Denne protokol beskriver brug af høj-specificitet ionbytning kromatografi med multi-vinkel lysspredning til en nøjagtig molar masse bestemmelse af proteiner, proteinkomplekser og peptider i en heterogen prøve. Denne metode er værdifuld for kvalitetsvurdering, såvel som for karakterisering af indfødte oligomerer, charge varianter og blandet protein prøver.
Ion-udveksling kromatografi med multi-vinkel lysspredning (IEX-MALS) er en kraftfuld metode til protein adskillelse og karakterisering. Kombinationen af høj-specificitet adskillelse teknik IEX med nøjagtige molar masse analysen opnået ved MALS tillader karakterisering af heterogene protein prøver, herunder blandinger af oligomere former eller protein populationer, selv med meget lignende kindtand masserne. Derfor IEX-MALS giver et ekstra niveau af protein karakterisering og er et supplement til den standard størrelse-udelukkelse kromatografi med multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS) teknik.
Her beskriver vi en protokol for en grundlæggende IEX-MALS eksperimentere og demonstrere denne metode på bovint serumalbumin (BSA). IEX adskiller BSA til oligomere former giver en molar masse analyse af MALS af hver enkelt formular. Optimering af et IEX-MALS eksperiment er også præsenteret og demonstreret på BSA, opnå fremragende adskillelse mellem BSA monomerer og større oligomerer. IEX-MALS er en værdifuld teknik for protein kvalitetsvurdering, da det giver både fine adskillelse og molar masse bestemmelse af flere protein arter, der findes i en prøve.
Kvantitative karakterisering af proteinprodukter er stadig mere afgørende som et middel til kvalitetskontrol (QC), begge til lovmæssige formål i den biofarmaceutiske industri og til at sikre pålidelighed og integritet af life science forskning1 , 2. som beskrevet på hjemmesiderne for protein net Protein produktion og rensning partnerskab i Europa (P4EU) og foreningen af ressourcer for biofysiske forskning i Europa og molekylær Biofysik i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs og https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, henholdsvis), protein QC skal karakterisere ikke kun renhed af det færdige produkt, men også sin oligomere tilstand, homogenitet, identitet, kropsbygning, struktur, posttranslationelle modifikationer og andre egenskaber3,4.
En af de mest almindelige QC karakterisering metoder er SEK-MALS. I denne metode, er en analytisk sek kolonne koblet til MALS og spektrofotometriske og Frugtkødets detektorer, gør det muligt for nøjagtige målinger af protein kindtand massen af hver top5. SEC-MALS bestemmer kindtand massen af de eluted tinder uafhængigt af eluering volumen og overvinder unøjagtigheden af analytiske SEC ved hjælp af kolonnen kalibrering. Tilføjelse af en dynamisk lys-spredning (DLS) modul tilføjer størrelse måling kapacitet tillader hydrodynamiske radius bestemmelse. I akademisk forskning, SEC-MALS bruges typisk til at bestemme den oligomere tilstand af et protein, sin kropsbygning, grad af renhed, sammenlægning og modificerede proteiner, såsom glykoproteiner eller lipid-solubilized Membranproteiner (bestemme den Molar masse protein og konjugat komponenterne individuelt)6,7,8.
I mange tilfælde, den endelige protein af en rensningsproces er ikke et godt-lagte molekylære arter men snarere omfatter nogle heterogenitet. Proteinerne i sådan en blanding kan varieres med hensyn til struktur (eksempelvis forskellige oligomere former), konformationer eller protein isoformer. Protein heterogenitet kan også være et resultat af mindre kemiske forskelle forårsaget af C-terminale lysin forarbejdning eller asparagin/glutamin deamination, fører til at opkræve variation9,10. Forskelle i posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering kan også føre til heterogene prøver med afgift variationer9. Disse forskellige typer af heterogenitet er afspejlet i det protein biofysiske egenskaber og kan påvirke stabilitet og biologiske aktivitet af target protein11.
Pålidelig kvalitet kontrol-assays af prøverne heterogene kræver et stærkt resolutive analytisk adskillelse teknik. Der er tilfælde hvor god adskillelse kan blive udfordret til at opnå med analytiske sek kolonner, på grund af deres begrænsede opløsning og adskillelse evner12, resulterer i mangelfuld sek-MALS analyse. Ved at kombinere en høj specificitet adskillelse teknik som IEX med MALS kan overvinde begrænsning af SEK-MALS i heterogene prøver og give en supplerende metode til protein karakterisering (tabel 1 i Amartely et al.12). I modsætning til SEC, som adskiller makromolekyler af deres hydrodynamiske størrelse13, adskiller IEX makromolekyler af deres overflade afgift14. Anion exchange (AIEX) og kationbytter (CIEX) matrixer binde opkrævet negativt og positivt varianter, henholdsvis. Med en fin adskillelse mellem protein populationer, der deler en forholdsvis tæt masse eller figur, bestemmer IEX-MALS held kindtand massen af hver enkelt protein stat i en blanding prøve12.
Her præsenterer vi en standardprotokol til at køre en IEX-MALS eksperiment for adskillelse og analyse af BSA oligomere former, der findes i den samme prøve. Valget af en IEX kolonne til et specifikt protein er vigtigt og diskuteres, samt af pH og konduktivitet betingelser af buffere. Analyse af IEX-MALS eksperimentelle data er også beskrevet trin for trin. Selv om adskillelse af BSA oligomerer er gode og tilstrækkelige i SEK-MALS, er BSA et godt eksempel at vise IEX-MALS kapaciteter og vise optimering af et eksperiment. Eksempler på dårlig adskillelse opnåede af SEK-MALS og korrekt adskillelse og aktiveret af IEX-MALS analyse er diskuteret i en tidligere undersøgelse12.
IEX-MALS er en kraftfuld metode til protein adskillelse og karakterisering, der giver mulighed for nøjagtig molar masse bestemmelse af rene proteiner samt fra heterogene prøver, kendetegner indfødte oligomerer, nonnative aggregater, kovalent og noncovalent komplekser, og conjugated proteiner. Et program bestående af en lineær gradient eller en serie af saltkoncentration trin kan opnå en god adskillelse mellem protein befolkninger og tillade korrekt analyse af hver enkelt top af MALS. Yderligere optimering ved at variere forskellige parametre, såsom gradient hældning (Se trin 3.4 i protokollen), kan udføres, hvis en bedre løsning er påkrævet. IEX-MALS kan være et værdifuldt protein kvalitetskontrol assay, da det giver en ekstra, kritisk niveau af protein karakterisering, supplement til andre metoder såsom sek-MALS.
Mens SEC-MALS er en standard og fælles teknik til protein molar masse beslutsomhed, kan den relativt lav opløsning af de standard analytiske sek kolonner begrænse nøjagtige molar masse målinger opnåede af MALS12. Nogle eksempler på begrænsningerne af SEK-MALS løsninger, der indeholder træk oligomerer, høje niveauer af sammenlægning, der ikke er fuldt adskilt fra monomer peak og heterogene befolkninger med lignende kindtand masserne, såsom modificerede proteiner.
IEX er en mere kompleks kromatografi metode til at designe og gennemføre end sek, men oplysningerne fra et IEX-MALS eksperiment kan supplere og undertiden blive endnu mere informative end sek-MALS analyse. IEX-MALS har med held karakteriseret antistof varianter, der deler de samme molar masse, oligomerer, der ikke er helt adskilt på SEK og korte peptider, som er vanskelige at analysere af SEC12,24. Makromolekylære assemblies, der er for store til at være adskilt af SEC, som fuld (indeholdende viral DNA) og Tom partikler af adeno-associeret virus (AAV), kan også løses ved IEX25 inden MALS analyse. Sammenlignet med sek, IEX tilbyder flere forskellige adskillelse kapaciteter14 , og det har fleksibiliteten tilpasse flere parametre for at øge peak opløsning, som buffer pH, typer af salt, typer og længde af kolonnen, og andre. I modsætning til sek, er der ingen begrænsning af lydstyrke for prøven injektion i IEX, og ethvert molekyle kan analyseres uafhængigt af dets størrelse (se tabel 1 i Amartely et al.12). Dette er en stor fordel ved IEX-MALS, hovedsagelig for prøver med et lavt LS intensitet, som meget lille proteiner eller fortyndet proteiner med en tendens til sammenlægning efter fusionen. Da analytiske IEX kolonner er mere stabile og har tendens til at frigive færre partikler end sek kolonner, IEX-MALS kræver meget korte ekvilibreringstid og LS signaler er stabiliseret meget hurtigt. Dette giver mulighed for kørsel af individuelle eksperimenter som beskrevet i denne protokol og standsning af Kør som påkrævet.
I modsætning til SEC, som normalt giver fine resultater med kun et enkelt eksperiment (ved hjælp af en kolonne med det rigtige fraktionering udvalg), IEX kan kræve flere eksperimenter for at opnå optimal opløsning af tuning parametrene til. I IEX-MALS eksperimenter, der udføres med en salt gradient, buffer ledningsevne, og dermed RI ændre dramatisk i tiden, med deraf følgende ændringer til RI-signal. Dette kræver en ekstra blank køres for hver IEX-MALS eksperiment og en analyse med baseline subtraktion (som beskrevet i trin 5.2 i protokollen) medmindre koncentrationen analysen er begrænset til UV detektion (kræver et forudgående kendskab til udryddelsen koefficienter for hver top). Analyse med baseline subtraktion er robust for lineære farveforløb, selvom der stadig kræves for succesfuld baseline subtraktion af salt trinvis programmer yderligere udvikling af metoden. Dn/dc værdier af hver top bør tilpasses de specifikke buffer ledningsevne på eluted peak (beregninger kan findes i litteraturen12). Hvis et protein elueres ved en NaCl koncentration lavere end 200 mM (som i eksemplet med BSA), denne justering er ubetydelig.
Den relativt store mængde af protein anvendes i IEX-MALS (som beskrevet i trin 2.3 i protokollen) i forhold til sek-MALS er vigtigt at overvinde den dramatiske ændring af RI signalet forårsaget af salt gradient og RI udsving på grund af mangelfuld opblanding af den gradient buffere. Hvis der kun UV detektion anvendes til måling af masse, kan mindre mængder anvendes. Mængden af protein til at injicere afhænger molar masse protein, homogenitet, renhed og UV extinction koefficient. Den nødvendige injicerede masse bør være højere for mindre proteiner og lavere for større proteiner (~ 1 mg for en 20 kDa protein og ~0.2 mg for en 150 kDa protein). Heterogene prøver kræver indsprøjtning af flere prøve da mængden, der er delt mellem flere befolkningsgrupper. Analytiske højtydende væskekromatografi (HPLC) kan kræve mindre materiale end et FPLC system.
For nylig, i-line analyse ved hjælp af MALS under rensning procedurer er blevet rapporteret. Sådan en real-time analyse er meget effektiv til påvisning af sammenlægning produkter, som opstår under rensningen og kan fjerne behovet for nogen yderligere analyse af protein efter rensning26. IEX chromatografi bruges ofte som et mellemliggende rensning skridt; således er kan kombinationen af forberedende IEX kolonner med MALS være nyttigt ikke kun som en analytisk karakterisering metode men også som en real-time analyse af omfattende rensning procedurer. Nonanalytical IEX kolonner er også stabil, med en lav grad af partikel bremsen, og derfor kan bruges med MALS. Andre adskillelse teknikker, såsom affinitet kromatografi eller hydrofobe exchange kromatografi, kan også kombineres med MALS når de udsættes for relativt ren prøver (for at undgå kontaminering af MALS og RI-detektorer). Dette forudsætter tilpasning og optimering af metoden til at opnå ikke blot god peak adskillelse, men også tilstrækkeligt rene LS og RI signaler for en vellykket MALS analyse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Center for anvendt strukturbiologi, Hebrew University) for hendes råd og samarbejder. Forfatterne også takke Madss Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for bistand og etablering af analysesystemet FPLC-MALS udnyttes i denne undersøgelse.
ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |