3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi utnyttjas för att söka de rumsliga positioner och rörelsebanor av överföras märkta proteiner i levande bakterieceller. Den experimentella och dataanalys protokoll som beskrivs häri avgör de utbredda diffusiva beteenden av cytosoliska proteiner baserade på poolade enda molekyl Trajectories.
Single-molekylen lokalisering mikroskopi sonder ställning och rörelser enskilda molekyler i levande celler med tiotals nanometer rumsliga och millisekund temporal upplösning. Dessa funktioner gör Single-molekylen lokalisering mikroskopi idealisk för att studera molekylär nivå biologiska funktioner i fysiologiskt relevanta miljöer. Här visar vi ett integrerat protokoll för både förvärv och bearbetning/analys av Single-molekyl spårningsdata för att extrahera de olika diffusiva staterna ett protein av intresse kan uppvisa. Denna information kan användas för att kvantifiera molekylär komplex formation i levande celler. Vi ger en detaljerad beskrivning av en Kamerabaserad 3D Single-molekyl lokalisering experiment, samt de efterföljande databehandling steg som ger banor av enskilda molekyler. Dessa banor analyseras sedan med hjälp av en numerisk analysram för att extrahera de utbredda diffusiva staterna av fluorescerande märkta molekyler och den relativa överflöd av dessa stater. Analysramen är baserad på stokastiska simuleringar av intracellulära Brownian diffusion banor som är rumsligt begränsas av en godtycklig cell geometri. Baserat på de simulerade banor, RAW Single-molekylen bilder genereras och analyseras på samma sätt som experimentella bilder. På så sätt införlivas experimentella precisions-och noggrannhets begränsningar, som är svåra att kalibrera experimentellt, uttryckligen i analys arbetsflödet. Diffusion koefficienten och relativa befolknings fraktioner av de förhärskande diffusiva staterna bestäms genom att montera distributioner av experimentella värden med hjälp av linjära kombinationer av simulerade distributioner. Vi visar nyttan av vårt protokoll genom att lösa de diffusiva staterna av ett protein som uppvisar olika diffusiva stater på att bilda homo-och hetero-oligomerska komplex i cytosolen av en bakteriell patogen.
Att undersöka de diffusiva beteendet hos biomolekyler ger insikt i deras biologiska funktioner. Fluorescensmikroskopi-baserade tekniker har blivit värdefulla verktyg för observation av biomolekyler i sin naturliga cell miljö. Fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) och fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)1 ger Ensemble-genomsnitt diffusiva beteenden. Omvänt, Single-molekylen lokalisering mikroskopi möjliggör observation av enskilda Fluorescent märkta molekyler med hög rumslig och temporala upplösning2,3,4. Observation enskilda molekyler är fördelaktigt eftersom ett protein av intresse kan existera i olika diffusiva stater. Till exempel, två lätt urskiljbara diffusiva stater uppstår när en transkriptionell regulator, såsom CueR i Escherichia coli, difsar fritt i Cytosol eller binder till en DNA-sekvens och blir immobiliserade på tidsskalan för mätning5 . Single-molekyl tracking ger ett verktyg för att observera dessa olika stater direkt, och sofistikerade analyser krävs inte för att lösa dem. Emellertid, det blir mer utmanande att lösa flera diffusiva stater och deras befolknings fraktioner i fall där deras diffusa priser är mer likartade. Till exempel på grund av storleksanpassa beroendet av diffusions koefficienten, påstår olik oligomerisering av ett protein manifesterar sig som olik diffusiv påstår6,7,8,9 , 10. sådana fall kräver ett integrerat förhållningssätt när det gäller datainsamling, behandling och analys.
En kritisk faktor som påverkar diffusiva frekvenser av cytosoliska molekyler är effekten av instängdhet av cellgränsen. De restriktioner som ställs på molekylär rörelse av en bakteriecell gräns orsaka en cytosoliska molekyler uppmätta diffusionshastighet att visas långsammare än om samma rörelse hade inträffat i ett oinskränkt utrymme. För mycket långsamt diffusa molekyler, effekten av cellulära instängdhet är försumbar på grund av bristen på kollisioner med gränsen. I sådana fall kan det vara möjligt att korrekt lösa diffusions tillstånd genom att montera fördelningarna av molekylära förskjutningar, reller skenbara diffusions koefficienter, D *, med hjälp av analytiska modeller baserade på ekvationerna för Brownsk rörelse ( slumpmässig diffusion)11,12,13. Men för snabba diffusa cytosoliska molekyler, de experimentella distributioner inte längre likna de som erhållits för oinskränkt Brownsk rörelse på grund av kollisioner av diffuserande molekyler med cell gränser. Nedsättningseffekter måste redovisas för att exakt bestämma de oinskränkta diffusions koefficienterna för de fluorescerande molekyler som är märkta. Flera metoder har nyligen utvecklats för att ta hänsyn till instängning antingen (semi-) analytiskt 5,14,15,16 eller numeriskt genom Monte Carlo-simuleringar av Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.
Här ger vi ett integrerat protokoll för att samla in och analysera Single-molekylen lokalisering mikroskopi data med ett särskilt fokus på Single-molekyl spårning. Slutmålet med protokollet är att lösa diffusa tillstånd av fluorescerande märkta cytosoliska proteiner inuti, i detta fall, stavformade bakterieceller. Vårt arbete bygger på ett tidigare protokoll för Single-molekyl spårning, där en DNA-polymeras, PolI, visades att existera i en DNA-bunden och obunden stat genom diffusion analys20. Här expanderar vi Single-molekyl spårningsanalys till 3D mätningar och utföra mer realistiska beräknings simuleringar för att lösa och kvantifiera flera diffusiva stater samtidigt närvarande i celler. Datan är förvärvat användande en hem-bygget 3D toppen-beslutsamhet fluorescens Mikroskop vilken är skicklig av beslutande den 3D position av fluorescerande sändare vid tänkbar med det dubbel-Helix punkt-breda-funktion (dhpsf)21,22. RAW Single-molekylen bilder bearbetas med hjälp av skräddarsydda program för att extrahera 3D Single-molekyl lokaliseringar, som sedan kombineras till enmolekyl banor. Tusentals banor slås samman för att generera fördelningar av skenbara diffusions koefficienter. I ett sista steg är de experimentella distributionerna lämpade med numeriskt genererade fördelningar erhållna genom Monte-Carlo-simuleringar av Brownian-rörelse i en begränsad volym. Vi tillämpar detta protokoll för att lösa diffusiva stater av typ 3 sekretion system protein YscQ i levande yersinia enterocolitica. På grund av sin modulära natur, är vårt protokoll i allmänhet gäller för alla typer av Single-molekyl eller Single-partikel tracking experiment i godtyckliga cell geometrier.
En kritisk faktor för en framgångsrik tillämpning av det presenterade protokollet är att säkerställa att enmolekylens signaler är väl åtskilda från varandra (dvs. de måste vara glesa i rymden och i tid (kompletterande MOV. 1)). Om det finns mer än en fluorescerande molekyl i en cell på samma gång, kan lokaliseringen felaktigt tilldelas en annan molekylers bana. Detta kallas det länkade problemet30. Experimentella förhållanden, såsom protein uttrycks nivåer och e…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Alecia Achimovich och ting Yan för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Ed Hall, Senior personal forskare i Advanced Research Computing Services Group vid University of Virginia, för hjälp med att inrätta optimerings rutiner som används i detta arbete. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av University of Virginia.
2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |