Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi utnyttjas för att söka de rumsliga positioner och rörelsebanor av överföras märkta proteiner i levande bakterieceller. Den experimentella och dataanalys protokoll som beskrivs häri avgör de utbredda diffusiva beteenden av cytosoliska proteiner baserade på poolade enda molekyl Trajectories.

Abstract

Single-molekylen lokalisering mikroskopi sonder ställning och rörelser enskilda molekyler i levande celler med tiotals nanometer rumsliga och millisekund temporal upplösning. Dessa funktioner gör Single-molekylen lokalisering mikroskopi idealisk för att studera molekylär nivå biologiska funktioner i fysiologiskt relevanta miljöer. Här visar vi ett integrerat protokoll för både förvärv och bearbetning/analys av Single-molekyl spårningsdata för att extrahera de olika diffusiva staterna ett protein av intresse kan uppvisa. Denna information kan användas för att kvantifiera molekylär komplex formation i levande celler. Vi ger en detaljerad beskrivning av en Kamerabaserad 3D Single-molekyl lokalisering experiment, samt de efterföljande databehandling steg som ger banor av enskilda molekyler. Dessa banor analyseras sedan med hjälp av en numerisk analysram för att extrahera de utbredda diffusiva staterna av fluorescerande märkta molekyler och den relativa överflöd av dessa stater. Analysramen är baserad på stokastiska simuleringar av intracellulära Brownian diffusion banor som är rumsligt begränsas av en godtycklig cell geometri. Baserat på de simulerade banor, RAW Single-molekylen bilder genereras och analyseras på samma sätt som experimentella bilder. På så sätt införlivas experimentella precisions-och noggrannhets begränsningar, som är svåra att kalibrera experimentellt, uttryckligen i analys arbetsflödet. Diffusion koefficienten och relativa befolknings fraktioner av de förhärskande diffusiva staterna bestäms genom att montera distributioner av experimentella värden med hjälp av linjära kombinationer av simulerade distributioner. Vi visar nyttan av vårt protokoll genom att lösa de diffusiva staterna av ett protein som uppvisar olika diffusiva stater på att bilda homo-och hetero-oligomerska komplex i cytosolen av en bakteriell patogen.

Introduction

Att undersöka de diffusiva beteendet hos biomolekyler ger insikt i deras biologiska funktioner. Fluorescensmikroskopi-baserade tekniker har blivit värdefulla verktyg för observation av biomolekyler i sin naturliga cell miljö. Fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) och fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)1 ger Ensemble-genomsnitt diffusiva beteenden. Omvänt, Single-molekylen lokalisering mikroskopi möjliggör observation av enskilda Fluorescent märkta molekyler med hög rumslig och temporala upplösning2,3,4. Observation enskilda molekyler är fördelaktigt eftersom ett protein av intresse kan existera i olika diffusiva stater. Till exempel, två lätt urskiljbara diffusiva stater uppstår när en transkriptionell regulator, såsom CueR i Escherichia coli, difsar fritt i Cytosol eller binder till en DNA-sekvens och blir immobiliserade på tidsskalan för mätning5 . Single-molekyl tracking ger ett verktyg för att observera dessa olika stater direkt, och sofistikerade analyser krävs inte för att lösa dem. Emellertid, det blir mer utmanande att lösa flera diffusiva stater och deras befolknings fraktioner i fall där deras diffusa priser är mer likartade. Till exempel på grund av storleksanpassa beroendet av diffusions koefficienten, påstår olik oligomerisering av ett protein manifesterar sig som olik diffusiv påstår6,7,8,9 , 10. sådana fall kräver ett integrerat förhållningssätt när det gäller datainsamling, behandling och analys.

En kritisk faktor som påverkar diffusiva frekvenser av cytosoliska molekyler är effekten av instängdhet av cellgränsen. De restriktioner som ställs på molekylär rörelse av en bakteriecell gräns orsaka en cytosoliska molekyler uppmätta diffusionshastighet att visas långsammare än om samma rörelse hade inträffat i ett oinskränkt utrymme. För mycket långsamt diffusa molekyler, effekten av cellulära instängdhet är försumbar på grund av bristen på kollisioner med gränsen. I sådana fall kan det vara möjligt att korrekt lösa diffusions tillstånd genom att montera fördelningarna av molekylära förskjutningar, reller skenbara diffusions koefficienter, D *, med hjälp av analytiska modeller baserade på ekvationerna för Brownsk rörelse ( slumpmässig diffusion)11,12,13. Men för snabba diffusa cytosoliska molekyler, de experimentella distributioner inte längre likna de som erhållits för oinskränkt Brownsk rörelse på grund av kollisioner av diffuserande molekyler med cell gränser. Nedsättningseffekter måste redovisas för att exakt bestämma de oinskränkta diffusions koefficienterna för de fluorescerande molekyler som är märkta. Flera metoder har nyligen utvecklats för att ta hänsyn till instängning antingen (semi-) analytiskt 5,14,15,16 eller numeriskt genom Monte Carlo-simuleringar av Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.

Här ger vi ett integrerat protokoll för att samla in och analysera Single-molekylen lokalisering mikroskopi data med ett särskilt fokus på Single-molekyl spårning. Slutmålet med protokollet är att lösa diffusa tillstånd av fluorescerande märkta cytosoliska proteiner inuti, i detta fall, stavformade bakterieceller. Vårt arbete bygger på ett tidigare protokoll för Single-molekyl spårning, där en DNA-polymeras, PolI, visades att existera i en DNA-bunden och obunden stat genom diffusion analys20. Här expanderar vi Single-molekyl spårningsanalys till 3D mätningar och utföra mer realistiska beräknings simuleringar för att lösa och kvantifiera flera diffusiva stater samtidigt närvarande i celler. Datan är förvärvat användande en hem-bygget 3D toppen-beslutsamhet fluorescens Mikroskop vilken är skicklig av beslutande den 3D position av fluorescerande sändare vid tänkbar med det dubbel-Helix punkt-breda-funktion (dhpsf)21,22. RAW Single-molekylen bilder bearbetas med hjälp av skräddarsydda program för att extrahera 3D Single-molekyl lokaliseringar, som sedan kombineras till enmolekyl banor. Tusentals banor slås samman för att generera fördelningar av skenbara diffusions koefficienter. I ett sista steg är de experimentella distributionerna lämpade med numeriskt genererade fördelningar erhållna genom Monte-Carlo-simuleringar av Brownian-rörelse i en begränsad volym. Vi tillämpar detta protokoll för att lösa diffusiva stater av typ 3 sekretion system protein YscQ i levande yersinia enterocolitica. På grund av sin modulära natur, är vårt protokoll i allmänhet gäller för alla typer av Single-molekyl eller Single-partikel tracking experiment i godtyckliga cell geometrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dubbel-Helix punkt-spread-funktion Kalibrering

Obs: bilder som beskrivs i detta och följande avsnitt förvärvas med hjälp av ett specialbyggt inverterat fluorescens-Mikroskop, som beskrivs i Rocha et al.23. Samma förfarande gäller för olika Mikroskop implementeringar avsedda för enkel molekyl lokalisering och spårning mikroskopi2,3,4. All programvara för bild anskaffning och databearbetning som beskrivs i den här artikeln är tillgänglig (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. Beredning av agaros kuddar för montering av prover på glas täckplattor som skall ses under mikroskopet.
    1. Tillsätt 1,5-2 viktprocent låg smältpunkt aguppstod till 5 mL M2G buffert (4,9 mM na2HPO4, 3,1 mm KH2Po4, 7,5 mm NH4cl, 0,5 mm mgso4, 10 μm FeSO4, 0,5 mm CaCl2 och 0,2% glukos). Mikrovågsugn i flera sekunder tills alla aguppstod är upplöst. Låt inte lösningen koka.
    2. Låt aguppstod lösningen svalna i några minuter (2-3 min).
    3. Pipettera över 600 μL aguppstod-lösning på en glas täckslip (22 mm x 22 mm). Placera försiktigt en andra glas täckslip ovanpå aguppstod. Detta skapar en tunn (~ 0,5 mm) aguppstod gel pad mellan de två glaslocket glider.
    4. Låt aguppstod kuddar sitta för att stelna för ~ 20 min.
    5. Försiktigt isär glaslocket glider. Den aguppstod pad kommer att hålla sig till en av dem.
    6. Med hjälp av ett rakblad, klippa aguppstod pad i fyra kvadratiska delar av samma storlek. Varje kvadrat sektion kan användas för ett enda prov.
  2. Pipettera över 1,5 μL fluorescerande pärllösning på en agaros-dyna. Pärllösning är en 1/100000 utspädning av stamlösningen i M2G (se tabell över material).
  3. Invertera agaros pad och placera på en glas täckslip som har rengjorts i en ozon rengöring i 30 min. Rengöringstiden väljs för att eliminera alla fluorescerande molekyler anhängare till täckglas.
  4. Montera prov täckets glas på provhållaren på ett inverterat fluorescensmikroskop och fäst det på plats med hjälp av tejp eller fjäderbelastade provhållarens clips.
  5. Tillsätt en droppe nedsänkning olja på mikroskopet mål.
  6. Placera provhållaren på ett mikroskop och fäst den på plats.
  7. Initiera det grafiska användargränssnittet (GUI) för att styra mikroskopets kamera, provsteg och magnetisering lasrar. Här används specialskriven programvara i MATLAB för instrument kontroll (kompletterande figur 1).
  8. Initiera kamerans programvara HCImage Live. Ange exponeringstiden till 0,03 s på fliken Hämta under avsnittet kamera kontroll . Klicka på Live för att påbörja en livematning av kameran.
  9. Slå på lasern genom att klicka på öppna 514 nm Laser på GUI-gränssnittet för att excitera fluorescerande pärlor på plattan och Visa fluorescensutsläppet på kameran med live-stream-läge (dvs. inga data sparas till disk).
  10. Justera X-och Y-positionerna för mikroskopet genom att klicka på "XY-POS"-pilarna under avsnittet "Mikropositioneringssteg" i GUI för att placera minst en fluorescerande pärla i mitten av synfält (FOV). Stegstorleken kan ändras genom att klicka på listrutan nedanför pilarna.
  11. Justera Z-positionen för mikroskopet genom att klicka på z-POS -pilarna under avsnittet nano-positionering scenen i GUI. Ställ in orienteringen för dubbel-Helix punkt-spread-funktion (DHPSF) av fluorescerande pärla vara vertikal. Denna vertikala orientering definieras som startpunkten i Z-kalibreringen. Stegstorleken kan ändras genom att klicka på listrutan nedanför pilarna.
  12. I HCImage Live, under Capture | Utlösarlägen, hastighet och registrering, ändra utlösarläget från intern till extern nivå utlösare. Detta gör att MATLAB GUI kan styra kameran.
  13. Under sekvens | Skanningsinställningar, ändra antalet bild Rute antal till 1200. Välj en Spara målmapp genom att klicka på knappen märkt .... Slutligen klicka på Start. Antalet bild Rute antal är inställt på 1200 så att 10 bildrutor kan samlas in för var och en av 120 Z-positions stegen.
  14. Scanna genom en rad Z positioner (30 steg över och under start Z position i 50 nm steg) och spela in 10 bilder vid varje steg med en exponeringstid på 0,03 s. påbörja den automatiserade processen genom att klicka på gå under Z-kalibrerings sektionen det grafiska användargränssnittet.
    Observera: parametrarna för kalibreringen, inklusive steglängd, antal steg, kamerans exponeringstid och antal bildrutor per steg kan också justeras här. Om 105 fotoner kan förvärvas från en fluorescerande pärla i en enda ram med 0,03 s exponeringstider resulterar i x, y, z lokalisering preciseringar av ca 1 Nm.
  15. Stäng av laser belysningen genom att klicka på stäng 515 nm Laser i GUI. I HCImage Live, under Capture | Utlösarlägen, hastighet och registrering, ändra utlösarläget tillbaka till internt. Under sekvens | Skanningsinställningar ändra antalet bild Rute antal till 200. Välj en Spara målmapp genom att klicka på knappen märkt .... Klicka på Start för att samla 200 bildrutor med mörka bilder med en 0,03 s exponeringstid.
    Anmärkning: även i avsaknad av ljus som faller på detektorn, kommer varje pixel läsa upp ett positivt tal (kallas den mörka offset värde), som kan variera något mellan pixlar. Det mörka förskjutnings värdet kan ändras med tiden. Därför är det nödvändigt att samla in mörka ramar för varje kalibrering.
  16. Montera DHPSF med en dubbel-Gaussian modell med Easy-DHPSF programvara24 för att få X och Y positioner av pärlan, samt en vinkel kontra Z kalibreringskurva.
    1. Initiera Easy-DHPSF programvara i MATLAB. Under Inställningarställer du in kanal till G och ställer in passande metod på MLE med DG Model. G hänvisar till den gröna kanalen kameran, som fluorescerande protein som används för datainsamling avger med gröna våglängder. MLE med DG-modellen hänvisar till maximal sannolikhet uppskattning med dubbel-Gaussian modell.
      Pixelstorleken och konverterings förstärkningen beror på den specifika optiska inställningen och kan behöva ändras.
    2. Klicka på Körunder avsnittet kalibrera dhpsf . Klicka på OK i följande popup-fönster för att behålla standardinställningarna.
    3. Välj den bildstapel som sparats i steg 1.13-1.14. Välj sedan bildstapeln med den mörka bakgrunden Sparad i steg 1,15. Välj slutligen. txt-filen som sparades automatiskt under steg 1,14. Den här filen innehåller Z-positionen för scenen under hela skanningsprocessen.
    4. I nästa popup-fönster, om hela kameran chip inte användes för synfältet, mata in start x0 och y0 positioner på chip. Annars indata x0 = 1 och y0 = 1. denna information finns i HCImage Live under den Binning och SubArrary avsnitt.
    5. I följande fönster, ändra storlek och flytta rutan som visas över bilden av fluorescerande pärlor så att det är cirka 100 x 100 pixlar i storlek och centrerad över en enda fluorescerande DHPSF signal. Dubbelklicka sedan på för att fortsätta.
      Obs: den valda DHPSF bör isoleras från andra DHPSF signaler och helst vara den ljusaste pärla möjligt.
    6. Klicka i mitten av DHPSF signalen, mellan de två loberna, tryck sedan Enter. Följande fönster visar en zoomad vy av den valda DHPSF. Mer exakt välja placeringen av mitten av DHPSF genom att klicka.
      Obs: programmet kommer då att passa DHPSF, och visa RAW-bild och återuppbyggnad från passformen. Det kommer också ut mallbilder från Z kalibrering som motsvarar en DHPSF tvärsnitt på olika Z positioner. Dessa kommer att användas senare för montering av experimentella data. Programmet kommer att mata ut X, Y, och Z position uppskattas i varje ram. I ett väl anpassat optiskt system, X och Y bör ändra mycket lite (~ 30 Nm avvikelse) som Z positionen ändras. Om den utgående variationen är större än 30 Nm, skall fas masken, som är placerad på Fourierplanet i bildsystemet (figur 1), justeras om och steg 1.9-1,16 upprepas.
    7. Spara Easy-DHPSF GUI genom att klicka på Spara -ikonen i det övre vänstra hörnet av GUI. Detta kan senare läsas in genom att klicka på laddnings ikonen i GUI.
      Anmärkning: Z Kalibreringsproceduren bör utföras på varje dag av ett experiment för att redogöra för justering förändringar i mikroskopet som kan ha inträffat på grund av temperaturvariationer eller mekaniska vibrationer.

2. beredning av bakteriekulturer

  1. Förbered kulturmedia som stödjer bakterie cells tillväxt. För Y. enterocolitica, Använd 5 ml BHI (hjärnan hjärta infusion) buljong som innehåller nalidixinsyra Acid (35 μg/ml) och 2, 6-diaminopimelic syra (80 μg/ml). Här, en Y. enterocolitica stam används som har proteinet YscQ märkta med fluorescerande protein eyfp23.
  2. Inokulera media med bakteriekulturer från fryslager eller plattkulturer.
  3. Odla kulturen vid 28 ° c med skakning över natten.
  4. Späd en liten mängd (~ 250 μL) av mättade över natten kultur till 5 mL med hjälp av färska odlingsmedier.
  5. Odla kulturen vid 28 ° c med skakning för 60-90 min.
  6. Inducera uttryck av fluorescerande fusionsprotein. För Y. enterocolitica, värme chock cellerna till 37 ° c i en vatten Shaker för att inducera yop regulon.
  7. Inkubera cellerna i ytterligare 3 h vid 37 ° c med skakning.
  8. Centrifugera 1 mL kultur vid 5 000 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
  9. Tvätta pelleten 3 gånger med 1 mL M2G-media.
  10. Re-suspendera inblandning pelleterat bakterier i ~ 250 μl av M2G media.
  11. Tillsätt fluorescerande pärlor som relaterat markörer. Fluorescerande pärla lösning bör tillsättas i lämpligt utspädda mängder, så att det finns endast 1-2 pärlor per FOV när de ses i mikroskopet.
  12. Pipettera försiktigt eller skaka suspensionen för att separera aggregerade celler.
  13. Platta 1,5 μL suspension på en 1,5-2% Agros pad gjord med M2G.
  14. Vänd på Agam-plattan och placera den på ett ozon rensat Mikroskop täckslip. Täckslip bör placeras i en ozon renare i 30 min för att minska alla inneboende fluorescens bakgrund.

3. data insamling

  1. Montera prov täckets glas på provhållaren på ett inverterat fluorescensmikroskop och fäst det på plats med hjälp av tejp eller fjäderbelastade provhållarens clips.
  2. Tillsätt en droppe nedsänknings olja på mikroskopets mål och placera sedan provhållaren på mikroskopet och fäst den på plats.
  3. Initiera grafiskt användargränssnitt (GUI) för att styra mikroskopets kamera, prov skede, och excitation lasrar. Här används specialskriven programvara i MATLAB för instrumentstyrning.
  4. Initiera kamerans programvara HCImage Live. Ange exponeringstiden till 0,025 s på fliken Hämta under avsnittet kamera kontroll . Klicka på Live för att påbörja en livematning av kameran.
  5. Justera X-och Y-positionerna för Mikroskop stadiet genom att klicka på XY-POS- pilarna under mikro-positionering scenen delen av GUI för att skanna runt provet och hitta en FOV med en lämplig tät population av bakterieceller.
    För att maximera dataflödet bör cellerna vara så täta som möjligt, utan överlappande eller berörande celler. FOV bör också innehålla minst 1 fluorescerande pärla som skall användas som en relaterat markör, företrädesvis placerad i ett hörn av FOV.
  6. Justera z-positionen för mikroskopet skede genom att klicka på z-POS pilarna under nano-positionering skede delen av GUI, så att den fluorescerande pärla ' s dhpsf lober är vertikala.
  7. Under sekvens | Skanningsinställningar, ändra antalet bild Rute antal till 20 000. Välj en Spara målmapp genom att klicka på knappen märkt .... Slutligen klicka på Start att samla upp till 20 000 kamera ramar med en kort exponeringstid på 0,025 s. eyfp photoblinkande initieras med hög intensitet excitation ljus vid 514 nm19,25.
    Obs: här, en laserintensitet på ~ 350 W/cm2 vid fokalplanet används för inledande blekning och efterföljande avbildning av Single eyfp molekyler. Foto aktivering av eYFP-molekyler vid UV-våglängder vid bildtagning användes inte. Det bör finnas högst en enda molekyl signal per bakteriecell. Om tätheten av Single-molekylen signalen är för hög initialt, fortsätter att lysa tills tillräcklig photoblekning sker innan du påbörjar datainsamling.
  8. Stäng av laser belysningen genom att klicka på stäng 515 nm Laser i GUI. Samla 200 bildrutor med mörka bilder med samma exponeringstid.
  9. I GUI, markera rutan bredvid Thorlabs LED och klicka på Växla spegel upp. Detta kommer att byta väg från fluorescensvägen till faskontrast vägen.
  10. Initiera datainsamlingsprogrammet IC Capture 2,4. Detta styr kameran i faskontrast vägen. Tryck på Start/Stop Live-visningsknappen för att visa ett Live-flöde från kameran. Klicka på Capture | Spara bilden för att samla in en faskontrast bild av cellerna i synfält.
  11. Upprepa steg 3.5-3.10 för ytterligare FOVs. Här, data som förvärvats från ~ 500 bakterieceller i tio olika FoVs används för att öka antalet enmolekylen banor tillgängliga för analys.
    Varning: celler som är monterade på agaldynor under långa perioder kan bete sig annorlunda än nymonterade celler. Dessutom kan Agam pad förlora sin integritet efter en tid, vilket kan påverka datakvaliteten negativt. Typiskt, högst 3 FOV (~ 30 min på mikroskopet) används per prov bild.

4. data behandling

Anmärkning: en modifierad version av Easy-DHPSF programvara24 används i MATLAB för analys av RAW kamera ramar för att extrahera enmolekyl lokaliseringar. Easy-DHPSF används specifikt för att passa DHPSF lokaliseringar i en-molekyl avbildning. Anpassade ändringar har gjorts för att implementera maximal sannolikhet uppskattning (MLE)-baserade passande rutin som står för pixel beroende brus egenskaper moderna sCMOS-kameror26. Det ändrades också för att acceptera bildfilstypen utdata från HCImage Live-programmet (. dcimg). För en mer detaljerad förklaring av programvaran och de enskilda stegen, se Lew et al.24

  1. Initiera Easy-DHPSF GUI i MATLAB (kompletterande figur 2). Ladda i filen som sparats i steg 1.16.8.
  2. Bestämma tröskelvärden för var och en av de 7 mallarna utdata i steg 1.16.7
    1. Klicka på Körunder avsnittet kalibrera SM-identifiering . Klicka på OK i följande två popup-fönster för att behålla standardinställningarna.
    2. Öppna bildstapeln som innehåller data från den första FOV när du tillfrågas.
    3. Välj ett litet antal bildrutor för att matcha mallar. Vanligtvis ramar 1001-2000 används för att undvika täta överlappande signaler i de första flera hundra ramar. Klicka på OK i följande popup-fönster för att behålla standardinställningarna. Klicka på Avbryt när du ombeds ange sekvensloggfilen i följande fönster.
    4. Öppna bildstapeln med den mörka bakgrunden Sparad i steg 3,8. Klicka på "OK" i följande popup-fönster för att lämna parametrarna för bakgrunds uppskattningen inställd på standard. Standardvärdet är att uppskatta bakgrunden med hjälp av ett median filter27 som täcker 100 efterföljande kamera ramar runt den aktuella bildrutan.
    5. I nästa fönster, ändra storlek på rutan överlagt på bilden för att täcka hela FOV, dubbelklicka sedan för att fortsätta.
    6. Definiera regionen av intresse genom att klicka på flera punkter på bilden för att skapa en polygon. Den region av intresse bör omfatta så mycket av synfältet som möjligt, samtidigt som alla fluorescerande pärlor (mycket ljusa objekt) i bilden inte låg inom polygonen, dubbelklicka sedan för att fortsätta.
      Obs: programmet kommer sedan att försöka matcha mallarna till bilden, och kommer att visa en bild med möjliga matchningar inringad.
    7. När mjukvaran har stoppat, den vilja rädda många profilen av grunda mallen tändstickorna och uppvisning den motsvarande gränsvärde i en pre-definierat broschyren. Ett högre tröskelvärde motsvarar en bättre matchning. För varje mallnummer, Undersök exempel matchningarna och Bestäm det lägsta tröskelvärdet som uppvisar en bild av en DHPSF. Ange dessa tröskelvärden för var och en av de 7 mallarna under den kalibrera SM-identifiering avsnittet i Easy-DHPSF GUI.
      Anmärkning: programmet kommer att försöka att automatiskt välja och indata trösklar, men dessa är ofta opålitliga och bör kontrolleras manuellt. Tröskelvärden väljs så att få sanna Single-molekyl signaler missas, men antalet falska positiva kandidater för montering förblir beräkningsmässigt hanterbart.
    8. Spara Easy-DHPSF GUI igen genom att klicka på Spara -ikonen i det övre vänstra hörnet.
  3. Montering av fluorescerande pärla i FOV att använda som en relaterat markör
    1. Under spåret förvaltare delen av Easy-dhpsf GUI, klicka på Run. Klicka på OK i följande två popup-fönster för att behålla standardinställningarna.
    2. Dra rutan överlagt på bilden och centrera den över DHPSF signalen från den fluorescerande pärla, dubbelklicka sedan på.
    3. Klicka i mitten av DHPSF signalen, vid mittpunkten mellan de två loberna, tryck sedan Enter. Klicka på Avbryt när du ombeds ange sekvensloggfilen i följande fönster.
      Obs: programvaran kommer att passa DHPSF i alla kamera ramar, och visa RAW-bild och den rekonstruerade bilden. När programvaran har slutförts, kommer det att produktionen siffror med X, Y, och Z positioner av fluorescerande pärla över varaktigheten av bilden förvärvet.
    4. Markera rutan bredvid Använd förvaltare och spara Easy-dhpsf GUI igen genom att klicka på Spara-ikonen i det övre vänstra hörnet.
  4. Hitta och anpassa alla lokaliseringar i alla kamera bildrutor med hjälp av de malltrösklar som erhållits i steg 4,2.
    1. Under Localize Dhpsf SMS avsnitt av Easy-DHPSF GUI, klicka Run. Klicka på OK i följande popup-fönster för att behålla standardinställningarna. Klicka på Avbryt när du ombeds ange sekvensloggfilen i följande fönster.
      Obs: programvaran kommer att hitta och passa DHPSF med hjälp av en dubbel-Gaussian modell om kvaliteten på matchen är över den användardefinierade tröskeln. Det kommer att visa RAW-bild med cirklar runt mallmatcher samt en bild av den rekonstruerade DHPSF passar.
    2. Spara Easy-DHPSF GUI igen genom att klicka på Spara -ikonen i det övre vänstra hörnet.
  5. Visa enmolekyllokaliseringar och filtrera ut oönskade eller opålitliga lokaliseringar
    1. Klicka på filterutdataunder avsnittet utdata dhpsf SM-lokaliseringar .
    2. Klicka på OK i följande tre fönster för att utföra en interpolation av den relaterat X, Y, och Z positioner över tiden. I de flesta fall är standardalternativen tillräckliga. Om den svarta interpolerade linjen inte återspeglar en rimlig interpolering av den röda positions linjen, ändrar du interpolationsparametrarna i popup-fönstret.
      Anmärkning: den interpolerade linjen används för steg-drift korrigera enmolekylen lokaliseringar.
    3. Öppna motsvarande faskontrast bild för FOV som analyseras när du tillfrågas. Klicka på OK i följande två popup-fönster för att behålla standardinställningarna.
    4. I följande två popup-fönster, ändra filtervärdena för att tillåta mer strikt eller mildaste enkel molekyl lokalisering krav och klicka sedan på OK.
    5. I fönstret som visas, dra eller ändra storlek på rutan överlagt på bilderna för att visa önskad region av intresse och dubbelklicka för att fortsätta.
    6. En 3D-rekonstruktion av enmolekylen lokaliseringar visas. Använd figuren verktyg för att manipulera återuppbyggnaden (rotera, zooma, etc). Klicka på Fortsätt för att visa en annan dialogruta som frågar "vill du Replot med en annan parameteruppsättning?". Om resultaten är tillfredsställande klickar du på Nej. Om de inte är det klickar du på Ja.
      ANMÄRKNINGAR: vanliga orsaker till otillfredsställande resultat är att fas kontrasten inte är korrekt överlagd med lokaliseringsdata eller att de initiala tröskelvärdena var för låga för att skapa många falska positiva lokaliseringar. Om Ja valdes återgår programvaran till steg 4.5.4 så att nya parametervärden kan definieras. Om Nej valdes sparas resultatet.

5. uppgifter efter behandling

  1. Med hjälp av specialskriven programvara i MATLAB beskär du faskontrast bilden så att endast den region som innehåller celler som avbildas under fluorescensmikroskopet förblir. Det här steget är nödvändigt eftersom faskontrast bilden täcker ett område som är mycket större än fluorescensbilden. Beskära bilden förenklar nästa steg.
  2. Segmentera enskilda celler genom att bearbeta faskontrast bilden med OUFTI28 -programvaran (kompletterande figur 3)
    1. Initiera OUFTI i MATLAB. Ladda den beskurna faskontrast bilden från föregående steg genom att klicka på laddnings fasen.
    2. Klicka på Arkiv att välja och namnge en spara plats för utdatafilen.
    3. Välj oberoende ramar under identifierings-och analys rubriken.
    4. Klicka på Läs in parametrar för att läsa in parametrar för cell identifiering. Exempel på parametrar är acceptabelt cellområde, cellbredd och cell delnings tröskel.
      Obs: alla dessa parametrar bör justeras för att maximera prestanda för de specifika cellstorlekar och bildkvalitet som används. Viktigt är att algoritmen parametern anges till subpixel för att möjliggöra exakt mätning av cell konturer.
    5. Klicka på den här ramen för att börja cellsegmentering. Cell konturerna visas över faskontrast bilden när processen är klar.
    6. Med hjälp av kontrollerna under avsnittet manuell , dela celler, lägga till celler eller förfina cell kon turer för att få konturer för celler som var felaktigt segmenterade under den automatiserade processen.
    7. Mata ut cell konturerna genom att klicka på Spara analys.
  3. Använd specialskriven programvara i MATLAB för att exakt överlagra de konturer som erhållits i föregående steg med enmolekylen lokaliseringar. Följande steg detaljerat stegen i programvaran.
    1. Välj manuellt 5 kontrollpunkts par i popup-fönstret genom att grovt uppskatta och klicka på positionen för cell polerna i samma fem celler i både enkel molekylens lokaliseringsdata och cell kon turer, genererade i föregående steg. Positionen för cell Polen kan uppskattas grovt genom att mentalt dra ett konvex skrov runt enmolekylen lokaliseringar som hör till en cell och välja den punkt av högsta krökning (kompletterande figur 4).
    2. Generera en 2D affine omvandling funktion med hjälp av cp2tform funktion i MATLAB och använda den för att generera en grov overlay av cell konturerna och Single-molekyl lokaliseringar.
    3. Ta bort celler som innehåller färre än 10 lokaliseringar och ta bort celler som är placerade delvis utanför visningsfältet. Ta bort eventuella ytterligare oönskade celler i popup-fönstret manuellt genom att klicka i cell dispositionen (kompletterande figur 5).
    4. Använd centrum av massan för alla kvarvarande cell konturer och enmolekylen lokaliseringar inom dem att bilda en större uppsättning kontrollpunkt par, re-Compute 2D omvandling funktion, och använda den för att generera en slutlig överlagring av cell konturerna och enmolekylen lokaliseringar.
    5. Tilldela lokaliseringar som finns inom gränsen för en cell kontur till cellen. Ignorera alla lokaliseringar som inte finns i någon cell disposition (figur 2A, kompletterande figur 6).

6. Single-molekyl spårning

Obs: följande avsnitt kompletteras med specialskriven programvara i MATLAB. I det här avsnittet beskrivs de steg som programvaran utför.

  1. För lokaliseringar som tilldelats samma cell och i efterföljande kamera bildrutor beräknar du det euklidiska avståndet mellan lokaliseringarna. Om avståndet mellan lokaliseringarna är under ett tröskelvärde på 2,5 μm, länka lokaliseringar genom att tilldela dem till samma enda molekyl bana.
    Obs: det är viktigt att bara överväga lokaliseringar i en enda cell, så att lokaliseringar i angränsande celler som råkar uppfylla de rumsliga och temporala tröskel kraven inte är länkade. Tröskelvärdet på 2,5 μm valdes som maximalt avstånd en mycket snabb molekyl (30 μm2/s) kunde färdas i längden av exponeringstiden (0,025 s) plus en 20% buffert.
  2. Ignorera banor kortare än 4 lokaliseringar. Om två eller fler lokaliseringar (d.v.s. två eller fler fluorescerande sändare) samtidigt finns i en cell, kassera de tillhörande trajectorier. Om du ställer in spårlängden minimum till 4 lokaliseringar kan flera avståndsmätningar i genomsnitt ge en mer exakt uppskattning av diffusions koefficienterna.
  3. Beräkna medelvärdet av kvadratförskjutningen (MSD) för en given bana genom att:
    Equation 11
    där n är det totala antalet lokaliseringar i bana och xn är molekylens position vid tidpunkten n.
  4. Beräkna den skenbara diffusions koefficient, D * genom
    Equation 22
    där m = 2 eller 3 är dimensionaliteten för mätningen och Δt är kamerans exponeringstid.
    Anmärkning: ett typiskt experiment kommer att producera ~ 5000-100000 banor totalt, vilket resulterar i en skenbar diffusion koefficienten fördelning med att många räknas.

7. Monte-Carlo-simulering av Brownsk rörelse i en begränsad volym

Anm.: skapa bibliotek med simulerade skenbara fördelningskoefficienter genom att utföra Monte Carlo-simuleringar av Brownsk rörelse som är begränsad till cylindriska volymer med 64 värden i intervallet 0,05 – 20 μm2/s som indataparametrar (programvara tillgänglig från författarna på begäran). Denna serie valdes för att täcka utbudet av tidigare uppskattade diffusions koefficienter av fluorescerande (fusion) proteiner i bakterier. 64 diffusion koefficienter används för att prova detta intervall tillräckligt. Detta avsnitt utförs med hjälp av egenskriven programvara i MATLAB och beskriver de steg som programvaran tar automatiskt. Den stavformade Y. enterocolitica celler som används här är approximeras med en cylindrisk volym av längd l = 5 μm och diameter d = 0,8 μm.

  1. Initiera enskilda banor på en slumpmässig position i den cylindriska volymen, och simulera deras slumpmässiga (dvs., Brownian) diffusion steg med hjälp av ett tidsintervall på 100 NS (tidsintervall bör vara mycket kortare än kamerans exponeringstid för att möjliggöra tillräcklig provtagningen av positionen under en kamera ram). Prov varje förskjutnings steg för en input D från motsvarande Gaussiska fördelningsfunktion genom omplaceringen av EQN. 2 och Lägg till den i föregående position:
    Equation 33
    där randn -funktionen i MATLAB samplas ett slumptal från en normalfördelning. Om ett steg gör att molekylen förskjuts utanför cylindervolymen, reflekterar molekylen tillbaka inuti cylindern i slumpmässig vinkel.
  2. För varje tidsintervall, generera en DHPSF bild som motsvarar den momentana x, y, z position den simulerade EMITTER.
    1. För att matcha experimentella förhållanden, simulera bilder som innehåller 1 000 fotoner per lokalisering, med en laser bakgrund på 13 fotoner per pixel, och Poisson-brus. Dessutom, Lägg till mörk förskjutning av ~ 50 fotoner per pixel och Gaussian Läs brus (σ ~ 1,5 fotoner), i överensstämmelse med experimentella mätningar kamerakalibrering. Slutligen multiplicera bilden med experimentellt uppmätta pixel beroende vinst av sCMOS kameran för att få bilden i enheter av detektor räknas.
      Anmärkning: efter dessa manipulationer, signal-brus-förhållandet av den slutliga bilden är ~ 2.
    2. Generera rörelsesuddiga bilder som återspeglar molekylernas förändrade position genom att summera 50 DHPSF-bilder simuleras under den exponeringstid som används vid experimentellt datainhämtning. För att begränsa beräkningskostnaderna, valdes endast 50 regelbundet samplade positioner för att generera en bild (i stället för alla 250 000-positioner som samplades under en 0,025 s exponeringstid med ett samplingsintervall på 100 NS).
      Anmärkning: längden (antal bildrutor) av simulerade banor bör motsvara den genomsnittliga längden på experimentella banor. I det här fallet är antalet bildrutor per bana 6.
  3. Generera 5 000 banor för var och en av de 64 simulerade indata diffusion koefficienterna.
  4. Analysera simulerade kamera bildrutor enligt beskrivningen i avsnittet data behandling .
  5. Länka lokaliseringar till trajectorier som beskrivs i avsnittet enkel molekyl spårning .
  6. Interpolera den kumulativa fördelningsfunktionen (CDF) för varje simulerad distribution med B-spline-interpolation av order 25. Interpolerade distributioner är nödvändiga så att de kan efterfrågas på godtyckliga punkter.
  7. Interpolera de resulterande B-spline-kurvorna längs d-axeln (d är den sanna oinskränkte diffusionskoefficienten som styr rörelsen hos de simulerade Sänderna) med funktionen scatteredinterpolant i MATLAB (specificera " naturliga "interpolationsmetoden"). Detta ger en kontinuerlig 2D-funktion från vilken en skenbar Fördelningskoefficient fördelning motsvarande en sann diffusion koefficient värde i intervallet 0,05-20 μm2/s kan efterfrågas.

8. experimentell, skenbar diffusion-Fördelningskoefficient

Anmärkning: Fit experimentellt uppmätta distributioner av skenbara diffusion koefficienter med linjära kombinationer av de simulerade fördelningar som genereras i föregående avsnitt (Monte-Carlo simulering av Brownian rörelse i en begränsad volym). Detta avsnitt utförs med hjälp av egenskriven programvara i MATLAB och beskriver de steg som programvaran tar automatiskt. För mer information och exempel på ansökan, vänligen se Rocha et al.29

  1. Utför en begränsad linjär passning (med funktionen lsqlin i MATLAB) av den experimentella CDF med hjälp av en periodvis samplad matris med simulerade CDFS från biblioteket som skapades i avsnitt 7. Resultatet av detta steg är en parameter vektor som innehåller diffusions koefficienter och befolknings fraktioner av vanliga diffusiva stater i experimentell distribution.
  2. Kombinera diffusions stater med diffusion koefficienten värden inom 20% av varandra i en enda diffus tillstånd av vikt genomsnitt baserat på relativ befolknings fraktion. Detta är startparameter vektorn.
    Anmärkning: för att minska modellens komplexitet, de diffusiva stater med diffusion koefficienter under 0,5 μm2/s kan hållas konstant under alla följande steg.
  3. Skapa matriser av Trial passande parametervektorer med olika antal diffusiva stater, allt från en enda diffusiv tillstånd till en användardefinierad maximalt antal stater.
    1. Med hjälp av startparameter vektorn, kombinera angränsande diffusions stater genom viktat medelvärde och dela diffusions stater i två stater med lika befolknings fraktioner och diffusion koefficienter 20% över och under det ursprungliga värdet. Upprepa för alla tillstånds kombinationer och delningsmöjligheter.
  4. Använd varje utvärderings parameter vektor för att initiera en icke-linjär minst kvadratisk montering av 5 separata delmängder av data (med fmincon -funktionen i MATLAB). Bestäm kvaliteten på passformen genom att hitta den resterande summan av kvadraterna mellan passformen och fördelningen som motsvarar de återstående deluppsättningarna (data korsvalidering).
  5. Använd den genomsnittliga restsumman av kvadrater av 5 separata beslag för varje prov vektor som den totala kvaliteten på passformen, bestämma prov vektorn med bästa kvalitet av passform för varje antal diffusiva stater.
  6. Bestäm det optimala antalet stater genom att identifiera prov vektorn för vilken tillägg av ett ytterligare tillstånd inte resulterar i minst 5% förbättring av kvaliteten på passformen.
  7. Använd den här test vektorn för att initiera den icke-linjära minsta kvadratanpassningen av den fullständiga datauppsättningen.
  8. Uppskattnings fel för de enskilda parametrarna genom att omsampling av data genom att bootstrapping och återmonteras med samma test vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under de experimentella förhållanden som beskrivs här (20 000 ramar, bana längd minst 4 lokaliseringar) och beroende på uttrycket nivåer av fluorescerande märkta fusions proteiner, cirka 200-3000 lokaliseringar ger 10-150 banor kan genereras per cell (figur 2A, b). Ett stort antal banor är nödvändiga för att producera en väl samplad fördelning av skenbara diffusions koefficienter. Storleken på FOV samlas här är ~ 55 x 55 μm, med 10 FOV samlas per experiment. Därför, för att få > 5000 banor per experiment varje FOV bör innehålla minst 50 celler. Helst bör cellpopulationen göras så tät som möjligt, men utan att ha celler vidrör varandra. Om CELLTÄTHETEN är för hög, då närvaron av beröring eller överlappande celler gör det svårt att segmentera dem framgångsrikt med OUFTI (28), som beskrivs i data efter bearbetning. Dålig segmentering kan leda till lokaliseringar och banor tilldelas felaktigt mellan celler.

Här presenterar vi uppenbara diffusion koefficienten data på Y. enterocolitica typ 3 sekretion protein YscQ, som vi N-terminally märkt med fluorescerande protein eyfp. YscQ är en strukturell del av en membran-Spanning molekylär maskin, kallas injectisome. Den injectisome består av över 20 olika proteiner, av vilka många är närvarande i flera exemplar nummer. Typ 3 sekretion injectisomes är i stort sett utnyttjas av patogena gramnegativa bakterier att leverera virulent effektor proteiner direkt i värd cell under infektion. YscQ dynamiskt binder och unbinder till och från den cytosoliska sidan av injectisome. Som ett resultat, YscQ finns också fritt spridas i Cytosol. Genom att tillämpa datainsamling, bearbetning och analysprotokoll som beskrivs ovan, vi fastställt att obunden YscQ existerar i minst 3 distinkta diffusiva stater (figur 3). Dessa 3 diffusiva stater motsvarar olika homo-och hetero-oligomeriska komplex av YscQ och andra typ 3-sekretionproteiner23.

Figure 1
Bild 1: optisk diagram över Mikroskop vägar. Mikroskopet har en väg för detektion av fluorescens signal och en separat väg för att ta en faskontrast bild. En motoriserad "flip-Mirror" används för att växla mellan vägarna. Kameran detektorer, excitation lasrar, LED, och "flip-Mirror" styrs på distans av datorn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: enmolekyllokaliseringar och banor. (A). 3D enmolekyl lokaliseringar av eYFP-YscQ i en Y. enterocolitica cell som erhållits i olika ramar (1 766 lokaliseringar). Lokaliseringarna är överlagda på en faskontrast bild av cellen. Den gröna linjen visar cell dispositionen baserat på faskontrast bilden. B). 3D-enkelmolekylbanor av eyfp-YscQ som erhålls från lokaliseringarna som visas i panel a (142 banor). Olikt färgar föreställer olik singel-molekylen Trajectories. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: skenbar diffusion koefficient fördelning av eYFP-YscQ i Y. enterocolitica. Den skenbara diffusion koefficienten fördelning för eYFP-YscQ i Y. enterocolitca var bäst passar med 3 diffusiva stater. Observera att funktionen för sannolikhets täthet (PDF) visas här, medan data anpassningen gjordes genom att montera den kumulativa fördelningsfunktionen (CDF, experimentell, skenbar Fördelningskoefficient fördelning). Figur anpassad från Rocha et al23. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. Mikroskop kontroll GUI. Mikroskopet GUI styr mikropositioneraren av scenen, excitation lasrar, LED, och kameror för fluorescens emission. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 2. Lätt-DHPSF GUI. Easy-dhpsf programvara används för att extrahera Single-molekyl lokaliseringar från dhpsf signalerna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande diagram 3. Oufti segmentering. Open Source-programvaran OUFTI28 används för att göra cellerna. Här visas resultatet av cellsegmenteringen i grönt. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 4 . Val av kontrollpunkter. Fem punkter markeras i både cell dispositionsdata och lokaliseringsdata. Cell polerna används som referenspunkter. Dessa punkter används för att omvandla data så att cell konturerna och lokaliseringar är korrekt överlagras. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 5 . Ta bort oönskade celler. När cellen är överlagrad raderas oönskade celler manuellt. Celler med ovanligt låga/höga mängder lokaliseringar bör tas bort, samt alla celler som är vid kanten av FOV. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 6 . Avslutande överlagring av cell kon turer och lokaliseringar. Efter radering av oönskade celler, cell konturer och Single-molekyl lokaliseringar är fint omvandlas för att få den slutliga overlay. Lokaliseringar utanför cell konturerna tas bort. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande MOV. 1: rådata för en enmolekyl-bana. Exempel på detektion av eYFP-YscQ på sCMOS-kameran. I bildruta 1 finns ingen fluorescens-signal. I ramar 2-10 detekteras fluorescens från en enda molekyl. I varje efterföljande ram, position och orientering av DHPSF förändringar, vilket indikerar diffusion av denna molekyl. Slutligen, i ram 11, finns det återigen en frånvaro i fluorescens signal, som anger slutet av banan. Varje pixel är 108 x 108 nm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande MOV. 2: rådata för en missad enmolekyl-bana. Ramar 1-3 visar fluorescenssignalen för en enskild sändare. Men ramar 4-6 visar närvaron av två överlappande DHPSFs, vilket indikerar närvaron av två sändare i nära anslutning. I sådana fall kan de enskilda DHPSFs inte korrekt passa på grund av deras överlappning. Även om båda DHPSFs framgångsrikt passar, någon bana som observerats som innehåller dessa lokaliseringar skulle kasseras. Två eller flera lokaliseringar i samma cell kan leda till felaktiga tilldelningar av lokaliseringar till en viss bana. Varje pixel är 108 x 108 nm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En kritisk faktor för en framgångsrik tillämpning av det presenterade protokollet är att säkerställa att enmolekylens signaler är väl åtskilda från varandra (dvs. de måste vara glesa i rymden och i tid (kompletterande MOV. 1)). Om det finns mer än en fluorescerande molekyl i en cell på samma gång, kan lokaliseringen felaktigt tilldelas en annan molekylers bana. Detta kallas det länkade problemet30. Experimentella förhållanden, såsom protein uttrycks nivåer och excitation laser intensitet kan väljas för att undvika att länka problemet. Man bör dock vara noga med att få protein uttrycks nivåer av vildtyp för att säkerställa representativa resultat. Här använde vi alleliska ersättningar under kontroll av de infödda initiativtagarna istället för kemiskt inducerbara uttryck, för att säkerställa infödda uttrycks nivåer av de märkta proteiner. Sålunda, excitation laser intensitet (för eYFP blinkande) eller aktiveringen laserintensitet (för foto-activatable fluorescerande sonder) kan användas för att kontrollera koncentrationen av aktiva utsläppskällor i tid. Alternativt, när kemisk färgmärkning används tillsammans med Halo och Snap Taggar31,32, då färgämnes koncentrationen kan reduceras tills fluorescerande signaler är glesa nog att spåra enstaka molekyler33. Det protokoll som presenteras här eliminerar ytterligare problemet genom att kasta alla banor för vilka två eller flera lokaliseringar samtidigt finns i samma cell (kompletterande MOV. 2). Således, om enkel molekyl signaler är för täta, en stor mängd data kasseras automatiskt under bearbetningen. Under magnetiseringen villkor som används här (λex = 514 Nm vid 350 W/cm2), fick vi 10-150 banor per bakteriell cell när förvärva 20 000 ramar under loppet av 8 min. Å andra sidan, om experimentella förhållanden väljs så att enmolekylen signaler är glesa, då datainsamling genomströmningen kan vara låg, så att få ett tillräckligt stort antal enmolekyl banor skulle kräva avbildning ytterligare celler i ytterligare fält-of-view. Förvärva ett stort antal banor är fördelaktigt, eftersom felen i de monterade parametrarna (diffusions koefficienter och befolknings fraktioner) minska som antalet banor som analyseras öka29.

Att uppnå ett stort antal enmolekylen banor kräver hög data-förvärv genomströmning. Som en wide-fält teknik, Single-molekylen lokalisering mikroskopi förvärvar data för varje cell i FOV samtidigt, och forskare har börjat dra nytta av nya sCMOS detektorer som ger stora FoVs26,34, 35. emellertid, excitation laser befogenheter flera watt krävs för att uppnå enhetliga intensiteter tillräcklig för enkel molekyl lokalisering mikroskopi under sådana stora FoVs. Sådana laser krafter kan vara över skadetröskeln för kommersiellt tillgängliga objektivlinser. Lenslet matriser används för att göra excitation laser intensiteter enhetliga i stora FOVs kan kunna kringgå detta nummer34. Dessutom blir optiska avvikelser uttalade vid bildtagning långt bort från den optiska axeln. Som ett resultat, kan formen på DHPSF bli alltför snedvriden för att framgångsrikt passa av en dubbel Gaussian modell som används i Easy DHPSF. När Imaging i en ultra FOV, mer sofistikerade rumsligt varierande polyesterstapelfibrer modeller krävs36. För att undvika dessa komplierande faktorer, de uppgifter som presenteras här förvärvades i en relativt liten FOV (diameter = 55 μm) och data från 10 FOVs poolades för att få mer än 75 000 enmolekyl Trajectories.

Montering av experimentellt uppmätta skenbara diffusion koefficienter distributioner med simulerade distributioner kräver realistisk simulering av experimentella data. Statiska och dynamiska lokaliserings fel i kamerabaseringsbaserad spårning kan påverka kvaliteten på mätningen11,13. Statiska lokaliserings fel beror på det ändliga antalet fotoner som samlats per fluorescenssändare, vilket resulterar i en oprecisa polyesterstapelfibrer form och därmed resultera i Single-molekyl lokaliseringar av begränsad precision2,37, 38. dynamiska lokaliserings fel uppstår på grund av rörliga sändare som genererar suddiga psfs39. När en algoritm används för att passa formen på polyesterstapelfibrer, rörelse-suddiga bilder ger lokaliseringar med begränsad noggrannhet och precision39. I svåra fall av snabb molekyl rörelse kan bilden vara för förvrängd för att passa, vilket resulterar i en misslyckad passform och därmed ingen inspelad lokalisering. Simulera rumsligt suddiga PSFs med realistiska signal-brus-förhållanden och lokalisera med samma passande algoritm som experimentella data konton för både statiska och dynamiska lokaliserings fel. För det andra kan snabbt diffusa molekyler begränsas starkt till små volymer, såsom Cytosol i en bakteriecell. Som en följd av detta är de skenbara diffusions koefficienterna mindre, i genomsnitt, än de som förväntades för oinskränkt rörelse. Rumslig inneslutning resulterar i en total vänsterförskjutning av fördelningen mot mindre diffusiva värden. Viktigare är att formen på distributionen inte längre är uttryckbar som en analytisk funktion. Genom att uttryckligen redogöra för statiska och dynamiska lokaliserings fel på grund av rörelseoskärpa och instängningseffekter genom stokastiska simuleringar kan realistiska fördelningar erhållas23.

Den beskrivna diffusions analysen bygger på två viktiga antaganden om det dynamiska beteendet hos molekylerna i den biologiska miljön. Det förutsätter att diffusiva stater beskrivs av trånga Brownian rörelse och att de inte paliperidon på tidsskalan för en enda molekyl bana. Vi har experimentellt kontrollerat att antagandet av trånga Brownian rörelse är motiverat för gratis eYFP diffusion i Y. enterocolitica23. Dessa resultat är i samförstånd med ett antal studier på olika bakteriearter som har fastställt att rörelsen av cytosoliska proteiner, fusions proteiner och Biomolekylär komplex som är mindre än 30 Nm kan beskrivas med Brownian motion18, 40,41,42,43,44,45. Icke-specifika kollisioner av små fluorescerande märkta proteiner med andra cellulära komponenter kan bromsa diffusions hastigheter,45,46 men inte leda till avvikelser från Brownian diffusion. Däremot kan specifik interaktion med besläktat bindande partners producera en förändring i diffusion koefficient, som nyligen visats för Y. enterocolitica typ 3 sekretion protein yscq23. Giltigheten av det andra antagandet är svårt att bedöma, särskilt för system för vilka varken diffusiva stater eller bindningskinetik är kända. Situationen är ytterligare komplicerad eftersom alla oligomerisering stater och bindande kinetik mätt in vitro, kanske inte återspeglar de strukturer och dynamik som sker in vivo. En nyligen teoretisk studie baserad på den analysram som presenteras här tyder på att det kan vara möjligt att extrahera staten byta kinetik utöver de diffusions koefficienter och befolknings fraktioner29.

Sammanfattningsvis presenterar vi ett integrerat protokoll för att lösa de diffusiva tillstånden av fluorescerande märkta molekyler baserade på enmolekyl-banor mätta i levande bakterieceller. Som presenteras här, protokollet tillämpas på 3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi med hjälp av dubbel-Helix polyesterstapelfibrer för avbildning i Y. enterocolitica, en bakteriell patogen. Men med bara några ändringar, kan protokollet tillämpas på alla typer av 2D eller 3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi och prov geometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Alecia Achimovich och ting Yan för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Ed Hall, Senior personal forskare i Advanced Research Computing Services Group vid University of Virginia, för hjälp med att inrätta optimerings rutiner som används i detta arbete. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av University of Virginia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Biokemi fysikalisk kemi organismer bakterier kemi och material oorganisk organisk och fysikalisk kemi biovetenskap biovetenskap (allmän) matematisk och datavetenskap numerisk analys super-resolution Single-molekyl fluorescens spårning diffusion Live-cell
Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rocha, J. M., Gahlmann, A.… More

Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter