Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Summary

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Abstract

La microscopía de localización de una sola molécula sondea la posición y los movimientos de moléculas individuales en células vivas con decenas de nanómetros de resolución espacial y temporal de milisegundos. Estas capacidades hacen que la microscopía de localización de una sola molécula sea ideal para estudiar las funciones biológicas a nivel molecular en entornos fisiológicamente relevantes. Aquí, demostramos un protocolo integrado para la adquisición y procesamiento / análisis de datos de seguimiento de una sola molécula para extraer los diferentes estados difusivos que una proteína de interés puede exhibir. Esta información se puede utilizar para cuantificar la formación de complejos moleculares en células vivas. Proporcionamos una descripción detallada de un experimento de localización 3D de una sola molécula basado en cámara, así como los siguientes pasos de procesamiento de datos que producen las trayectorias de moléculas individuales. Estas trayectorias se analizan utilizando un marco de análisis numérico para extraer los estados difusos prevalentes de las moléculas etiquetadas fluorescentes y la abundancia relativa de estos estados. El marco de análisis se basa en simulaciones estocásticas de trayectorias de difusión Browniana intracelular que están limitadas espacialmente por una geometría celular arbitraria. Sobre la base de las trayectorias simuladas, las imágenes de una sola molécula en bruto se generan y analizan de la misma manera que las imágenes experimentales. De esta manera, las limitaciones de precisión y precisión experimentales, que son difíciles de calibrar experimentalmente, se incorporan explícitamente al flujo de trabajo de análisis. El coeficiente de difusión y las fracciones de población relativa de los estados difusos prevalentes se determinan ajustando las distribuciones de los valores experimentales mediante combinaciones lineales de distribuciones simuladas. Demostramos la utilidad de nuestro protocolo resolviendo los estados difusivos de una proteína que exhibe diferentes estados difusivos al formar complejos homo y hetero-oligoméricos en el citosol de un patógeno bacteriano.

Introduction

El examen del comportamiento difuso de las biomoléculas proporciona información sobre sus funciones biológicas. Las técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia se han convertido en herramientas valiosas para observar biomoléculas en su entorno celular nativo. La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) y la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)¹ proporcionan comportamientos difusivos promediados por el conjunto. Por el contrario, la microscopía de localización de una sola molécula permite la observación de moléculas individuales etiquetadas fluorescentes con alta resolución espacial y temporal^2,3,4. Observar moléculas individuales es ventajoso ya que puede existir una proteína de interés en diferentes estados difusivos. Por ejemplo, dos estados difusivos fácilmente distinguibles surgen cuando un regulador transcripcional, como El CueR en Escherichia coli, se difunde libremente en el citosol o se une a una secuencia de ADN y se inmoviliza en la escala temporal de la medición⁵ . El seguimiento de una sola molécula proporciona una herramienta para observar estos diferentes estados directamente, y no se requieren análisis sofisticados para resolverlos. Sin embargo, se vuelve más difícil resolver múltiples estados difusos y sus fracciones de población en casos en los que sus tasas difusas son más similares. Por ejemplo, debido a la dependencia del tamaño del coeficiente de difusión, los diferentes estados de oligomerización de una proteína se manifiestan como diferentes estados difusores^{6,7,8,9 , 10}. Estos casos requieren un enfoque integrado en términos de adquisición, procesamiento y análisis de datos.

Un factor crítico que influye en las tasas difusas de las moléculas citosólicas es el efecto del confinamiento por el límite celular. Las restricciones impuestas al movimiento molecular por un límite de células bacterianas hacen que la tasa de difusión medida de una moléculacitos parezca más lenta que si el mismo movimiento hubiera ocurrido en un espacio no confinado. Para moléculas que difuminan muy lentamente, el efecto del confinamiento celular es insignificante debido a la falta de colisiones con el límite. En tales casos, puede ser posible resolver con precisión estados difusos ajustando las distribuciones de los desplazamientos moleculares, r,o coeficientes de difusión aparentes, D*,utilizando modelos analíticos basados en las ecuaciones para el movimiento Browniano ( difusión aleatoria)^11,12,13. Sin embargo, para la rápida difusión de moléculas citosólicas, las distribuciones experimentales ya no se asemejan a las obtenidas para el movimiento Browniano no confinado debido a colisiones de moléculas difusoras con los límites celulares. Los efectos de confinamiento deben tenerse en cuenta para determinar con precisión los coeficientes de difusión no confinados de las moléculas etiquetadas fluorescentemente. Recientemente se han desarrollado varios enfoques para tener en cuenta los efectos de confinamiento (semi-)analíticamente ^5,14,15,16 o numéricamente a través de simulaciones de Monte Carlo de Difusión Browniana^{6,10,16,17,18,19}.

Aquí, proporcionamos un protocolo integrado para recopilar y analizar datos de microscopía de localización de una sola molécula con un enfoque particular en el seguimiento de una sola molécula. El objetivo final del protocolo es resolver estados difusos de proteínas citosólicas etiquetadas fluorescentemente en el interior, en este caso, células bacterianas en forma de varilla. Nuestro trabajo se basa en un protocolo anterior para el seguimiento de una sola molécula, en el que se demostró que existe una polimerasa de ADN, PolI, en un estado unido y sin enlazar el ADN mediante el análisis de difusión^20. Aquí, ampliamos el análisis de seguimiento de una sola molécula a mediciones 3D y realizamos simulaciones computacionales más realistas para resolver y cuantificar múltiples estados difusivos presentes simultáneamente en las células. Los datos se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia de superresolución 3D construido en casa que es capaz de determinar la posición 3D de los emisores fluorescentes mediante imágenes con la función de difusión por puntos de doble hélice (DHPSF)^21,22. Las imágenes de una sola molécula en bruto se procesan utilizando software escrito a medida para extraer las localizaciones 3D de una sola molécula, que luego se combinan en trayectorias de una sola molécula. Miles de trayectorias se agrupan para generar distribuciones de coeficientes de difusión aparentes. En un último paso, las distribuciones experimentales se ajustan a las distribuciones generadas numéricamente obtenidas a través de simulaciones de Montecarlo de movimiento Browniano en un volumen confinado. Aplicamos este protocolo para resolver los estados difusivos de la proteína del sistema de secreción Tipo 3 YscQ en Yersinia enterocoliticaviva. Debido a su naturaleza modular, nuestro protocolo es generalmente aplicable a cualquier tipo de experimento de seguimiento de una sola molécula o de una sola partícula en geometrías celulares arbitrarias.

Protocol

1. Calibración de la función de dispersión por puntos de doble hélice NOTA: Las imágenes descritas en esta y las siguientes secciones se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia invertida construido a medida, como se describe en Rocha et al.23. El mismo procedimiento es aplicable a diferentes implementaciones de microscopio diseñadas para la localización de una sola molécula y la microscopía de seguimiento2,<sup clas…

Representative Results

En las condiciones experimentales descritas aquí (20.000 fotogramas, longitud de trayectoria mínima de 4 localizaciones) y dependiendo de los niveles de expresión de las proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente, aproximadamente 200-3.000 localizaciones que producen 10-150 trayectorias se pueden generar por celda(Figura 2a,b). Se hace necesario un gran número de trayectorias para producir una distribución bien muestreada de los…

Discussion

Un factor crítico para la aplicación exitosa del protocolo presentado es asegurar que las señales de una sola molécula estén bien separadas entre sí (es decir, deben ser escasas en el espacio y en el tiempo(Movimiento Suplementario 1)). Si hay más de una molécula de fluorescencia en una célula al mismo tiempo, entonces la localización podría asignarse incorrectamente a la trayectoria de otras moléculas. Esto se conoce como el problema de vinculación³⁰. Se pueden elegi…

Materials

2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.