मक रूप से प्रबंधनीय बनी हुई है।
    8. ऊपरी बाएँ कोने में सहेजें चिह्न पर क्लिक करके आसान-DHPSF GUI फिर से सहेजें।
  3. एक fiducial मार्कर के रूप में उपयोग करने के लिए FOV में फ्लोरोसेंट मनका फिटिंग
    1. आसान-DHPSF GUI के ट्रैक fiduciaries अनुभाग के अंतर्गत, चलाएँक्लिक करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न दो पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें.
    2. छवि पर मढ़ा बॉक्स खींचें और फ्लोरोसेंट मनका से DHPSF संकेत पर यह केंद्र, तो डबल क्लिक करें.
    3. DHPSF संकेत के केंद्र में क्लिक करें, दो lobes के बीच midpoint पर, तो दर्ज मारा. निम्न विंडो में अनुक्रम लॉग फ़ाइल के लिए संकेत दिए जाने पर रद्द करें क्लिक करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर सभी कैमरा फ्रेम में DHPSF फिट होगा, और कच्चे छवि और पुनर्निर्माण छवि प्रदर्शित करते हैं. जब सॉफ्टवेयर समाप्त हो गया है, यह एक्स, वाई के साथ आंकड़े उत्पादन होगा, और छवि अधिग्रहण की अवधि में फ्लोरोसेंट मनका के $ पदों.
    4. fiduciaries का उपयोग करें और ऊपरी बाएँ कोने में सहेजें आइकन पर क्लिक करके फिर से आसान DHPSF GUI सहेजें के बगल में बॉक्स की जाँच करें.
  4. चरण 4.2 में प्राप्त टेम्पलेट थ्रेशोल्ड का उपयोग करके सभी कैमरा फ़्रेम्स में सभी स्थानीयकरण ढूँढें और फ़िट करें.
    1. आसान DHPSF GUI के DHPSF SMs अनुभाग स्थानीयकरण के अंतर्गत, चलाएँक्लिक करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें. निम्न विंडो में अनुक्रम लॉग फ़ाइल के लिए संकेत दिए जाने पर रद्द करें क्लिक करें।
      नोट: मैच की गुणवत्ता यूज़र-डिफ़ाइंड सीमा से ऊपर है, तो सॉफ्टवेयर मिल जाएगा और एक डबल-गाऊसी मॉडल का उपयोग कर DHPSF फिट। यह टेम्पलेट मैचों के आसपास हलकों के साथ कच्चे छवि के साथ ही पुनर्निर्माण DHPSF फिट बैठता है की एक छवि प्रदर्शित करेगा.
    2. ऊपरी बाएँ कोने में सहेजें चिह्न पर क्लिक करके आसान-DHPSF GUI फिर से सहेजें।
  5. एकल-अणु स्थानीयकरण देखना और अवांछित या अविश्वसनीय स्थानीयकरण को फ़िल्टर करना
    1. आउटपुट DHPSF SM स्थानीयकरण अनुभाग के अंतर्गत फ़िल्टर आउटपुटक्लिककरें।
    2. समय के साथ fiducial X,Y, और $ स्थिति का एक प्रक्षेप करने के लिए निम्न तीन विंडो में ठीक क्लिक करें। अधिकांश मामलों में, डिफ़ॉल्ट विकल्प पर्याप्त हैं। यदि काली अंतर्वेधित रेखा लाल स्थिति रेखा का उचित अंतर्वेशन प्रतिबिंबित नहीं करती है, तो पॉप-अप विंडो में अंतर्वेशन पैरामीटर परिवर्तित करें.
      नोट: अंतर्विष्ट रेखा का उपयोग एकल-अणु स्थानीयकरण को सही करने के लिए चरण-प्रवाह के लिए किया जाता है।
    3. संकेत मिलने पर विश्लेषण किए जाने वाले FOV के लिए संबंधित चरण कंट्रास्ट छवि खोलें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने के लिए निम्न दो पॉप-अप विंडो पर ठीक क्लिक करें.
    4. निम्न दो पॉप-अप विंडो में, अधिक सख्त या अधिक उदार एकल-अणु स्थानीयकरण आवश्यकताओं के लिए अनुमति देने के लिए फ़िल्टर मान परिवर्तित करें, फिर ठीकक्लिक करें.
    5. दिखाई देने वाली विंडो में, रुचि के वांछित क्षेत्र को देखने के लिए छवियों पर मढ़ा हुआ बॉक्स खींचें या आकार बदलें और जारी रखने के लिए डबल-क्लिक करें.
    6. एकल अणु स्थानीयकरण के एक 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शित किया जाता है. पुनर्निर्माण में हेरफेर करने के लिए आंकड़ा उपकरण का उपयोग करें (रोटेट, ज़ूम, आदि). 'आप किसी भिन्न पैरामीटर सेट केसाथ replot करना चाहेंगे'पूछ एक और संवाद बॉक्स प्रदर्शित करने के लिए जारी रखें क्लिक करें? ' यदि परिणाम संतोषजनक हैं, तो नहींक्लिक करें. यदि वे नहीं हैं, तो हाँक्लिक करें.
      नोट: सामान्य कारण असंतोषजनक परिणाम के लिए चरण कंट्रास्ट छवि सही रूप से स्थानीयकरण डेटा के साथ मढ़ा जा रहा नहीं शामिल हैं या प्रारंभिक टेम्पलेट थ्रेशोल्ड कई गलत सकारात्मक स्थानीयकरण बनाने बहुत कम थे। यदि हाँ चुना गया था, तो सॉफ़्टवेयर चरण 4.5.4 पर वापस आ जाएगा ताकि नए पैरामीटर मान निर्धारित किए जा सकें. यदि नहीं चुना गया था, तो परिणाम सहेजे जाएँगे.

5. डेटा पोस्ट प्रसंस्करण

  1. MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, चरण कंट्रास्ट छवि को क्रॉप करें ताकि केवल वह क्षेत्र जिसमें वे कक्ष हों जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे छवि वाले थे। यह चरण आवश्यक है क्योंकि चरण कंट्रास्ट छवि एक क्षेत्र को शामिल किया गया है जो फ्लोरोसेंट छवि से बहुत बड़ा है। छवि फसल अगले कदम सरल करता है.
  2. OUFTI28 सॉफ्टवेयर के साथ चरण विपरीत छवि संसाधित करके अलग-अलग कोशिकाओं को विभाजित करें (अनुपूरक चित्र 3)
    1. MATLAB में OUFTI प्रारंभ करें. लोड चरणपर क्लिक करके पिछले चरण से फसली चरण विपरीत छवि लोड करें।
    2. आउटपुट फ़ाइल के लिए सहेजने के स्थान को चुनने और नाम देने के लिए फ़ाइल क्लिक करें.
    3. पता लगाना और विश्लेषण शीर्षक के अंतर्गत स्वतंत्र फ़्रेम्स का चयन करें.
    4. कक्ष खोज के लिए पैरामीटर लोड करने के लिए पैरामीटर लोड करें क्लिक करें. पैरामीटर के उदाहरण स्वीकार्य कक्ष क्षेत्र, कक्ष चौड़ाई और कक्ष विभाजन थ्रेशोल्ड शामिल हैं।
      नोट: इन पैरामीटर के सभी विशिष्ट सेल आकार और छवि गुणवत्ता का उपयोग किया जा रहा के लिए प्रदर्शन को अधिकतम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, एल्गोरिथ्म पैरामीटर सेल रूपरेखा का सटीक माप के लिए अनुमति देने के लिए subpixel करने के लिए सेट किया जाना चाहिए.
    5. कक्ष विभाजन प्रारंभ करने के लिए यह फ़्रेम क्लिक करें. प्रक्रिया समाप्त होने पर कक्ष बाह्यरेखाएँ प्रावस्था कंट्रास्ट छवि पर दिखाई देंगी.
    6. मैन्युअल अनुभाग के अंतर्गत नियंत्रणों का उपयोग करना, कक्ष विभाजित करें, कक्ष जोड़ें, या स्वचालित प्रक्रिया के दौरान गलत तरीके से विभाजित कक्षों के लिए बाह्यरेखाएँ प्राप्त करने के लिए कक्ष बाह्यरेखाएँ परिशोधित करें.
    7. विश्लेषण सहेजेंपर क्लिक करके कक्ष की रूपरेखा प्रस्तुत करें.
  3. एकल अणु स्थानीयकरण के साथ पिछले चरण में प्राप्त बाह्यरेखाओं को ठीक से ओवरले करने के लिए MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। निम्न उपचरणों सॉफ़्टवेयर के चरणों का विवरण देते हैं.
    1. मैन्युअल रूप से पॉप-अप विंडो में 5 नियंत्रण बिंदु युग्मों का चयन मोटे तौर पर आकलन करके और पिछले चरण में उत्पन्न एकल-अणु स्थानीयकरण डेटा और सेल रूपरेखा में समान पांच कोशिकाओं के सेल ध्रुवों की स्थिति पर क्लिक करके करें। सेल पोल की स्थिति का अनुमान एक सेल से संबंधित एकल अणु स्थानीयकरणों के चारों ओर एक उत्तल पतवार को मानसिक रूप से खींचकर और उच्चतम वक्रता(पूरक चित्र 4)के बिंदु का चयन करके मोटे तौर पर लगाया जा सकता है।
    2. MATLAB में cp2tform फ़ंक्शन का उपयोग करके एक 2D सफ़न रूपांतरण फ़ंक्शन जनरेट करें और इसका उपयोग सेल बाह्यरेखा और एकल-अणु स्थानीयकरण के किसी न किसी ओवरले को उत्पन्न करने के लिए करें।
    3. 10 से कम स्थानीयकरण वाले कक्ष हटाएँ और उन कक्षों को निकालें जो आंशिक रूप से फ़ील्ड-की-दृश्य के बाहर स्थित हैं. अपनी कक्ष बाह्यरेखा के अंदर क्लिक करके पॉप-अप विंडो में किसी भी अतिरिक्त अवांछित कक्ष को मैन्युअल रूप से हटाएँ (अनुपूरक चित्र 5).
    4. सभी शेष सेल रूपरेखा और उनके भीतर एकल अणु स्थानीयकरण के लिए द्रव्यमान के केंद्र का उपयोग नियंत्रण बिंदु जोड़े का एक बड़ा सेट बनाने के लिए, 2D रूपांतरण फ़ंक्शन को फिर से संकलित करें, और सेल बाह्यरेखाओं के अंतिम ओवरले को उत्पन्न करने के लिए इसका उपयोग करें और एक अणु स्थानीयकरण.
    5. स्थानीयकरण असाइन करें जो किसी कक्ष की सीमा के भीतर स्थित होते हैं, जो उस कक्ष को बाह्यरेखांकित करते हैं. किसी भी स्थानीयकरण को किसी कक्ष बाह्यरेखा में स्थित नहीं छोड़ें(चित्र 2क, अनुपूरक चित्र 6) .

6. एकल अणु ट्रैकिंग

नोट: निम्न अनुभाग MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर पूरा हो गया है। यह अनुभाग सॉफ़्टवेयर द्वारा निष्पादित किए जाने वाले चरणों का वर्णन करता है.

  1. एक ही सेल को और बाद के कैमरा फ़्रेममेंज़ को असाइन किए गए स्थानीयकरणों के लिए, स्थानीयकरणों के बीच यूक्लिडियन दूरी की गणना करें. यदि स्थानीयकरणों के बीच की दूरी 2ण्5 उ की सीमा से कम है, तो स्थानीयकरणों को उसी एकल-अणु प्रक्षेप पथ से जोड़कर लिंक करें।
    नोट: यह केवल एक ही सेल के भीतर स्थानीयकरण पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, ताकि स्थानिक और लौकिक सीमा आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए होने वाले आसन्न कोशिकाओं में स्थानीयकरण जुड़े नहीं हैं। 2.5 डिग्री मीटर सीमा अधिकतम दूरी के रूप में चुना गया था एक बहुत तेजी से अणु (30 डिग्री2/s) जोखिम समय की लंबाई में यात्रा कर सकता है (0.025 s) प्लस एक 20% बफर.
  2. 4 स्थानीयकरणों की तुलना में कम ट्रैजेक्टरी को छोड़ें। यदि दो या अधिक स्थानीयकरण (यानी, दो या अधिक fluorescing emitters) एक साथ एक सेल में मौजूद हैं, तो संबंधित tracectories छोड़ दें. 4 स्थानीयकरण करने के लिए ट्रैक लंबाई न्यूनतम स्थापना प्रसार गुणांक का एक अधिक सटीक अनुमान उपज कई दूरी माप औसत होने की अनुमति देता है.
  3. किसी दिए गए प्रक्षेप पथ के लिए माध्य वर्गित विस्थापन (एमएसडी) की गणना करें:
    Equation 1(1)
    जहाँ छ प्रक्षेप पथ में स्थानीयकरणों की कुल संख्या है तथा गद समय बिंदुद पर अणु की स्थिति है।
  4. स्पष्ट विसरण गुणांक की गणना करें, D* द्वारा
    Equation 2(2)
    जहाँ m ] 2 या 3 माप की आयामीता है और [t कैमरा जोखिम समय है.
    नोट: एक ठेठ प्रयोग कुल में $ 5,000-100,000 tractories का उत्पादन होगा, कि कई मायने रखता है के साथ एक स्पष्ट प्रसार गुणांक वितरण में जिसके परिणामस्वरूप.

7. एक सीमित मात्रा में ब्राउनियन गति के मोंटे-कार्लो सिमुलेशन

नोट: एक बेलनाकार मात्रा तक ही सीमित ब्राउनियन गति के मोंटे कार्लो सिमुलेशन प्रदर्शन करके नकली स्पष्ट प्रसार गुणांक वितरण के पुस्तकालयों बनाएँ, इनपुट पैरामीटर के रूप में 0.05-20 डिग्री2/ अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध). इस रेंज बैक्टीरिया में फ्लोरोसेंट (फ्यूजन) प्रोटीन के पहले अनुमानित प्रसार गुणांक की सीमा को कवर करने के लिए चुना गया था। 64 विसरण गुणांकों का उपयोग इस श्रेणी के नमूने के लिए पर्याप्त रूप से किया जाताहै . यह अनुभाग MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है और सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से उठाए जाने वाले चरणों का वर्णन करता है. यहाँ प्रयुक्त छड़ के आकार की Y एंटरोकोलिटिका कोशिकाएँ लंबाई के बेलनाकार आयतन l र् 5 उ तथा व्यास घ र् 0ण्8 उ द्वारा सन्निकट होती हैं।

  1. बेलनाकार मात्रा में एक यादृच्छिक स्थिति पर व्यक्तिगत traectories आरंभ, और उनके यादृच्छिक अनुकरण (यानी, ब्राउनियन) प्रसार कदम 100 एन एस के एक समय अंतराल का उपयोग कर (समय अंतराल पर्याप्त सक्षम करने के लिए कैमरा जोखिम समय की तुलना में बहुत कम होना चाहिए एक कैमरा फ्रेम के पाठ्यक्रम पर स्थिति का नमूना). एक इनपुट D के लिए प्रत्येक विस्थापन चरण के लिए इसी गाऊसी वितरण फ़ंक्शन से EQn. 2 की पुनर्व्यवस्थित करके नमूना करें और इसे पिछली स्थिति में जोड़ें:
    Equation 3(3)
    जहां MATLAB में randn समारोह एक सामान्य वितरण से एक यादृच्छिक संख्या नमूने. यदि कोई चरण अणु को बेलन की आयतन के बाहर विस्थापित करने का कारण बनता है, तो एक यादृच्छिक कोण पर बेलन के अंदर अणु को प्रतिबिंबित कीजिए।
  2. प्रत्येक समय अंतराल के लिए, एक DHPSF छवि उत्पन्न करें जो नकली उत्सर्जक की तात्कालिक x,y,z स्थिति से मेल खाती है.
    1. प्रयोगात्मक शर्तों से मेल करने के लिए, प्रति स्थानीयकरण 1,000 फोटॉनों वाली छवियों का अनुकरण करें, पिक्सेल प्रति 13 फोटॉनों की लेजर पृष्ठभूमि के साथ, और पॉइसन शोर. इसके अलावा, प्रति पिक्सेल $ 50 फोटॉनों के अंधेरे ऑफसेट जोड़ें और गॉसियन पढ़ने के शोर ($ 1.5 फोटॉन), प्रयोगात्मक कैमरा अंशांकन माप के साथ संगत। अंत में, डिटेक्टर मायने रखता है की इकाइयों में छवि प्राप्त करने के लिए CMOS कैमरा के प्रयोगात्मक मापा पिक्सेल पर निर्भर लाभ से छवि गुणा.
      नोट: इन जोड़तोड़ के बाद, अंतिम छवि के संकेत-से-शोर अनुपात $ 2 है।
    2. प्रयोगात्मक डेटा अधिग्रहण के दौरान इस्तेमाल किया जोखिम समय के दौरान नकली 50 DHPSF छवियों संक्षेप द्वारा अणुओं की बदलती स्थिति को प्रतिबिंबित कि गति-धब्बे छवियों उत्पन्न. गणना व्यय को सीमित करने के लिए, केवल 50 समय-समय पर नमूना पदों एक छवि उत्पन्न करने के लिए चुना गया (सभी 250,000 पदों के बजाय 100 ns के एक नमूना अंतराल पर एक 0.025 s जोखिम समय के दौरान नमूना).
      नोट: नकली tracectories की लंबाई (फ्रेम की संख्या) प्रयोगात्मक tracectories की औसत लंबाई से मेल खाना चाहिए. इस मामले में, प्रति प्रक्षेप पथ फ्रेम की संख्या 6 है.
  3. 64 नकली इनपुट प्रसार गुणांकों में से प्रत्येक के लिए 5,000 ट्रैजेक्टरी उत्पन्न करें।
  4. डेटा संसाधन अनुभाग में वर्णित के रूप में नकली कैमरा फ़्रेम का विश्लेषण करें।
  5. एकल-अणु ट्रैकिंग अनुभाग में वर्णित के रूप में tradictories में स्थानीयकरण लिंक.
  6. आदेश 25 के B-spline अंतर्वेशन का उपयोग करप्रत्येक नकली वितरण के लिए संचयी वितरण फ़ंक्शन (CDF) interpolate। अंतर्विष्ट वितरण आवश्यक है ताकि वे मनमाने ढंग से बिंदुओं पर पूछताछ की जा सके।
  7. D-अक्षके साथ परिणामी B-spline वक्रों को Interpolate करें(D वह सही अनसंधान प्रसार गुणांक है जो नकली उत्सर्जकों की गति को नियंत्रित करता है) MATLAB में बिखरे हुएInterpolant फ़ंक्शन का उपयोग करके (Specify the ' प्राकृतिक' अंतर्वेशन विधि). यह एक सतत 2D फ़ंक्शन प्रदान करता है जिससे कोई भी प्रत्यक्ष विसरण गुणांक वितरण 0ण्05-20 उ2धकी श्रेणी में सत्य विसरण गुणांक मान के संगत है, जिसका प्रश्न किया जा सकता है।

8. प्रायोगिक आभासी प्रसार गुणांक वितरण फिटिंग

नोट: पिछले खंड में उत्पन्न नकली वितरण के रैखिक संयोजन का उपयोग कर स्पष्ट प्रसार गुणांक के फ़िट प्रयोगात्मक मापा वितरण(एक सीमित मात्रा में ब्राउनियन गति के मोंटे-कार्लो सिमुलेशन)। यह अनुभाग MATLAB में कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है और सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से उठाए जाने वाले चरणों का वर्णन करता है. अधिक जानकारी और आवेदन के उदाहरण के लिए, कृपया देखें Rocha एटअल. 29

  1. एक सीमित रैखिक कम से कम-वर्ग फिट (MATLAB में lsQlin फ़ंक्शन का उपयोग करके) प्रयोगात्मक CDF के एक समय-समय पर नमूना सरणी का उपयोग कर अनुभाग 7 में बनाई गई लायब्रेरी से नकली CDFs की एक पंक्ति प्रदर्शन करते हैं। इस चरण का निर्गत एक पैरामीटर सदिश है जिसमें प्रायोगिक वितरण में प्रचलित विधुर अवस्थाओं के प्रसार गुणांकों और जनसंख्या भिन्नों को शामिल किया गया है।
  2. सापेक्ष जनसंख्या भिन्न के आधार पर औसत भार द्वारा एक-दूसरे के 20% के भीतर विसरण गुणांक मानों के साथ विसरण अवस्थाओं को एक-दूसरे के 20% के भीतर संयोजित करें। यह प्रारंभिक पैरामीटर सदिश है.
    नोट: मॉडल जटिलता को कम करने के लिए, प्रसार गुणांक के साथ diffusive राज्यों 0.5 डिग्री2/s नीचे निम्न चरणों के सभी के दौरान स्थिर आयोजित किया जा सकता है।
  3. एक एकल विसरणीय स्थिति से लेकर राज्यों की एक यूज़र-डिफ़सिव अधिकतम संख्या तक, विभिन्न संख्याओं के साथ परीक्षण फिटिंग पैरामीटर सदिशों की सरणियां बनाएँ.
    1. प्रारंभिक पैरामीटर वेक्टर का उपयोग करके भारित अवतरण और विभाजित विधुर ित करने वाले राज्यों को दो राज्यों में बराबर जनसंख्या भिन्नों और विसरण गुणांकों के साथ मूल मान से 20% ऊपर और नीचे के साथ संयोजित करें। सभी राज्य संयोजन और बंटवारे संभावनाओं के लिए दोहराएँ.
  4. डेटा के 5 अलग-अलग सबसेट (MATLAB में fmincon फ़ंक्शन का उपयोग करके) की एक गैर रेखीय कम से कम वर्ग फिटिंग प्रारंभ करने के लिए प्रत्येक परीक्षण फिटिंग पैरामीटर वेक्टर का उपयोग करें। फिट और शेष सबसेट (डेटा क्रॉस सत्यापन) के लिए इसी वितरण के बीच वर्गों के अवशिष्ट योग ढूँढने के द्वारा फिट की गुणवत्ता का निर्धारण।
  5. फिट की समग्र गुणवत्ता के रूप में प्रत्येक परीक्षण वेक्टर के लिए 5 अलग फिटिंग के वर्गों के औसत अवशिष्ट राशि का उपयोग करें, diffusive राज्यों की प्रत्येक संख्या के लिए फिट की सबसे अच्छी गुणवत्ता के साथ परीक्षण वेक्टर निर्धारित करते हैं।
  6. परीक्षण वेक्टर जिसके लिए एक अतिरिक्त राज्य जोड़ने के लिए कम से कम एक 5% फिट की गुणवत्ता में सुधार में परिणाम नहीं है की पहचान करके राज्यों की इष्टतम संख्या निर्धारित करें।
  7. पूर्ण डेटा सेट की गैर-रेखीय न्यूनतम वर्गों फिटिंग प्रारंभ करने के लिए इस परीक्षण वेक्टर का उपयोग करें.
  8. एक ही परीक्षण वेक्टर के साथ बूटस्ट्रैपिंग और रिफिटिंग द्वारा डेटा को फिर से नमूना देकर अलग-अलग पैरामीटर के लिए त्रुटि का अनुमान लगाएं।

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत (20,000 फ्रेम, 4 स्थानीयकरण की गति लंबाई न्यूनतम) और फ्लोरोसेंट लेबल संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है, लगभग 200-3,000 स्थानीयकरण 10-150 उपज प्रति सेल उत्पन्न किया जा सकता है (चित्र 2a, ख)। स्पष्ट विसरण गुणांकों के एक अच्छी तरह से नमूना वितरण का उत्पादन करने के लिए बड़ी संख्या में ट्रैजेक्टरी आवश्यक है। यहाँ एकत्र FOV का आकार है $55 x 55 डिग्री, 10 FOV प्रति प्रयोग एकत्र के साथ. इसलिए, प्राप्त करने के लिए और 5,000 प्रयोग प्रति traectories प्रत्येक FOV कम से कम 50 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. आदर्श रूप में, सेल आबादी के रूप में संभव के रूप में घने बनाया जाना चाहिए, लेकिन कोशिकाओं को एक दूसरे को छूने के बिना. यदि सेल घनत्व बहुत अधिक है, तो स्पर्श या ओवरलैपिंग कोशिकाओं की उपस्थिति उन्हें OUFTI (28) का उपयोग करके सफलतापूर्वक विभाजित करना चुनौतीपूर्ण बनाती है, जैसा कि डेटा पोस्ट प्रोसेसिंगमें वर्णित है. खराब विभाजन के कारण कक्षों के बीच स्थानीकरण और ट्रैजेक्शनहोरीज को गलत तरीके से असाइन किया जा सकता है.

यहाँ, हम Y. enterocolitica प्रकार 3 स्राव प्रोटीन YscQ, जो हम N-terminally फ्लोरोसेंट प्रोटीन eYFP के साथ लेबल पर स्पष्ट प्रसार गुणांक डेटा प्रस्तुत करते हैं. YscQ एक झिल्ली spanning आणविक मशीन का एक संरचनात्मक घटक है, इंजेक्टिव कहा जाता है. इंजेक्टिसोम में 20 से अधिक विभिन्न प्रोटीन होते हैं, जिनमें से कई कई प्रतिलिपि संख्याओं में मौजूद होते हैं। प्रकार 3 स्राव इंजेक्टर मोटे तौर पर रोगजनक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा उपयोग किया जाता है ताकि संक्रमण के दौरान मेजबान सेल में सीधे उग्र प्रभावक प्रोटीन वितरित किया जा सके। YscQ गतिशील रूप से बांधता है और इंजेक्टी के साइटोसोलिक पक्ष से करने के लिए और unbinds. एक परिणाम के रूप में, YscQ भी स्वतंत्र रूप से cytosol में diffusing पाया जाता है. ऊपर वर्णित डेटा प्राप्ति, प्रक्रमण और विश्लेषण प्रोटोकॉल लागू करके हमने यह निर्धारित किया है कि अनबाउंड YscQ कम से कम 3 भिन्न भिन्न भिन्न अवस्थाओं में मौजूद है (चित्र 3). ये 3 विसरणीय अवस्थाएँ YscQ और अन्य प्रकार के 3 स्राव प्रोटीन23के विभिन्न समहोर और विषम-ओलिगोमेरिक परिसरों के अनुरूप हैं।

Figure 1
चित्र 1: सूक्ष्मदर्शी पथ का ऑप्टिकल आरेख। माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के लिए एक मार्ग और एक चरण विपरीत छवि लेने के लिए एक अलग मार्ग है. एक मोटर चालित 'फ्लिप-मिरर' का उपयोग रास्ते के बीच स्विच करने के लिए किया जाता है। कैमरा डिटेक्टरों, उत्तेजना लेज़रों, एलईडी, और 'फ्लिप-मिरर' कंप्यूटर द्वारा दूर से नियंत्रित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एकल अणु स्थानीयकरण और त्रासदियों. (A. 3D एकल-अणु स्थानीयकरण eYFP-YscQ में एक Y. enterococotica सेल में विभिन्न फ्रेम (1,766 स्थानीयकरण) में प्राप्त. स्थानीयकरण कक्ष के प्रावस्था विपरीत छवि पर मढ़ा जाता है. चरण कंट्रास्ट छवि के आधार पर हरी रेखा कक्ष बाह्यरेखा को इंगित करती है. (B) 3D एकल-अणु traectories eYFP-YscQ के पैनल ए (142 tractories) में दिखाए गए स्थानीयकरण से प्राप्त. अलग-अलग रंग अलग-अलग एकल-अणु त्रासदियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Y. enterocoliticaमें eYFP-YscQ की जाहिरा तदिख विसरण गुणांक वितरण फिटिंग | Y. enterocolitca में eYFP-YscQ के लिए स्पष्ट प्रसार गुणांक वितरण 3 diffusive राज्यों के साथ सबसे अच्छा फिट था. ध्यान दें कि प्रायिकता घनत्व फ़ंक्शन (PDF) यहाँ दिखाया गया है, जबकि डेटा फिटिंग संचयी वितरण फ़ंक्शन (CDF, प्रायोगिक जाहिरात प्रसार गुणांक वितरण फिटिंग)फिटिंग द्वारा किया गया था। रोचा एट अल23से अनुकूलित चित्र . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1. माइक्रोस्कोप नियंत्रण जीयूआई. माइक्रोस्कोप जीयूआई फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के लिए मंच, उत्तेजना लेज़रों, एलईडी, और कैमरों के micropositioner नियंत्रित करता है। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2. आसान-DHPSF जीयूआई. आसान-DHPSF सॉफ्टवेयर DHPSF संकेतों से एकल अणु स्थानीयकरण निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 3. Oufti विभाजन. खुला स्रोत सॉफ्टवेयर OUFTI28 कोशिकाओं sement करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ, सेल विभाजन के परिणाम हरे रंग में दिखाए जाते हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 4 . नियंत्रण बिंदुओं का चयन. कक्ष बाह्यरेखा डेटा और स्थानीयकरण डेटा दोनों में पाँच बिंदु चयनित होते हैं. कक्ष ध्रुवों का उपयोग संदर्भ बिंदुओं के रूप में किया जाता है। इन बिंदुओं का उपयोग डेटा को रूपांतरित करने के लिए किया जाता है ताकि कक्ष बाह्यरेखाएँ और स्थानीयकरण सही रूप से मढ़ा जा सके. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 5 . अवांछित कक्ष हटाएँ. कक्ष ओवरले के बाद, अवांछित कक्ष मैन्युअल रूप से हटा दिए जाते हैं. स्थानीयकरण की असामान्य रूप से कम/उच्च मात्रा वाले कक्षों को हटाया जाना चाहिए, साथ ही ऐसे किसी भी कक्ष को भी हटाया जाना चाहिए जो FOV के किनारे पर हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 6 . कक्ष रूपरेखा और स्थानीयकरण का अंतिम ओवरले. अवांछित कोशिकाओं को हटाने के बाद, सेल रूपरेखा और एकल अणु स्थानीयकरण पतले अंतिम ओवरले पाने के लिए बदल रहे हैं। कक्ष बाह्यरेखाओं के बाहर के स्थानीयकरण हटा दिए जाते हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक Mov. 1: एक एकल अणु प्रक्षेप पथ के लिए कच्चे डेटा. SCMOS कैमरे पर eYFP-YscQ का पता लगाने का उदाहरण. फ्रेम 1 में, कोई फ्लोरोसेंट संकेत नहीं है। फ्रेम में 2-10, एक अणु से फ्लोरोसेंट का पता चला है. प्रत्येक क्रमिक फ्रेम में, स्थिति और DHPSF परिवर्तन की अभिविन्यास, इस अणु के प्रसार का संकेत. अंत में, फ्रेम 11 में, वहाँ एक बार फिर से फ्लोरोसेंट संकेत में एक अनुपस्थिति है, प्रक्षेप पथ के अंत का संकेत. प्रत्येक पिक्सेल 108 x 108 एनएम है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक Mov. 2: एक चूक एकल अणु प्रक्षेप पथ के लिए कच्चे डेटा. फ्रेम्स 1-3 एक उत्सर्जक के लिए फ्लोरोसेंट संकेत दिखाते हैं। हालांकि, फ्रेम 4-6 दो ओवरलैपिंग DHPSFs की उपस्थिति दिखाने के लिए, करीब निकटता में दो emitters की उपस्थिति का संकेत. ऐसे मामलों में, अलग-अलग DHPSFs उनके ओवरलैप के कारण सही रूप से फिट नहीं हो सकता है। यहां तक कि अगर दोनों DHPSFs सफलतापूर्वक फिट हैं, इन स्थानीयकरण युक्त किसी भी प्रक्षेपपथ को खारिज कर दिया जाएगा. एक ही कक्ष में दो या अधिक स्थानीयकरण किसी दिए गए प्रक्षेप पथ के लिए स्थानीयकरण के गलत असाइनमेंट के लिए लीड हो सकता है। प्रत्येक पिक्सेल 108 x 108 एनएम है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के सफल अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कारक यह सुनिश्चित करना है कि एकल अणु संकेत एक दूसरे से अच्छी तरह से अलग हैं (यानी, वे अंतरिक्ष में और समय में विरल होने की जरूरत है (अनुपूरक Mov. 1)). यदि एक ही समय में एक सेल में एक से अधिक fluorescing अणु है, तो स्थानीयकरण गलत तरीके से एक और अणुओं के प्रक्षेप पथ को सौंपा जा सकता है. इसे जोड़ने की समस्या30कहा जाता है . इस तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर और उत्तेजना लेजर तीव्रता के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों, जोड़ने की समस्या से बचने के लिए चुना जा सकता है. हालांकि, ध्यान प्रतिनिधि परिणाम सुनिश्चित करने के लिए जंगली प्रकार प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए. यहाँ, हम रासायनिक प्रेरक अभिव्यक्ति के बजाय देशी प्रमोटरों के नियंत्रण में allelic प्रतिस्थापन का इस्तेमाल किया, लेबल प्रोटीन की मूल अभिव्यक्ति के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए. इस प्रकार, उत्तेजना लेजर तीव्रता (eYFP निमिष के लिए) या सक्रियण लेजर तीव्रता (फोटो सक्रिय फ्लोरोसेंट जांच के लिए) समय में सक्रिय emitters की एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, जब रासायनिक डाई लेबलिंग HALO और SNAP टैग31,32के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है , तो डाई एकाग्रता कम किया जा सकता है जब तक फ्लोरोसेंट संकेतों एकल अणुओं को ट्रैक करने के लिए पर्याप्त विरल हैं33. यहाँ प्रस्तुत किए गए प्रोटोकॉल से लिंकिंग समस्या को और अधिक समाप्त कर दिया गया है जिसके लिए दो या अधिक स्थानीयकरण एक ही कक्ष(पूरक मोव. 2)में एक साथ मौजूद हैं। इस प्रकार, यदि एकल अणु संकेत बहुत घने हैं, डेटा की एक बड़ी राशि स्वचालित रूप से प्रसंस्करण के दौरान छोड़ दिया है. यहाँ उपयोग की जाने वाली उत्तेजना की स्थिति के अंतर्गत , 350 ड़ध2पर 514 दउ का उपयोग किया जाता है) के अंतर्गत, हमने 8 मिनट के दौरान 20,000 फ्रेम प्राप्त करते समय प्रति जीवाणु कोशिका 10-150 ट्रैजेक्टरी प्राप्त की। दूसरी ओर, यदि प्रयोगात्मक स्थितियों को इस तरह चुना जाता है कि एकल अणु संकेत विरल होते हैं, तो डेटा अधिग्रहण थ्रूपुट कम हो सकता है, ताकि पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में एकल-अणु ट्रैजेक्टरी प्राप्त करने के लिए इमेजिंग की आवश्यकता होगी अतिरिक्त फ़ील्ड-की-दृश्य में अतिरिक्त कक्ष. बड़ी संख्या में त्रासदियों को प्राप्त करना फायदेमंद है, क्योंकि फिट पैरामीटरों (प्रसार गुणांकों और जनसंख्या भिन्नों) में त्रुटियां कम हो जाती हैं क्योंकि विश्लेषण किए जाने वाले त्रासदियों की संख्या29हो जाती है।

एकल अणु tractories की बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए उच्च डेटा-अधिग्रहण थ्रूपुट की आवश्यकता होती है। एक व्यापक क्षेत्र तकनीक के रूप में, एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी FOV में प्रत्येक सेल के लिए एक साथ डेटा प्राप्त करता है, और शोधकर्ताओं ने नए sCMOS डिटेक्टरों का लाभ लेने के लिए शुरू कर दिया है कि बड़े FOVs26,34 खर्च 35. तथापि, इतने बड़े एफओवी में एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त समान तीव्रता प्राप्त करने के लिए अनेक वाट्स की उत्तेदार लेजर शक्तियों की आवश्यकता होती है। ऐसी लेजर शक्तियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उद्देश्य लेंस की क्षति सीमा से ऊपर हो सकती हैं। बड़े एफओवी में उत्कृष् टता लेजर तीव्रता को एक समान बनाने के लिए कार्यरत लेंसलेट सरणियों को इस अंक को दरकिनार करने में सक्षम हो सकता है34. इसके अतिरिक्त, ऑप्टिकल विपथन स्पष्ट हो जब इमेजिंग दूर ऑप्टिकल अक्ष से दूर. नतीजतन, DHPSF का आकार भी आसान DHPSF में कार्यरत एक डबल गॉसियन मॉडल द्वारा सफलतापूर्वक फिट होने के लिए विकृत हो सकता है. जब एक अल्ट्रावाइड एफओवी में इमेजिंग, और अधिक परिष्कृत स्थानिक रूप से बदलती पीएसएफ मॉडल की आवश्यकताहोती है 36. इन जटिल कारकों से बचने के लिए, यहाँ प्रस्तुत डेटा एक अपेक्षाकृत छोटे FOV में प्राप्त किए गए थे (व्यास $ 5 5 डिग्री मी) और 10 FOVs से डेटा 75,000 से अधिक एकल अणु tracectories प्राप्त करने के लिए जमा किए गए थे.

नकली वितरण के साथ प्रयोगात्मक मापा स्पष्ट प्रसार गुणांक वितरण की फिटिंग प्रयोगात्मक डेटा के यथार्थवादी सिमुलेशन की आवश्यकता है। कैमरा-आधारित ट्रैकिंग में स्थिर और गतिशील स्थानीयकरण त्रुटियाँ माप11,13की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती हैं. स्थैतिक स्थानीयकरण त्रुटियाँ फ्लोरोसेंट उत्सर्जक प्रति एकत्र फोटॉनों की सीमित संख्या के कारण होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप पीएसएफ आकार में वृद्धि होती है और इस प्रकार सीमित परिशुद्धता2,37के एकल अणु स्थानीयकरण में परिणाम होता है, 38. गतिशील स्थानीयकरण त्रुटियाँ चलती emitters कि धुंधला PSFs39उत्पन्न करने के कारण उत्पन्न होती है . PSF के आकार को फिट करने के लिए एक एल्गोरिथ्म लागू किया जाता है, जब गति-धब्बे छवियों सीमित सटीकता और परिशुद्धता39के साथ स्थानीयकरण प्रदान करते हैं। तेजी से अणु आंदोलन के गंभीर मामलों में, छवि भी फिट करने के लिए विकृत हो सकता है, एक असफल फिट में जिसके परिणामस्वरूप और इस तरह कोई दर्ज स्थानीयकरण. दोनों स्थिर और गतिशील स्थानीयकरण त्रुटि के लिए प्रयोगात्मक डेटा खातों के रूप में एक ही फिटिंग एल्गोरिथ्म के साथ यथार्थवादी संकेत करने के लिए शोर अनुपात और स्थानीयकरण के साथ स्थानिक रूप से धुंधला PSFs का अनुकरण। दूसरा, तेजी से diffusing अणुओं दृढ़ता से छोटे संस्करणों तक ही सीमित किया जा सकता है, इस तरह के एक जीवाणु कोशिका के cytosol के रूप में. परिणामस्वरूप, स्पष्ट विसरण गुणांक, औसत न होने वाली गति की अपेक्षा छोटे होते हैं। स्थानिक कारावास छोटे diffusive मूल्यों की ओर वितरण के एक समग्र बाएँ पारी में परिणाम. महत्वपूर्ण बात यह है कि वितरण का आकार अब एक विश्लेषणात्मक समारोह के रूप में व्यक्त नहीं है। गति धुंधला और stochastic सिमुलेशन के माध्यम से कारावास प्रभाव के कारण स्थिर और गतिशील स्थानीयकरण त्रुटियों के लिए स्पष्ट रूप से लेखांकन द्वारा, यथार्थवादी वितरण23प्राप्त किया जा सकता है।

वर्णित विसरण विश्लेषण जैविक वातावरण में अणुओं के गतिशील व्यवहार के संबंध में दो प्रमुख मान्यताओं पर निर्भर करता है। यह मान लिया गया है कि विचालक अवस्थाओं का वर्णन सीमित ब्राउनियन गति द्वारा किया गया है और वे एकल अणु पथ के समय-स्तर पर परस्पर परिवर्तन नहीं करते हैं। हमने प्रायोगिक रूप से यह सत्यापित किया है कि सीमित ब्राउनियन गति की धारणा वाई मेंईवाईएफपी प्रसार के लिए उचित है. इन परिणामों को विभिन्न जीवाणु प्रजातियों है कि स्थापित किया है कि cytosolic प्रोटीन, संलयन प्रोटीन की गति, और 30 एनएम से छोटे biomocular परिसरों ब्राउनियन गति18द्वारा वर्णित किया जा सकता है में अध्ययन की एक संख्या के साथ समझौते में हैं, 40,41,42,43,44,45. अन्य सेलुलर घटकों के साथ छोटे फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के गैर विशिष्ट collisions प्रसार दर को धीमा कर सकते हैं,45,46 लेकिन ब्राउनियन प्रसार से विचलन के लिए नेतृत्व नहीं करते. इसके विपरीत, cognate बाध्यकारी भागीदारों के साथ विशिष्ट बातचीत प्रसार गुणांक में एक परिवर्तन का उत्पादन कर सकते हैं, के रूप में हाल ही में Y enterocolitica प्रकार के लिए दिखाया गया 3 स्राव प्रोटीन YscQ23. दूसरी धारणा की वैधता का आकलन करना मुश्किल है, विशेष रूप से उन प्रणालियों के लिए जिनके लिए न तो विसारक राज्य और न ही बाध्यकारी गतिज विज्ञान ज्ञात हैं। स्थिति और जटिल है क्योंकि किसी भी oligomerization राज्यों और बाध्यकारी गतिज इन विट्रो में मापा, संरचनाओं और गतिशीलता है कि विवो में होने को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है. यहाँ प्रस्तुत विश्लेषण ढांचे पर आधारित हाल ही में किए गए एक सैद्धांतिक अध्ययन से पता चलता है कि प्रसार गुणांकों और जनसंख्या के भिन्न29के अतिरिक्त राज्य स्विचन गतिजता को निकालना संभव हो सकता है .

संक्षेप में, हम जीवित जीवाणु कोशिकाओं में मापा एकल अणु tracectories के आधार पर फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं की diffusive राज्यों को हल करने के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यहाँ प्रस्तुत के रूप में, प्रोटोकॉल 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किया जाता है Y. enterocolitica,एक जीवाणु रोगज़नक़ में इमेजिंग के लिए डबल-हेलिक्स पीएसएफ का उपयोग कर. हालांकि, केवल कुछ संशोधनों के साथ, प्रोटोकॉल 2 डी या 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और नमूना ज्यामिति के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Alecia Achimovich और टिंग यान धन्यवाद. हम एड हॉल, वर्जीनिया विश्वविद्यालय में उन्नत अनुसंधान कम्प्यूटिंग सेवा समूह में वरिष्ठ स्टाफ वैज्ञानिक धन्यवाद, इस काम में इस्तेमाल अनुकूलन दिनचर्या की स्थापना के साथ मदद के लिए. इस काम के लिए धन वर्जीनिया विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

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